Erfassung von niedermolekularer Kommunikation zwischen Gewebe und Zellen mit Hilfe von Imaging-Massenspektrometrie
Summary
Ein neuartiges Verfahren der Probenvorbereitung wurde entwickelt, um Platz für Zell- und Coculture um niedermolekulare Exchange über bildgebende Massenspektrometrie zu erkennen.
Abstract
Bildgebende Massenspektrometrie (IMS) routinemäßig auf drei Arten von Proben angewendet wurde: Gewebeschnitte Sphäroide und mikrobiellen Kolonien. Diese Probentypen wurden analysiert mit Matrix-unterstützte Laser Desorption/Ionisierung Flugzeit-Massenspektrometrie (MALDI-TOF MS), um die Verteilung der Proteine, Lipide und Metaboliten in der biologischen Probe von Interesse zu visualisieren. Wir haben eine neue Probe Vorbereitung Methode entwickelt, die kombiniert die Stärken der drei vorhergehenden Anwendungen an ein unentdecktes Ansatz zur Identifizierung von chemischen Kommunikation bei Krebs, durch impfen Säugerzelle Kulturen in Agarose in coculture mit gesundem Gewebe, gefolgt von Austrocknung der Probe. Säugetier-Gewebe und Zellen sind in der Nähe, so dass chemische Kommunikation über Diffusion zwischen dem Gewebe und Zellen cocultured. Zu bestimmten Zeitpunkten wird die Agarose-basierte Probe auf die gleiche Weise wie mikrobiellen Kolonien vorbereitet für IMS-Analyse getrocknet. Unsere Methode wurde entwickelt, um die Kommunikation zwischen hochwertigem serösen Ovarialkarzinom Eileiter abgeleitet, wie es mit dem Eierstock während Metastasen interagiert zu modellieren. Optimierung der Probenvorbereitung führte bei der Identifizierung von Noradrenalin als chemische Schlüsselkomponente in der Eierstöcke Mikroumgebung. Diese neu entwickelte Methode kann auf anderen biologischen Systemen angewendet werden, die ein Verständnis der chemischen Kommunikation zwischen benachbarten Zellen oder Gewebe erfordern.
Introduction
Bildgebende Massenspektrometrie (IMS) wurde optimiert, um die räumliche Verteilung der molekularen Eigenschaften in drei weit verbreitete Anwendungen charakterisieren: Gewebe Scheiben, Sphäroide und mikrobiellen Kolonien1,2,3. Gewebe-Scheiben können verwendet werden, um die Lokalisierung von Metaboliten im Zusammenhang mit der biologischen Bedingungen in einer Vielzahl, entweder gezielt oder ungezielte innerhalb eines bestimmten Bereichs der Masse zu bewerten. Unterschiede zwischen molekularen Funktionen sind jedoch erhebliche und offensichtlich, wenn ein gesundes Gewebe ist im Vergleich zu einer krankhaften Zustand, z. B. ein Tumor. Dieser IMS-Ansatz eignet sich besonders zum Nachweis von Biomarkern Krankheit, jedoch die Identifizierung von Signalen, die für die Einleitung des wichtig sein könnte schließt Erwerb von Gewebeproben in diskrete Phasen im Krankheitsverlauf (z. B. Tumor-Klasse) der Erkrankung. Der Austausch von Informationen durch den Raum ist eine allgegenwärtige Funktion vieler biologischer Systeme und Gewebe Scheiben dieses dynamischen chemischen Relais nicht erfasst werden. Eine Technik, die Visualisierung von chemischen Austausch und Verbreitung kann ist IMS der mikrobiellen Kolonien auf Agarplatten gewachsen; kleine Moleküle sind in der Lage, durch und über die Agar zu verbreiten und über Matrix-unterstützte Laser Desorption/Ionisierung (MALDI-TOF) Massenspektrometrie4erfasst werden können. Dieses Wachstum-Setup kann verwendet werden, um Moleküle ausgetauscht zwischen diskreten biologische Entitäten (Kolonien) zu identifizieren und Direktionalität der Metabolit Produktion bestimmen kann. Die Plattform, die ursprünglich für mikrobielle Koloniewachstum wurde angepasst um den primären Stoffwechsel der Gewebe Explantaten mit Säugerzellen gewachsen zu erkunden, und IMS wurde verwendet, um den dynamischen chemischen Austausch in einem in vitro Säugetier-System zu bewerten.
In den letzten Jahren ist deutlich geworden, dass hochwertige serösen Ovarialkarzinom (HGSOC) oft ihren in den Eileiter Epithel (FTE Ursprung) und dann der Eierstöcke während der frühen Krankheit Entwicklung5,6, metastasiert 7 , 8. tumorigenic FTE Ausbreitung der Eierstöcke, Zellen, wo große Tumoren schließlich bilden und metastasieren weiter, ist derzeit unklar. Die bisherige Forschung konzentriert sich auf die Rolle der ovarielle Proteine in primären Metastasen in den Eierstock; jedoch wurde kürzlich nachgewiesen, dass der Übergang von einer gesunden zu einem tumorigenic Gewebe zu massiven Störungen des Zellstoffwechsels führt und Produktion von kleinen Molekülen9,10,11verändert. Daher vermutet wir, dass kleine Moleküle, die zwischen der FTE und der Eierstock ausgetauscht für primäre Metastasierung von HGSOC mitverantwortlich sein können.
