En ny metod för provberedning utvecklades för att rymma cell- och coculture för att upptäcka småmolekylära exchange med imaging masspektrometri.
Imaging masspektrometri (IMS) har rutinmässigt kopplats till tre typer av prover: vävnadssnitt, spheroids och mikrobiell kolonier. Dessa typer av prov har analyserats med matrix-assisted laser desorption/jonisering time-of-flight masspektrometri (MALDI-TOF MS) för att visualisera fördelningen av proteiner, lipider och metaboliter över biologiska provet av intresse. Vi har utvecklat en roman prov förberedelse metod som kombinerar styrkan i de tre föregående program att ta itu med en underexploaterade metod för att identifiera kemisk kommunikation i cancer, genom sådd däggdjursceller kulturer i agaros i coculture med friska vävnader följt av uttorkning av provet. Däggdjursvävnader och celler är cocultured i närheten så att kemiska kommunikation via diffusion mellan vävnad och celler. Vid specifika tidpunkter torkas agaros-baserade provet på samma sätt som mikrobiella kolonier förberedd för IMS analys. Vår metod har utvecklats för att modellera kommunikationen mellan höggradig serös äggstockscancer, som härrör från äggledaren som det interagerar med äggstocken under metastaser. Optimering av provberedningen resulterade i identifieringen av noradrenalin som en kemisk nyckelkomponent i den ovarian mikromiljö. Denna nyutvecklade metoden kan tillämpas på andra biologiska system som kräver en förståelse för kemisk kommunikation mellan angränsande celler eller vävnader.
Imaging masspektrometri (IMS) har optimerats för att karakterisera den rumsliga fördelningen av molekylär funktioner i tre allmänt använda program: vävnad segment, spheroids och mikrobiell kolonier1,2,3. Vävnad skivor kan användas för att utvärdera localizationen av metaboliter i samband med biologiska förhållandena i en värd, antingen riktade eller oriktad inom ett visst massa intervall. Men är skillnaderna mellan molekylär funktioner den mest betydande och uppenbara jämfört med en frisk vävnad är en sjuka tillstånd, till exempel en tumör. Denna IMS metod är särskilt anpassad till upptäckt av sjukdom biomarkörer, dock förvärva vävnadsprover diskret skeden i sjukdomsprogression (t ex tumör kvaliteter) utgör hinder för identifiering av signaler som kan vara viktiga för inledandet av den sjukdom. Utbyte av information genom rymden är en allestädes närvarande funktion av många biologiska system och vävnad skivor kan inte fånga detta dynamiska kemiska relä. En teknik som kan visualisera kemiska exchange och diffusion är IMS av mikrobiell kolonier odlas på agarplattor; små molekyler kan diffundera genom och över agar och kan fångas via matrix-assisted laser desorption/jonisering (MALDI-TOF) masspektrometri4. Denna tillväxt inställning kan användas för att identifiera molekyler som utbyts mellan diskreta biologiska enheter (kolonier) och kan även bestämma riktningen på metaboliten produktion. Den plattform som ursprungligen utformad för mikrobiell kolonin tillväxt anpassades till utforska den primära metabolismen av vävnad bladsticklingar vuxit med däggdjursceller och IMS användes för att utvärdera dynamiska kemiska utbyte i en in vitro-däggdjur system.
De senaste åren, har det blivit tydligt att höggradig serös äggstockscancer (HGSOC) ofta har sitt ursprung i äggledaren epitel (FTE) och sedan metastasizes till äggstocken under tidig sjukdom utveckling5,6, 7 , 8. anledningen till att tumörframkallande FTE celler spridit sig till äggstockarna, där stora tumörer så småningom bilda och metastasera ytterligare, är för närvarande oklart. Tidigare forskning har fokuserat på rollen av äggstockscancer proteiner i primära metastaser till äggstocken; Det har dock nyligen visat att övergången från en hälsosam till en tumörframkallande vävnad resulterar i massiva störningar av cellulär metabolism och förändrar produktionen av små molekyler9,10,11. Därför hypotesen vi att små molekyler som utbyts mellan FTE och äggstockarna kan vara delvis ansvarig för primära metastas av HGSOC.
