A 小説円錐状スポンジ チップ電極を用いたゼブラフィッシュ稚魚における網膜電図記録
Summary
ここでは、ゼブラフィッシュ稚魚から光誘発網膜電図反応の測定を簡素化するプロトコルを提案する.新規円錐状のスポンジ チップ電極は、ビジュアル開発の研究は、ゼブラフィッシュ稚魚網膜電図 ERG を信頼性の高い結果と低コストで達成するために簡単に使用する助けることができます。
Abstract
ゼブラフィッシュ (動脈分布) の発達研究の脊椎動物モデルとして用い、視覚神経科学に特に適して。鳥類網膜電図 (ERG) は、視覚的なパフォーマンスの機能測定より高い脊椎動物種に確立されている理想的な非侵襲的な方法です。このアプローチは、ますますゼブラフィッシュ、発達初期の幼虫などの視機能を検査するため使用されています。日付に幼虫ゼブラフィッシュ ERG の最も一般的に使用される記録電極はガラス マイクロ ピペット電極は、限られた資源で研究所の挑戦を提示、その製造に特殊な機器が必要です。ここでは、円錐状のスポンジ チップ電極を用いたゼブラフィッシュ稚魚 ERG プロトコルを提案します。新規電極は製造してより経済的なガラス マイクロ ピペットより幼虫の目を損傷する可能性は低く、ハンドルに簡単です。以前に公開した ERG メソッドと同様現在のプロトコルはそれぞれ視細胞と双極細胞応答、a ・ b 波、外側の網膜機能を評価できます。プロトコルは、ユーティリティ、感度、および新規電極の信頼性を支えるゼブラフィッシュ幼虫の初期開発全体を通して視覚機能の改良を説明することが明らかに。簡易電極は、モデル生物の新しい ERG システムを確立または変更既存小動物 ERG 測定装置の試作ゼブラフィッシュ、ゼブラフィッシュを使用する視覚神経科学の研究者を助ける時に便利です。
Introduction
ゼブラフィッシュ (動脈分布) 視覚神経科学の研究など、広く使用されている遺伝的脊椎動物モデルとなっています。この種の人気の高まりは、遺伝子操作、非常に節約された脊椎動物の視覚システム (ニューロンの種類、解剖学的形態および組織、および基になる遺伝学)、高い多産の使いやすさなどの利点に起因することができます。飼育哺乳類モデル1と比較しての低コスト。非侵襲的な局所網膜電図 (ERG) は、人間の視覚機能を評価するために臨床的に使用されています長いと齧歯動物およびゼブラフィッシュ稚魚2,3を含む大小の種の範囲のビジョンを定量化する実験室の設定で,4,5します。 最も一般的分析 ERG コンポーネントは、a 波と b 波、それぞれ光を感じる視細胞と双極ニューロンから発信されました。ゼブラフィッシュ稚魚における網膜の異なる層は、3 日後受精 (dpf) によって確立された、シナプス ターミナル光受容体円錐形の形態の 4 dpf6、7の前に成熟しました。ゼブラフィッシュ稚魚の外側の網膜機能は 4 dpf、ERG がこの初期の時代以降から測定可能なことを意味する前にこのように行われます。短い実験サイクルとモデルの高スループット特性のため ERG に適用されている疾患モデルにおける機能的アセスメントのゼブラフィッシュ稚魚カラー ビジョンと網膜の開発を分析、ビジュアルの概日リズムを勉強してテスト薬8,9,10、11,12。
しかし、ゼブラフィッシュ稚魚の現在アプローチ ERG は採用が困難になることがありますいくつかの複雑さを持っています。公開されたゼブラフィッシュ稚魚 ERG プロトコルは一般的、記録電極3,4,5,として13、高品質マイクロ ピペットを必要とする導電性の液体で満たされたガラス ピペットを使用してください。ヒント3を。専門機器、マイクロ ピペットの引き手などマイクロフォージ、いくつかのケースでは、その製造に必要です。これは、限られた資源で研究所のための挑戦をすることができます、ゼブラフィッシュ稚魚視覚機能の測定に使用可能な小さな動物 ERG システムを適応させるときにも余分なコストに 。滑らかに、時でさえシャープ マイクロ ピペット チップは幼虫の眼の表面を損傷することが。さらに、電気生理学の商業マイクロ ピペット ホルダーは、固定の銀線で構成されます。これらのワイヤを固定になる増加維持管理費につながる新しいホルダーの購入を必要とする、繰り返し使用した後不動態処理されました。
ここでゼブラフィッシュ稚魚 ERG 測定の確立された小動物 ERG セットアップを適応させるために特に有用である円錐形のスポンジ チップ記録電極を用いた ERG 手法について述べる。電極が一般的なポリ酢酸ビニル (PVA) スポンジおよび他の専門にされた装置なし銀細線を使用して簡単になります。我々 のデータは、この新規電極は敏感であり 4 と 7 の dpf 間幼虫のゼブラフィッシュの網膜の神経回路の機能の開発を示すに十分な信頼性の高いことを見る。この経済的で実用的なスポンジ チップ電極は、エルグの新しいシステムを確立することやゼブラフィッシュ研究、小動物の既存のシステムを変更することは研究者に役に立つかもしれません。
Protocol
Representative Results
Discussion
ERG など機能のリードアウトは、ゼブラフィッシュ稚魚8,9,12,14を研究に使用するツールのスイートでますます重要になっています。ゼブラフィッシュ稚魚の目のサイズが小さいためガラス マイクロ ピペットは、ほとんど公開されているプロトコル3,4…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
このプロジェクトのための資金によって提供された助成金からメルボルン神経科学研究所 (PTG、PRJ BVB と)。
Materials
| 0.22 µm filter | Millex GP | SLGP033RS | Filters the 10× goldfish ringer's buffer for sterilizatio |
