Larva A roman koni şeklindeki sünger-uç elektrot kullanarak Zebra balığı Electroretinogram kayıt
Summary
Burada, larva Zebra balığı ışık çatışmaya electroretinogram tepkiler ölçüm kolaylaştırır bir iletişim kuralı mevcut. Bir roman koni şeklindeki sünger-uç elektrot larva Zebra balığı electroretinogram ERG güvenilir sonuçlar ve daha düşük maliyet ile elde etmek için daha kolay kullanılmasını görsel geliştirme çalışma yapmak yardımcı olabilir.
Abstract
Zebra balığı (Danio rerio) yaygın gelişimsel çalışmalarda omurgalı bir model olarak kullanılır ve görsel Nöroloji için özellikle uygundur. İşlevsel görsel performans ölçülerini daha yüksek omurgalı türler iyi kurulmuş oldu ideal bir non-invaziv yöntem electroretinography (ERG) dir. Bu yaklaşım giderek Zebra balığı, erken gelişimsel larva evrelerinde de dahil olmak üzere görsel işlevinde incelenmesi için kullanılıyor. Larva Zebra balığı ERG bugüne için en sık kullanılan kayıt elektrot laboratuarlar için bir meydan okuma ile sınırlı kaynakları sunan kendi üretimi için özel ekipman gerektirir cam micropipette elektrot be. Burada, bir koni şeklindeki sünger-uç elektrot kullanan bir larva Zebra balığı ERG Protokolü mevcut. Roman elektrot üretimi ve kolu, daha ekonomik ve daha az daha cam micropipette larva göz zarar olasılığı için daha kolay olur. Daha önce yayımlanmış ERG yöntemleri gibi geçerli protokol dış retina işlevini, photoreceptor ve bipolar hücre yanıtları, a ve b-dalga, anılan sıraya göre değerlendirebilirsiniz. Protokol açıkça Zebra balığı larva, yardımcı programı, duyarlılık ve roman elektrot güvenilirliğini destekleyen erken gelişimi boyunca görsel işlevi arıtma göstermek. Yeni ERG sistemi kurulması veya varolan küçük hayvan ERG cihazları, Zebra balığı ölçüm, araştırmacılar görsel Nöroloji içinde Zebra balığı kullanmak için yardım için değiştirme model organizma Basitleştirilmiş elektrot özellikle yararlıdır.
Introduction
Zebra balığı (Danio rerio) görsel Nöroloji çalışmaları da dahil olmak üzere bir çok kullanılan genetik omurgalı modeli haline geldi. Bu tür artan popülaritesi genetik manipülasyon, son derece korunmuş omurgalı görsel sistem (nöron tipleri, anatomik morfoloji ve organizasyon ve altta yatan genetik), yüksek verimlilik kolaylığı dahil avantajları için bağlanabilir ve Hayvancılık memeli modelleri1‘ e göre daha az maliyeti. Non-invaziv electroretinogram (ERG) uzun klinik olarak insan görsel işlevi, değerlendirmek için kullanılmıştır ve vizyon irili ufaklı tür dahil kemirgen ve larva Zebra balığı2,3 dizi ölçmek için laboratuvar ortamında , 4 , 5. en sık analiz ERG dalga a ve b-dalga, photoreceptors ışık algılama ve bipolar interneurons, sırasıyla kaynaklanan bileşenleridir. Larva Zebra balığı, retina farklı katmanlarda 3 gün sonrası döllenme (dpf) tarafından kurulur ve terminal photoreceptor koni morfolojisi olgun önce 4 dpf6,7synapses. Larva Zebra balığı dış retina işlevi böylece 4 dpf ERG bu erken yaşlarında itibaren ölçülebilir anlamına gelir, daha önce kuruldu. Kısa deneysel döngüsü ve modelinin yüksek üretilen iş özellikleri nedeniyle, ERG hastalık modelleri, işlev değerlendirmesi larva Zebra balığı için uygulanmış olan renk vizyon ve retina geliştirme analiz, görsel sirkadiyen ritim eğitimi ve test uyuşturucu8,9,10,11,12.