Med vårt nyutvecklade IMS-förfarande, som vi har konstaterat att coculture tumörframkallande FTE och friska äggstocksvävnad inducerar produktionen av noradrenalin från äggstocken. Dock Omalizumab andra celltyper eller normala FTE celler denna effekt. En extra fördel med denna metod är att molekylär produktion och utbyte av signaler som representerar riktiga molekyler kan visualiseras, så även i en coculture är det möjligt att fastställa källan till en signal. Detta är en fördel över analys av homogeniserade prover, där alla rumsliga information går förlorad. I vår modellsystem kunde vi tydligt tilldela äggstocken produktionen av noradrenalin. Noradrenalin har kopplats till metastaser och chemoresistance av äggstockscancer, och vår upptäckt av denna molekyl har validerat att romanen IMS metod kan avslöja biologiskt relevanta molekyler12,13, 14. denna validering kan vi föreslå att denna nya ansökan av IMS kan vara särskilt användbara för forskningsgrupper som försöker att identifiera små molekyler i coculture miljöer och förstå tidiga händelser som påverkar celltransformation och metastasering. Det övergripande målet med denna metod är att belysa identitet och rumslig distribution av små molekyler under utbyte mellan vävnader och organ, representerade antingen genom in vitro- 3D cellkulturer eller ex vivo vävnad.
Det finns en växande mängd bevis som ifrågasätter noradrenalins roll i HGSOC12,17,18, och denna teknik har bidragit mer mekanistisk information. Med minst åtta biologiska villkor på samma bild, kan metoden står för biologiska kontroller som genen och cell specificitet samt mediakontroller i en enda IMS springa. Samtidigt som metoden var optimerad för att utvärdera utbytte små molekyler i en modell av primära metastas…
The authors have nothing to disclose.
Finansieringen tillhandahölls av Chicago biomedicinsk konsortiet med stöd från Searle fonderna på The Chicago Community Trust (C-076) (L.M.S.); University of Illinois at Chicago start medel (L.M.S.); Grant 543296 från Ovarian Cancer Research Fund Alliance (M.D.); och UG3 ES029073 (J.E.B.) och av National Center for framåt translationell vetenskaper, National Institute of Health, genom bidrag UL1TR002003 (JEB & LMS).
15 mL Falcon tubes | Denville | C1017-O | To collect cells |
8-well chamber (Millipore EZ-slide chamber) | Millipore | PEZGS0816 | Repurposed from Millipore Millicell EZ-slide chamber slide |
Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34998-4L | Solvent for sprayed matrix |
Alpha Minimum Essential Medium (αMEM) | Fisher | 10-022-CV | Cell culture media |
Autoflex speed MALDI-TOF LRF | Bruker | For IMS data analysis | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | To collect cells and remove supernatant |
CHCA Matrix | Bruker Daltonic | 8201344 | Matrix sprayed onto dried slide |
DHB Matrix | Bruker Daltonic | 8201346 | Matrix sprayed onto dried slide |
Disposable Scalpels | Fisher | 22-079-707 | For removal of the ovaries |
Dissecting Scissors | Fisher | 13-804-6 | For removal of the ovaries |
DMEM Media | Gibco | 11995-065 | Media mixed with agarose |
epidermal growth factor | Peprotech Inc. | 100-15 | Cell culture media supplement |
Eppendorf tubes | Genesee Scientific | 22-282 | For agarose aliquots |
Estradiol-17β | Simga-Aldrich | E2758 | Cell culture media supplement |
Fetal Bovine Serum | Denville | fb5001 | Cell culture media supplement |
FlexControl 3.4 | Bruker Daltonic | IMS data acquisition software | |
FlexImaging 4.1 | Bruker Daltonic | IMS data analysis software | |
Forceps (fine) | Fsiher | 22-327379 | For removal of the ovaries |
Gentamycin | Cellgro | 30-005-CR | Cell culture media supplement |
Insulin, Transferrin, Selenium (ITS) | Sigma-Aldrich | 11074547001 | Cell culture media supplement |
ITO-coated slide | Bruker | 8237001 | Platform for co-culture incubation |
Leibovitz's L-15 Medium | Gibco | 11415064 | Media used during tissue dissection |
L-glutamine | Gibco | 25030-081 | Cell culture media supplement |
Low-melting agarose | Sigma-Aldrich | A9414-10G | Mixed with media for plating |
Media basin | Corning | 4870 | Used to cut plastic dividers for divided chambers |
Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140-122 | Cell culture media supplement |
Peptide Calibration Standard | Bruker Daltonic | 8206195 | Calibrant for medium mass range |
Phophorus red | Sigma-Aldrich | 343-242-5G | Calibrant for low mass range |
SCiLS Lab 2015 | Bruker Daltonic | IMS data statistical analysis | |
Surgical Forceps (blunt) | Fisher | 08-875-8B | For removal of the ovaries |
TFA | Fisher Technologies | A116-50 | Added to matrix solution |
TM Sprayer | HTX Technologies | For applying matrix |