Summary
Aqui nós descrevemos os protocolos para aplicar cargas mecânicas definidas aos bezerros do rato e para monitorar as mudanças intramusculares concomitantes da pressão. Os sistemas experimentais que desenvolvemos podem ser úteis para investigar o mecanismo por trás dos efeitos benéficos do exercício físico e da massagem.
Abstract
A massagem é geralmente reconhecida para ser benéfico para aliviar a dor e inflamação. Embora os estudos precedentes relatem efeitos anti-inflammatory da massagem em músculos esqueletais, os mecanismos moleculars atrás são compreendidos mal. Nós desenvolvemos recentemente um dispositivo simples para aplicar a compressão cíclica local (LCC), que pode gerar ondas intramusculares da pressão com amplitudes de variação. Usando este dispositivo, Nós demonstramos que o LCC modula respostas inflamatórios de macrófagos in situ e alivia a atrofia do músculo imobilização-induzida. Aqui, nós descrevemos protocolos para a optimização e a aplicação de LCC como uma massagem-como a intervenção de encontro à inflamação imobilização-induzida e à atrofia de músculos esqueletais de hindmembros do rato. O protocolo que desenvolvemos pode ser útil para investigar o mecanismo subjacente aos efeitos benéficos do exercício físico e da massagem. Nosso sistema experimental fornece um protótipo da abordagem analítica para elucidar a regulação mecânica da homeostase muscular, embora mais desenvolvimento precise ser feito para estudos mais abrangentes.
Introduction
A massagem é geralmente reconhecida como benéfica tanto para o alívio da dor quanto para a melhora do desempenho físico entre atletas competitivos e não atletas iguais1,2. Na verdade, estudos anteriores mostraram que a massagem suprime a inflamação local3 e solicita a recuperação do dano muscular pós-exercício4,5. Os mecanismos moleculares subjacentes aos efeitos benéficos da massagem permanecem largamente desconhecidos.
Uma das dificuldades com a investigação mecanicista sobre massagem relaciona-se com a reprodutibilidade de técnicas experimentais pelas quais as intervenções de massagem são testadas. Em estudos prévios, os procedimentos experimentais que imitam a massagem envolvem principalmente a aplicação de intervenções físicas utilizando partes corporais dos praticantes, como palmas e dedos6,7,8. Isso faz com que seja difícil reproduzir precisamente sua magnitude, frequência, duração e modo.
Muitos dispositivos foram desenvolvidos para aplicar cargas mecânicas definidas aos tecidos-alvo. Por exemplo, Zeng et al. desenvolveram um sistema pneumático para o carregamento mecânico de comprimento-sábio para os membros posteriores do rato9 e Wang et al. desenvolveram um dispositivo Mecatrônico que pode aplicar cargas mecânicas de massagem como para os membros posteriores de ratos e coelhos com controle de feedback em tempo real10. Comparado a eles, o nosso sistema de compressão cíclica local (LCC) é muito mais simples, exigindo muito menos custo para a construção. No entanto, podemos reproduzir as alterações da pressão intramuscular que são geradas durante a contração muscular leve. Usando este dispositivo, Nós demonstramos com sucesso que as intervenções mecânicas massagem-como modulam a dinâmica fluida intersticial local e aliviam a atrofia imobilização-induzida do músculo11.
Aqui, descrevemos os detalhes do nosso dispositivo e do protocolo, que pode ajudar a explorar os mecanismos moleculares por trás dos efeitos positivos dos exercícios e massagens. Os esquemas do protocolo são apresentados como Figura complementar 1.
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Protocol
Todos os experimentos com animais foram conduzidos a aprovação do Comitê institucional de cuidados e uso de animais do centro nacional de reabilitação para pessoas com deficiência.
1. imobilização dos membros posteriores bilaterais do rato
Nota: camundongos machos C57BL/6 foram utilizados para experimentos com idade de 11-12 semanas após aclimatação por pelo menos 7 dias.