Mit unserer neu entwickelten IMS-Verfahren haben wir festgestellt, dass Coculture tumorigenic FTE und gesunden Eierstockgewebe die Produktion von Noradrenalin aus dem Eierstock induziert. Jedoch andere Zelltypen oder normalen FTE Zellen dieser Effekt nicht entlocken. Ein außerordentlicher Vorteil dieser Methode ist, dass die molekulare Herstellung und Austausch von Signalen, die reale Molekülen darstellen können visualisiert werden, also auch in einem Coculture ist es möglich, die Quelle eines Signals zu bestimmen. Dies ist ein Vorteil gegenüber homogenisierte Proben, wo sind alle räumlichen Informationen verloren gehen. In unserem Modellsystem konnten wir die Produktion von Noradrenalin Eierstock eindeutig zuordnen. Noradrenalin hat Metastasen und Therapie von Eierstockkrebs in Verbindung gebracht worden, und unsere Erkennung dieses Moleküls hat bestätigt, dass die neuartige Methode der IMS biologisch relevanter Moleküle12,13, aufdecken kann 14. diese Validierung kann wir vorschlagen, dass diese neue Anwendung von IMS kann besonders hilfreich sein, Forschungsgruppen, die versuchen, kleine Moleküle in Coculture Umgebungen zu identifizieren und um frühe Ereignisse zu verstehen, die Transformation der Zelle beeinflussen und Metastasierung. Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist, die Identität und die räumliche Verteilung von kleinen Molekülen während Austausch zwischen Geweben und Organen, vertreten durch in-vitro- 3D Zellkulturen oder ex Vivo Gewebe aufzuklären.
Protocol
Representative Results
Discussion
Es gibt eine wachsende Zahl von beweisen, die Noradrenalin Rolle HGSOC12,17,18impliziert, und diese Technik hat mehr mechanistischen Informationen beigetragen. Mit mindestens acht biologischen Bedingungen auf derselben Folie vorhanden kann die Methode biologische Kontrollen entfallen, wie gen sowie Zelle Spezifität und Medienkontrolle in einem einzigen IMS laufen. Während die Methode optimiert wurde zur Bewertung ausgetauscht …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Von der Chicago biomedizinische Konsortium mit Unterstützung wurde der Searle-Fonds auf der Chicago Community Trust (C-076) (L.M.S); finanziert University of Illinois at Chicago Startup finanziert (L.M.S); Grant 543296 von Eierstockkrebs Research Fund Alliance (M.D.); und UG3 ES029073 (Jeb) und des nationalen Zentrums für die Förderung translationale Wissenschaften, Nationales Institut für Gesundheit, durch Grant UL1TR002003 (JEB & LMS).
Materials
| 15 mL Falcon tubes | Denville | C1017-O | To collect cells |
| 8-well chamber (Millipore EZ-slide chamber) | Millipore | PEZGS0816 | Repurposed from Millipore Millicell EZ-slide chamber slide |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34998-4L | Solvent for sprayed matrix |
| Alpha Minimum Essential Medium (αMEM) | Fisher | 10-022-CV | Cell culture media |
| Autoflex speed MALDI-TOF LRF | Bruker | For IMS data analysis | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | To collect cells and remove supernatant |
| CHCA Matrix | Bruker Daltonic | 8201344 | Matrix sprayed onto dried slide |
| DHB Matrix | Bruker Daltonic | 8201346 | Matrix sprayed onto dried slide |
| Disposable Scalpels | Fisher | 22-079-707 | For removal of the ovaries |
| Dissecting Scissors | Fisher | 13-804-6 | For removal of the ovaries |
| DMEM Media | Gibco | 11995-065 | Media mixed with agarose |
| epidermal growth factor | Peprotech Inc. | 100-15 | Cell culture media supplement |
| Eppendorf tubes | Genesee Scientific | 22-282 | For agarose aliquots |
| Estradiol-17β | Simga-Aldrich | E2758 | Cell culture media supplement |
| Fetal Bovine Serum | Denville | fb5001 | Cell culture media supplement |
| FlexControl 3.4 | Bruker Daltonic | IMS data acquisition software | |
| FlexImaging 4.1 | Bruker Daltonic | IMS data analysis software | |
| Forceps (fine) | Fsiher | 22-327379 | For removal of the ovaries |
| Gentamycin | Cellgro | 30-005-CR | Cell culture media supplement |
| Insulin, Transferrin, Selenium (ITS) | Sigma-Aldrich | 11074547001 | Cell culture media supplement |
| ITO-coated slide | Bruker | 8237001 | Platform for co-culture incubation |
| Leibovitz's L-15 Medium | Gibco | 11415064 | Media used during tissue dissection |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | Cell culture media supplement |
| Low-melting agarose | Sigma-Aldrich | A9414-10G | Mixed with media for plating |
| Media basin | Corning | 4870 | Used to cut plastic dividers for divided chambers |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140-122 | Cell culture media supplement |
| Peptide Calibration Standard | Bruker Daltonic | 8206195 | Calibrant for medium mass range |
| Phophorus red | Sigma-Aldrich | 343-242-5G | Calibrant for low mass range |
| SCiLS Lab 2015 | Bruker Daltonic | IMS data statistical analysis | |
| Surgical Forceps (blunt) | Fisher | 08-875-8B | For removal of the ovaries |
| TFA | Fisher Technologies | A116-50 | Added to matrix solution |
| TM Sprayer | HTX Technologies | For applying matrix |
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