Capturando a molécula pequena comunicação entre os tecidos e células usando a imagem latente de espectrometria de massa
Summary
Um novo método de preparação da amostra foi desenvolvido para acomodar coculture célula e tecido para detectar a troca de pequena molécula usando espectrometria de massa de imagens.
Abstract
Espectrometria de massa (IMS) de imagem rotineiramente aplicou-se a três tipos de amostras: cortes histologicos, esferoides e colónias microbianas. Estes tipos de amostra foram analisados usando laser assistida por matriz dessorção/ionização tempo-de-voo espectrometria de massa (MALDI-TOF-MS) para visualizar a distribuição de proteínas, lípidos e metabolitos em toda a amostra biológica de interesse. Nós desenvolvemos um método de preparação de amostra romance que combina os pontos fortes das três aplicações anteriores para abordar uma abordagem underexplored para identificar a comunicação química em câncer, por semeadura de culturas de células de mamíferos em agarose em coculture com tecidos saudáveis, seguidos por dessecação da amostra. Células e tecidos de mamíferos são cocultured nas proximidades, permitindo a comunicação química via difusão entre os tecidos e células. Em pontos específicos de tempo, a amostra com base em agarose é seco da mesma maneira como colónias microbianas preparado para análise IMS. Nosso método foi desenvolvido para modelar a comunicação entre o câncer de ovário serosa da classe elevada, derivado de Falópio como ele interage com o ovário durante a metástase. Otimização da preparação amostra resultou na identificação de norepinefrina como um componente químico chave no microambiente do ovário. Esse método recentemente desenvolvido pode ser aplicado a outros sistemas biológicos que exigem uma compreensão da comunicação química entre células adjacentes ou tecidos.
Introduction
Imagem de espectrometria de massa (IMS) foi otimizado para caracterizar a distribuição espacial das características moleculares em três aplicações: fatias de tecido, esferoides e colónias microbianas1,2,3. Fatias de tecido podem ser usadas para avaliar a localização de metabólitos no contexto de condições biológicas em um host, ou alvo ou segmentados em um intervalo específico de massa. No entanto, diferenças entre características moleculares são as mais significativas e óbvio quando um tecido saudável é comparado a uma condição de doente, por exemplo, um tumor. Esta abordagem IMS é particularmente adaptada para detecção de biomarcadores da doença, no entanto, adquirir amostras de tecido em fases distintas na progressão da doença (tais como notas de tumor) opõe-se à identificação dos sinais que pode ser importante para a iniciação do doença. O intercâmbio de informações através do espaço é uma característica onipresente de muitos sistemas biológicos, e fatias de tecido não podem capturar este relé químico dinâmico. Uma técnica que é capaz de visualizar a difusão e a troca química é IMS das colónias microbianas cultivadas em placas de ágar; pequenas moléculas são capazes de difundir através de e através do ágar-ágar e podem ser capturadas através do laser assistida por matriz (MALDI-TOF) de dessorção/ionização espectrometria de massa4. Esta configuração de crescimento pode ser usada para identificar moléculas trocadas entre entidades biológicas distintas (colônias) e também pode determinar a direção de produção do metabólito. A plataforma originalmente projetada para o crescimento da colônia microbiana foi adaptada para explorar o metabolismo primário de tecido explantes cultivados com células de mamíferos, e IMS foi utilizado para avaliar a dinâmica troca de química em um sistema de mamíferos in vitro.
Nos últimos anos, tornou-se claro que o câncer de ovário serosa de alto grau (HGSOC) muitas vezes se origina no epitélio da trompa de Falópio (FTE) e então metastatiza para o ovário durante cedo doença desenvolvimento5,6, 7 , 8. a razão que FTE oncogenicidade células se espalhou para o ovário, onde grandes tumores eventualmente formam e metastatizam ainda mais, é atualmente incerto. A pesquisa anterior centrou-se sobre o papel das proteínas ovarianos primária metástases para o ovário; no entanto, recentemente demonstrou que a transição de um saudável para um tecido oncogenicidade resulta em enormes perturbações do metabolismo celular e altera a produção de pequenas moléculas9,10,11. Portanto, formulamos a hipótese que pequenas moléculas trocadas entre o ETI e o ovário podem ser parcialmente responsáveis por metástase de primário de HGSOC.