- Anestesiam adequadamente um rato utilizando pentobarbital sódico (50 mg/kg i.p.). Certifique-se de que os ratos não respondem a uma pitada do dedo do pé do membro traseiro.
Nota: conduza o procedimento da imobilização entre 10 a.m. e 7 p.m. para minimizar os efeitos possíveis na atividade de alimentação dos ratos. - Aplicar fitas cirúrgicas para os membros posteriores bilaterais do rato colocado em uma posição supina com as articulações do joelho estendido e articulações do tornozelo plantar-flexiado.
- Coloc um fio de alumínio (veja a tabela de materiais) no tronco no nível da espinha L4-5 e enrole o fio em uma configuração espiral em torno dos membros posteriores com as aberturas de 5 milímetros entre cada volta da camada espiral (Figura 1a). Certifique-se de não enrolar o fio muito firmemente e evitar perturbar o fluxo sanguíneo local.
- Para minimizar a possibilidade de escape da fiação, imobilize as junções ancas na posição da abdução 90 ° ajustando manualmente a configuração do fio de alumínio.
- Devolva os ratos às suas gaiolas originais. 3 h mais tarde, certifique-se de que eles se recuperam da anestesia e acesso a alimentos e água, como de costume.
- Casa 3-6 ratos imobilizados por gaiola como antes da imobilização.
2. medida da pressão intramuscular de músculos do gastrocnêmio do rato
Nota: vários pesos diferentes de unidades cilíndricas (36 g, 66 g e 200 g) foram testados nos experimentos de monitorização de pressão combinados com o LCC. Esta medida foi conduzida separadamente dos experimentos para analisar a inflamação e atrofia muscular (ver etapa 3-5 para mais detalhes) ou seja, os camundongos submetidos à medida de pressão não foram utilizados para análises histológicas.
- Como a medida da pressão envolve procedimentos mais invasivos (por exemplo, incisão cutânea e inserção da agulha) em comparação com a fiação do membro posterior e a LCC, use uma mistura de três agentes anestésicos (medetomidina 0,75 mg/kg, midazolam 4,0 mg/kg e butorfanol 5,0 mg/kg, i.p.). Certifique-se de que os ratos não respondem à pinça do dedo do pé posterior.
- Coloque o mouse em uma posição propensa, faça uma incisão de 2 mm com um bisturi na panturrilha posterior após a depilação com um barbeador elétrico e semi-esterilizando a superfície da pele com 70% de etanol-e algodão absorvente clorexidina embebido.
- Insira uma agulha de demora de 20 G no músculo gastrocnêmio em um ângulo obtse (150 ° – 170 °) para a superfície da pele.
- Usando a bainha plástica da agulha como um guia, coloc um sensor do telemeter da pressão sanguínea (veja a tabela de materiais) no mid-Belly do músculo do gastrocnêmio, e remova então a bainha do músculo.
- Depois de suturar a pele com 4-0 sutura de nylon, aplique LCC com vários pesos diferentes de unidades cilíndricas para o bezerro nos camundongos (ver passo 3 para mais detalhes), e monitorar a pressão intramuscular usando software para análise de sinais biológicos (ver tabela de Materiais).
- Devolva os ratos às suas gaiolas originais. 3 h mais tarde, certifique-se de que eles se recuperam de anestesia/analgesia e têm acesso a alimentos e água, como de costume.
3. compressão cíclica local (LCC) em bezerros do rato
- Com exceção da medida da pressão intramuscular e da eutanização (ou seja, luxação cervical), use pentobarbital sódico (50 mg/kg i.p.) para anestesia.
- Desengate o mouse da fiação do membro posterior e coloque-o em uma posição propensa com as articulações do joelho estendidas e as articulações do tornozelo flexiona plantar para que os bezerros enfrentou para cima. Não fixe os membros posteriores do rato no palco.