| 1-mL syringe | Terumo | DVR-5175 | With a 30G × ½" needle to add drops of saline to the electrode sponge tip to prevent drying and increased noisein the ERG signals. |
| 30G × ½" needle | Terumo | NN*3013R | For adding saline toteh sopnge tip electrode. |
| Bioamplifier | ADInstruments | ML135 | For amplifying ERG signals. |
| Bleach solution | King White | 9333441000973 | For an alternative method of sliver electrode chlorination. Active ingredient: 42 g/L sodium hypochlorite. |
| Circulation water bath | Lauda-Königshoffen | MGW Lauda | Used to make the water-heated platfrom. |
| Electrode lead | Grass Telefactor | F-E2-30 | Platinum cables for connecting silver wire electrodes to the amplifier. |
| Faraday Cage | Photometric Solution International | For maintianing dark adaptation and enclosing the Ganzfeld setup to improve signal-to-noise ratio. | |
| Ganzfeld Bowl | Photometric Solution International | Custom designed light stimulator: 36 mm diameter, 13 cm aperture size. | |
| Luxeon LEDs | Phillips Light Co. | For light stimulation twenty 5W and one 1W LEDs. | |
| Micromanipulator | Harvard Apparatus | BS4 50-2625 | Holds the recording electrode during experiments. |
| Microsoft Office Excel | Microsoft | version 2010 | Spreadsheet software for data analysis. |
| Moisturizing eye gel | GenTeal Gel | 9319099315560 | Used to cover zebrafish larvae during recordings to avoiding dehydration. Active ingredient: 0.3 % Hypromellose and 0.22 % carbomer 980. |
| Pasteur pipette | Copan | 200C | Used to caredully transfer larval zebrafish. |
| Powerlab data acquisition system | ADInstruments | ML785 | Controls the LEDs to generate stimuli. |
| PVA sponge | MeiCheLe | R-1675 | For the placement of larval zebrafish and making the cone-shaped electrode ti |
| Saline solution | Aaxis Pacific | 13317002 | For electroplating silver wire electrode. |
| Scope Software | ADInstruments | version 3.7.6 | Simultaneously triggers the stimulus through the Powerlab system and collects data |
| Silver (fine round wire) | A&E metal | 0.3 mm | Used to make recording and reference ERG electrodes. |
| Stereo microscope | Leica | M80 | Used to shape and measure the cone-shaped sponge apex (with scale bar on eyepiece). Positioned in the Faraday cage for electrode placement. |
| Tricaine | Sigma-aldrich | E10521-50G | For anaethetizing larval zebrafish. |
| Water-heated platform | custom-made | For maintianing the temperature of the sponge platform and the larval body during ERG recordings |
References
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