Ancak, larva Zebra balığı için geçerli yaklaşımlar ERG benimsemeye zorlaştırmak bazı karmaşıklıklar var. Yayımlanmış larva Zebra balığı ERG protokolleri yaygın olarak yüksek kaliteli micropipette gerektiren kayıt elektrodu3,4,5,13, iletken sıvı ile dolu bir cam micropipette kullanın İpucu3. Özel ekipman, micropipette çekici gibi ve bir microforge, bazı durumlarda, kendi üretimi için gereklidir. Bu laboratuvarlar sınırlı kaynaklara sahip için bir meydan okuma olabilir ve ek bir ücret için bile kullanılabilir küçük hayvan ERG sistemleri larva Zebra balığı görsel işlev ölçüm için adapte ne zaman açar. Ne zaman bile düzeltti, keskin micropipette ipucu larva göz yüzeyine zarar verebilir. Ayrıca, ticari micropipette sahipleri Elektrofizyoloji için sabit bir gümüş tel ile inşa edilir. Bunlar teller sabit artan bakım ücreti için önde gelen yeni sahipleri satın gerektiren tekrarlayan kullanımdan sonra düzgünleştirilecek olmak.
Burada kurulan küçük hayvan ERG kurulumları larva Zebra balığı ERG ölçümler için uyarlamak için yararlıdır bir koni şeklindeki sünger-ipucu kayıt elektrodu, kullanarak bir ERG yöntemi açıklanmaktadır. Elektrot kolayca ortak polivinil asetat (PVA) sünger ve diğer özel ekipman olmadan ince gümüş tel kullanılarak yapılır. Bizim veri bu roman elektrot hassas ve 4 ve 7 dpf arasında larva Zebra balığı retina sinir devreleri fonksiyonel gelişimi göstermek için güvenilir olduğunu gösteriyor. Bu ekonomik ve pratik sünger-uç elektrot Yeni ERG sistemleri oluşturma veya varolan küçük hayvan sistemleri, Zebra balığı Etütler değiştirme araştırmacılar için yararlı olabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
ERG gibi fonksiyonel sonuçlar larva Zebra balığı8,9,12,14eğitim için kullanılan araçlar dizisi içinde giderek daha önemli hale gelmiştir. Larva Zebra balığı göz küçük boyutu nedeniyle, cam MİKROPİPETLER en yayımlanmış protokolleri3,4,5,8,</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu proje için finansman bir grant tarafından Melbourne nörolojik Bilimler Enstitüsü’nden (FTG, PRJ & BVB) sağlandı.
Materials
| 0.22 µm filter | Millex GP | SLGP033RS | Filters the 10× goldfish ringer's buffer for sterilizatio |
| 1-mL syringe | Terumo | DVR-5175 | With a 30G × ½" needle to add drops of saline to the electrode sponge tip to prevent drying and increased noisein the ERG signals. |
| 30G × ½" needle | Terumo | NN*3013R | For adding saline toteh sopnge tip electrode. |
| Bioamplifier | ADInstruments | ML135 | For amplifying ERG signals. |
| Bleach solution | King White | 9333441000973 | For an alternative method of sliver electrode chlorination. Active ingredient: 42 g/L sodium hypochlorite. |
| Circulation water bath | Lauda-Königshoffen | MGW Lauda | Used to make the water-heated platfrom. |
| Electrode lead | Grass Telefactor | F-E2-30 | Platinum cables for connecting silver wire electrodes to the amplifier. |
| Faraday Cage | Photometric Solution International | For maintianing dark adaptation and enclosing the Ganzfeld setup to improve signal-to-noise ratio. | |
| Ganzfeld Bowl | Photometric Solution International | Custom designed light stimulator: 36 mm diameter, 13 cm aperture size. | |
| Luxeon LEDs | Phillips Light Co. | For light stimulation twenty 5W and one 1W LEDs. | |
| Micromanipulator | Harvard Apparatus | BS4 50-2625 | Holds the recording electrode during experiments. |
| Microsoft Office Excel | Microsoft | version 2010 | Spreadsheet software for data analysis. |
| Moisturizing eye gel | GenTeal Gel | 9319099315560 | Used to cover zebrafish larvae during recordings to avoiding dehydration. Active ingredient: 0.3 % Hypromellose and 0.22 % carbomer 980. |
| Pasteur pipette | Copan | 200C | Used to caredully transfer larval zebrafish. |
| Powerlab data acquisition system | ADInstruments | ML785 | Controls the LEDs to generate stimuli. |
| PVA sponge | MeiCheLe | R-1675 | For the placement of larval zebrafish and making the cone-shaped electrode ti |
| Saline solution | Aaxis Pacific | 13317002 | For electroplating silver wire electrode. |
| Scope Software | ADInstruments | version 3.7.6 | Simultaneously triggers the stimulus through the Powerlab system and collects data |
| Silver (fine round wire) | A&E metal | 0.3 mm | Used to make recording and reference ERG electrodes. |
| Stereo microscope | Leica | M80 | Used to shape and measure the cone-shaped sponge apex (with scale bar on eyepiece). Positioned in the Faraday cage for electrode placement. |
| Tricaine | Sigma-aldrich | E10521-50G | For anaethetizing larval zebrafish. |
| Water-heated platform | custom-made | For maintianing the temperature of the sponge platform and the larval body during ERG recordings |
References
- Roper, C., Tanguay, R. L., Slikker, W., Paule, M. G., Wang, C. . Handbook of Developmental Neurotoxicology (Second Edition). , 143-151 (2018).