- Aplique o LCC ao bezerro movendo verticalmente uma unidade de peso cilíndrico (Figura 1b) coberta com uma almofada de almofada (Figura 1C) a 1 Hz por 30 min por dia, 7 dias.
- Após cada ataque do LCC diário, re-Wire os membros posteriores do rato.
4. análise imuno-histoquímica do gastrocnêmio
- Eutanizar o camundongo por luxação cervical anestesia/analgesia adequada por injeção intraperitoneal de uma mistura de três agentes anestésicos (medetomidina 0,75 mg/kg, midazolam 4,0 mg/kg e butorfanol 5,0 mg/kg).
- Após ter depilando a superfície da vitela do posterior, faça uma incisão da pele, e dissecar os músculos do gastrocnêmio separando do osso tibio-fibular usando uma tesoura cirúrgica e congele-os rapidamente em uma solução óptima do composto da temperatura do corte.
- Usando um criostat, prepare amostras da Cryo-seção de músculos do gastrocnêmio em corrediças de vidro. Guarde as amostras num congelador de-80 ° c até à análise.
- Tirar as amostras de secção de crio de gastrocnêmio para serem analisadas a partir do congelador e desidratá-las por secagem de ar à temperatura ambiente.
- Use uma caneta bloqueador de líquido para desenhar uma área que inclua todas as seções crio no slide. O círculo impedirá que as soluções fluam fora do slide.
- Evite secar as amostras colocando os slides em uma bandeja na qual um ambiente úmido é criado com um pano de papel embebido em água.
- Aplique 100 μL de tampão de bloqueio (solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo 0,25% de caseína, proteína portadora e azida de sódio a 0, 15 M) durante 30 min à temperatura ambiente.
- Enxágüe as lâminas duas vezes incubando com PBS-T (PBS contendo 0,1% de monolaurato de polioxietileno sorbitano (ver tabela de materiais) por 5 min.
- Aplique 100 μL de anticorpo primário diluído com PBS em cada amostra, cubra a bandeja com uma tampa e incubar durante a noite à temperatura ambiente.
- Lave 3 vezes com PBS-T (5 min para cada lavagem).
- Aplicar 100 μL de anticorpo secundário diluído com PBS em cada amostra e incubar durante 1 h à temperatura ambiente.
Nota: para a coloração de anti-laminina, use o anticorpo secundário 568-conjugated de Alexa fluor. Para anti-F4/80, anti-MCP-1 e anti-TNF-α, use o anticorpo secundário de Alexa fluor 568-ou 488-conjugados. - Lave 3 vezes com PBS-T (5 min para cada lavagem).
- Aplique 100 μL de solução de DAPI diluída com PBS-T em cada amostra e incubar durante 3 min à temperatura ambiente.
- Lave 3 vezes com PBS-T (5 min para cada).
- Monte as amostras com suporte de montagem e cubra-as com lamelas.
5. histo-Análise morfométrica de gastrocnêmio
- Coloc os slides da amostra em um microscópio de fluorescência (veja a tabela de materiais) e veja as amostras usando um objetivo 20 × com os filtros apropriados (DAPI-B, 360/40 nanômetro para a excitação e 460/50 nanômetro para a emissão; GFP-B, 470/40 nm para excitação e 535/50 nm para emissão; FRITC, 540/25 nm para excitação e 605/55 nm para emissão.
- Usando o software para análise de imagem (ver tabela de materiais), medir a área transversal (CSA) de cada miofiber, e contar o número de F4/80-, MCP-1-, e TNF-α-células positivas.
Nota: Determine CSA de cada miofiber traçando a margem interna da membrana do porão visualizada com a imunocoloração anti-laminin-2.