Usando nosso procedimento IMS recém-desenvolvido, determinamos que coculture de FTE oncogenicidade e tecido ovariano induz a produção de norepinefrina do ovário. No entanto, outros tipos de célula ou células FTE normais não provocam este efeito. Um extraordinário benefício desse método é que a produção molecular e troca de sinais que representam moléculas reais podem ser visualizados, assim, mesmo em um coculture é possível determinar a fonte do sinal. Esta é uma vantagem com a análise de amostras homogeneizadas, onde todas as informações espaciais são perdidas. Em nosso sistema de modelo, conseguimos atribuir claramente a produção de noradrenalina para o ovário. A noradrenalina tem sido associada à metástase e chemoresistance de câncer de ovário, e nossa detecção desta molécula validou que o novo método IMS pode descobrir moléculas biologicamente relevantes12,13, 14. esta validação permite-nos propor que esta nova aplicação do IMS pode ser particularmente útil para a investigação de grupos que estão tentando identificar moléculas pequenas em ambientes coculture e entender os primeiros eventos que influenciam a transformação de células e metástase. O objectivo geral deste método é elucidar a identidade e a distribuição espacial de pequenas moléculas durante o intercâmbio entre os tecidos e órgãos, representados por em vitro culturas de células 3D ou tecido ex vivo .
Protocol
Representative Results
Discussion
Há um crescente corpo de evidências que implique o papel da noradrenalina em HGSOC12,17,18, e esta técnica contribuiu com informações mais mecanicistas. Pelo menos oito condições biológicas presentes no mesmo slide, o método pode conta para controles biológicos tais como gene e especificidade da célula, bem como controles de mídia em um único IMS executar. Enquanto o método foi otimizado avaliar trocadas pequenas m…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O financiamento foi fornecido pelo consórcio biomédica Chicago, com o apoio dos fundos Searle em Chicago comunidade Trust (C-076) (LMS); Universidade de Illinois em Chicago inicialização fundos (LMS); Grant 543296 da Aliança de fundo de pesquisa de câncer de ovário (MD); e UG3 ES029073 (J.E.B) e pelo centro nacional para avançar translacional Ciências, Instituto Nacional de saúde, através da concessão de UL1TR002003 (JEB & LMS).
Materials
| 15 mL Falcon tubes | Denville | C1017-O | To collect cells |
| 8-well chamber (Millipore EZ-slide chamber) | Millipore | PEZGS0816 | Repurposed from Millipore Millicell EZ-slide chamber slide |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34998-4L | Solvent for sprayed matrix |
| Alpha Minimum Essential Medium (αMEM) | Fisher | 10-022-CV | Cell culture media |
| Autoflex speed MALDI-TOF LRF | Bruker | For IMS data analysis | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | To collect cells and remove supernatant |
| CHCA Matrix | Bruker Daltonic | 8201344 | Matrix sprayed onto dried slide |
| DHB Matrix | Bruker Daltonic | 8201346 | Matrix sprayed onto dried slide |
| Disposable Scalpels | Fisher | 22-079-707 | For removal of the ovaries |
| Dissecting Scissors | Fisher | 13-804-6 | For removal of the ovaries |
| DMEM Media | Gibco | 11995-065 | Media mixed with agarose |
| epidermal growth factor | Peprotech Inc. | 100-15 | Cell culture media supplement |
| Eppendorf tubes | Genesee Scientific | 22-282 | For agarose aliquots |
| Estradiol-17β | Simga-Aldrich | E2758 | Cell culture media supplement |
| Fetal Bovine Serum | Denville | fb5001 | Cell culture media supplement |
| FlexControl 3.4 | Bruker Daltonic | IMS data acquisition software | |
| FlexImaging 4.1 | Bruker Daltonic | IMS data analysis software | |
| Forceps (fine) | Fsiher | 22-327379 | For removal of the ovaries |
| Gentamycin | Cellgro | 30-005-CR | Cell culture media supplement |
| Insulin, Transferrin, Selenium (ITS) | Sigma-Aldrich | 11074547001 | Cell culture media supplement |
| ITO-coated slide | Bruker | 8237001 | Platform for co-culture incubation |
| Leibovitz's L-15 Medium | Gibco | 11415064 | Media used during tissue dissection |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | Cell culture media supplement |
| Low-melting agarose | Sigma-Aldrich | A9414-10G | Mixed with media for plating |
| Media basin | Corning | 4870 | Used to cut plastic dividers for divided chambers |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140-122 | Cell culture media supplement |
| Peptide Calibration Standard | Bruker Daltonic | 8206195 | Calibrant for medium mass range |
| Phophorus red | Sigma-Aldrich | 343-242-5G | Calibrant for low mass range |
| SCiLS Lab 2015 | Bruker Daltonic | IMS data statistical analysis | |
| Surgical Forceps (blunt) | Fisher | 08-875-8B | For removal of the ovaries |
| TFA | Fisher Technologies | A116-50 | Added to matrix solution |
| TM Sprayer | HTX Technologies | For applying matrix |
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