- Nguyen, C. T., et al. Simultaneous Recording of Electroretinography and Visual Evoked Potentials in Anesthetized Rats. Journal of visualized experiments: JoVE. , e54158 (2016).
- Chrispell, J. D., Rebrik, T. I., Weiss, E. R. Electroretinogram analysis of the visual response in zebrafish larvae. Journal of visualized expriment: JoVE. (97), (2015).
- Seeliger, M. W., Rilk, A., Neuhauss, S. C. Ganzfeld ERG in zebrafish larvae. Documenta Ophthalmologica. 104 (1), 57-68 (2002).
- Fleisch, V. C., Jametti, T., Neuhauss, S. C. Electroretinogram (ERG) Measurements in Larval Zebrafish. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, (2008).
- Biehlmaier, O., Neuhauss, S. C., Kohler, K. Synaptic plasticity and functionality at the cone terminal of the developing zebrafish retina. Developmental Neurobiololgy. 56 (3), 222-236 (2003).
- Gestri, G., Link, B. A., Neuhauss, S. C. The visual system of zebrafish and its use to model human ocular diseases. Developmental Neurobiololgy. 72 (3), 302-327 (2012).
- Saszik, S., Bilotta, J., Givin, C. M. ERG assessment of zebrafish retinal development. Visual Neuroscience. 16 (5), 881-888 (1999).
- Niklaus, S., et al. Cocaine accumulation in zebrafish eyes leads to augmented amplitudes in the electroretinogram. Matters. 3 (6), e201703000003 (2017).
- Tanvir, Z., Nelson, R. F., DeCicco-Skinner, K., Connaughton, V. P. One month of hyperglycemia alters spectral responses of the zebrafish photopic ERG. Disease models & mechanisms. , (2018).
- Kakiuchi, D., et al. Oscillatory potentials in electroretinogram as an early marker of visual abnormalities in vitamin A deficiency. Molecular medicine reports. 11 (2), 995-1003 (2015).
- Emran, F., Rihel, J., Adolph, A. R., Dowling, J. E. Zebrafish larvae lose vision at night. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2010).
- Makhankov, Y. V., Rinner, O., Neuhauss, S. C. An inexpensive device for non-invasive electroretinography in small aquatic vertebrates. Journal of Neuroscience Methods. 135 (1-2), 205-210 (2004).
- Bilotta, J., Saszik, S., Sutherland, S. E. Rod contributions to the electroretinogram of the dark-adapted developing zebrafish. Developmental Dynamics. 222 (4), 564-570 (2001).
- Cameron, M. A., Barnard, A. R., Lucas, R. J. The electroretinogram as a method for studying circadian rhythms in the mammalian retina. Journal of genetics. 87 (5), 459-466 (2008).
- Bui, B. V., Armitage, J. A., Vingrys, A. J. Extraction and modelling of oscillatory potentials. Documenta Ophthalmologica. 104 (1), 17-36 (2002).
- Bui, B. V., Fortune, B. Ganglion cell contributions to the rat full-field electroretinogram. The Journal of Physiology. 555 (1), 153-173 (2004).