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Representative Results
Em consonância com as observações anteriores12, a CSA de miofibras de gastrocnêmio foi significativamente diminuída pela imobilização do membro posterior (Figura 2A, B). Além disso, nossa análise da coloração da imunofluorescência revelou que as pilhas que expressam MCP-1 e TNF-α, ambo desempenham papéis chaves em regular processos inflamatórios13,14, aumentaram significativamente no músculo de gastrocnêmio tecidos de membros posteriores imobilizados (MCP-1: Figura 2C, F, H; TNF-α: Figura 2D, G, I). Juntamente com o aumento das células coradas positivamente com F4/80, um marcador para macrófagos (Figura 2C-E, H, I), a imobilização do membro posterior pareceu instigar atrofia muscular da panturrilha envolvendo respostas inflamatórias locais, incluindo acumulação de macrófago. Nós procuramos então examinar se o LCC, uma massagem-como a intervenção mecânica, modulou esta inflamação e atrofia do músculo imobilização-induzida.
Entre diversas magnitudes diferentes de LCC que nós testamos mudando o peso da unidade cilíndrica, esse que corresponde a 50 mmHg ondas intramusculares da pressão (LCC com 66 g, Figura 3a) pareceu para aliviar o mais eficientemente o diminuição da imobilização induzida pelo miofiber CSA e aumento da acumulação de macrófago nos músculos gastrocnêmio (Figura 3B). Com base nos resultados do miofiber CSA e acúmulo de macrófago, empregamos 66 g de LCC para estudos adicionais. Notavelmente, as ondas de pressão intramuscular induzidas por LCC, cujas magnitudes máximas dependiam do peso unitário cilíndrico, eram altamente uniformes (Figura 3a), indicando a consistência e reprodutibilidade do LCC como uma intervenção mecânica em músculos esqueléticos.
O LCC (1 Hz, 30 min por dia, 7 dias) aliviou significativamente as diminuições induzidas pela imobilização no miofiber CSA dos músculos gastrocnêmio (Figura 4A, B). Além disso, a LCC moderou parcialmente a diminuição induzida pela imobilização na força contratante dos músculos tríceps sural (Figura 4C). Além disso, o LCC moderou os aumentos nas células F4/80-positivas, TNF-α-positivas, F4/80-, MCP-1-e TNF-α-positivas nos tecidos musculares gastrocnêmio de membros posteriores imobilizados (F4/80, Figura 4D, F; MCP-1, Figura 4D, G; TNF-α, Figura 4E, H). Coletivamente, o LCC, que gera ondas de pressão intramusculares com uma amplitude de 50 mmHg, atenuou a atrofia muscular induzida por imobilização e as respostas inflamatórias locais, incluindo acúmulo de macrófago.
Figura 1: imobilização do retromembro bilateral do camundongo e aplicação de compressão cíclica local (LCC).
(A) os hindmembros bilaterais do rato foram imobilizados pela fiação espiral com as junções ancas sequestradas, as junções de joelho estendidas, e as junções de tornozelo plantar-flexiadas. (B) dispositivo LCC. (C) set-up experimental para o LCC na panturrilha do rato. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: a imobilização dos membros posteriores do camundongo, que atrofiam os músculos da panturrilha, induz uma resposta inflamatória local.
(A) imagens micrográficas de corte transversal da coloração da imunofluorescência anti-laminina-2 dos músculos gastrocnêmio. Imagens de alta ampliação (à direita) referem-se às áreas indicadas por retângulos em imagens de baixa ampliação (esquerda). Barras de escala, 100 μm. (B) imobilização atrofia muscular induzida. A CSA de miofibras gastrocnêmio diminuiu com o período de imobilização do membro posterior. Para quantificar a CSA, 100 miofibras foram escolhidas aleatoriamente. Os dados são apresentados como médias ± S.D. *, P < 0, 5, ANOVA One-Way com teste post hoc de Bonferroni (n = 3 camundongos para cada grupo). (C e D) Imagens micrográficas de imunocoloração anti-MCP-1 (verde em C) e anti-TNF-α (verde em D) e anti-F4/80 (vermelho). Para A apresentação mesclada (verde e vermelho), as imagens de ampliação baixa e alta são colocadas como em (A). As setas apontam para células positivas duplas para as barras de escala F4/80 e MCP-1 (C) ou TNF-α (D), 100 μm. (e-I) quantificação de imunocoloração anti-MCP-1, anti-TNF-α e anti-F4/80. Os efeitos da imobilização foram analisados com referência ao período de imobilização bilateral do membro posterior. A análise estatística foi realizada com referência às amostras do ' dia 0 ' (músculos gastrocnemius de camundongos que não foram submetidos à imobilização). Os dados são apresentados como médias ± S.D. *, P < 0, 5, ANOVA One-Way com teste post hoc de Bonferroni (n = 3 camundongos para cada grupo). Este valor foi modificado com a permissão11. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: efeitos da LCC com diferentes magnitudes sobre a atrofia muscular induzida pela imobilização e resposta à inflamação.
(A) aplicação de diferentes magnitudes de LCC alterando o peso da unidade cilíndrica. A barra de escala, 1 s. 36-g, 66-g e 200-g unidades cilíndricas produziram 45 mmHg, 50 mmHg e 140 mmHg ondas de pressão intramusculares, respectivamente. (B) comparação dos efeitos da aplicação de LCC para os membros posteriores imobilizados com unidades cilíndricas 36-g, 66-g e 200-g. CSA de miofibras gastrocnêmio (esquerda) e células F4/80 positivas (direita) da panturrilha aplicada ao LCC foram quantificadas como valores relativos àqueles do membro posterior do controle, que não foi exposto ao LCC, em cada camundongo. Os dados são apresentados como médias ± S.D. *, P < 0, 5, ANOVA One-Way com teste post hoc de Bonferroni (n = 4 camundongos para cada grupo). Este valor foi modificado com a permissão11. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: a LCC atenua a atrofia muscular induzida pela imobilização e a resposta inflamatória.
(A, B) Alívio da atrofia muscular induzida pela imobilização por aplicação de LCC. A CSA de miofibras gastrocnêmio (B) foi analisada como na Figura 2b. Os dados são apresentados como médias ± S.D. *, P < 0, 5; * *, P < 0, 1, ANOVA One-Way com teste post hoc de Bonferroni (n = 6 camundongos para cada grupo). (C) a diminuição da força de contração dos músculos do tríceps sural após a imobilização e sua restauração parcial pelo LCC. Os dados são apresentados como médias ± S.D. *, P < 0, 5, teste t de Student pareado (n = 4 camundongos para controle, n = 5 camundongos para grupo de imobilização). (D, E) Imagens micrográficas de anti-MCP-1 (verde em D), anti-TNF-α (verde em e) e anti-F4/80 (vermelho) coloração de imunofluorescência dos músculos gastrocnêmio de mobilizados (topo) e imobilizados retropatas sem (meio) e com (fundo) aplicação de LCC são apresentados como na Figura 2C, D. Barras de escala, 100 μm. (F-H) quantificação de imunocoloração anti-MCP-1, anti-TNF-α e anti-F4/80. Comparamos os músculos da panturrilha dos membros posteriores imobilizados com e sem aplicação de LCC. Os dados são apresentados como médias ± S.D. *, P < 0, 5; * *, P < 0, 1, ANOVA One-Way com teste post hoc de Bonferroni (n = 6 camundongos para cada grupo). Este valor foi modificado com a permissão11. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura complementar 1: representação esquemática de protocolos experimentais. Por favor clique aqui para baixar a figura.
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Discussion
Nós descrevemos um método para aplicar uma massagem-como o estímulo mecânico, que tem efeitos anti-inflammatory. Nosso sistema tem as seguintes vantagens mesmo quando comparado com aqueles relatados previamente. Em primeiro lugar, estudos prévios não definiram quantitativamente as forças mecânicas aplicadas2 ou definiram suas magnitudes com base na medida na superfície do corpo, mas não dentro dos tecidos10. Ao contrário, Nós medimos a pressão intramuscular usando um telemeter da pressão sanguínea. Em segundo lugar, a estrutura simples do nosso dispositivo (Figura 1b) permitiu-nos construir o sistema com alta consistência e reprodutibilidade (Figura 3a) a um custo relativamente baixo. Em terceiro lugar, nossa intervenção (LCC) relaciona-se com a atividade física (contração muscular leve) em relação às alterações da pressão intramuscular (50 mmHg15). Nossa aproximação fornecerá uma base científica para a massagem-como a intervenção como um procedimento terapêutico/preventivo possível que diminua o demérito da inatividade física16.
O passo mais crítico do nosso protocolo é o posicionamento dos membros posteriores do rato (protocolo passo 3,3). Precisamos aplicar LCC na direção perpendicular aos músculos da panturrilha; caso contrário, os tecidos musculares serão parcialmente espremido e danificado mesmo quando a unidade cilíndrica 66-g for utilizada.
A limitação do método de LCC inclui a exigência da anestesia, que pode ter alguns efeitos no metabolismo do músculo. Também, nós não podemos inteiramente impedir as influências da contração minúscula do músculo que pode ser causada como um reflexo aos impactos afiados durante a aplicação de LCC.
Em conclusão, demonstramos que o movimento do fluido intersticial Medeia os efeitos do LCC11. Podemos ser capazes de induzir o fluxo intersticial de forma mais eficiente, modificando o modo de compressão cíclica. Por exemplo, a compressão do modo sinusoidal pode ser melhor em comparação com traços afiados usados em nosso estudo atual.
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Disclosures
Os autores declaram que não há interesses concorrentes associados ao manuscrito.
Acknowledgments
Agradecemos a K. Nakanishi, K. Hamamoto, N. Kume e K. Tsurumi pelo seu apoio consistente em todo o projeto. Este trabalho foi, em parte, apoiado pelo fundo de investigação intramural do Ministério japonês da saúde, trabalho e bem-estar; Subvenções em auxílio à investigação científica da sociedade japonesa para a promoção da ciência; MEXT-programa apoiado para a Fundação de pesquisa estratégica em universidades privadas, 2015-2019 do Ministério japonês da educação, cultura, esportes, ciência e tecnologia (S1511017).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminum wire | DAISO JAPAN | B028 | An aluminum wire is used to avoid escaping restriction by the wire |
| Blood pressure telemeter | Millar | SPR-671 | A blood pressure telemeter is used to mesure intramuscular pressure. |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | D1306 | DAPI is a fluorescent probe which is commonly used to stain DNA for fluorescent microscopy. |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 (Dilution ratio, 1:500) | Invitrogen | A11034 | Antibody for immunohistochemical staining. |
| Goat anti-rat Alexa Fluor 568 (Dilution ratio, 1:500)) | Invitrogen | A11077 | Antibody for immunohistochemical staining. |
| ImageJ | NIH | N/A | Analysis software for image |
| LabChart8 | ADInstrumens | Analysis software for acquiring biological signals. | |
| Prolong gold | Thermo Fisher Scientific | P36930 | Prolong gold is for mounting stained samples. |
| Protein Block Serum-Free | Dako | X090930-2 | For blocking non-specific background staining in immunohistochemical procedures. |
| Rat monoclonal anti-laminin-2 antibody (Dilution ratio, 1:1000) | Sigma Aldrich | L0663 | Antibody for immunohistochemical staining. |
| Rat monoclonal anti-F4/80 antibody (Dilution ratio, 1:500) | Abcam | ab6640 | Antibody for immunohistochemical staining. |
| Rabbit polyclonal anti-MCP-1 antibody (Dilution ratio, 1:1000) | Abcam | ab25124 | Antibody for immunohistochemical staining. |
| Rabbit polyclonal anti-TNF-α antibody (Dilution ratio, 1:1000) | Abcam | ab66579 | Antibody for immunohistochemical staining. |
| Surgical tape | 3M Japan | 1530EP-0 | Surgical tape is used to restrict joint movement. |
References
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