Gewebesammlung von Fledermäusen für -Omics Analysen und primäre Zellkultur
Summary
Dies ist ein Protokoll für die optimale Gewebevorbereitung für genomische, transkriptomische und proteomische Analysen von Fledermäusen, die in freier Wildbahn gefangen sind. Es enthält Protokolle für Fledermaus-Capture und -Sektion, Gewebekonservierung, und Zellkultivierung von Fledermausgewebe.
Abstract
Mit dem Fortschritt der Hochdurchsatz-Sequenzierungstechnologien ermöglichen standardisierte Methoden zur qualitativ hochwertigen Gewebeerfassung und -konservierung die Ausweitung dieser Methoden auf Nichtmodellorganismen. Eine Reihe von Protokollen zur Optimierung der Gewebesammlung von Fledermäusen wurde für eine Reihe von Hochdurchsatz-Sequenzierungsansätze entwickelt. Hier sind Protokolle für die Erfassung von Fledermäusen, gewünschte Demografie für jede Fledermaus gesammelt werden, und optimierte Methoden, um Stress auf eine Fledermaus während der Gewebesammlung zu minimieren. Konkret beschrieben werden Methoden zur Sammlung und Behandlung von Gewebe, um (i) DNA für genomische Analysen mit hohem Molekulargewicht zu erhalten, (ii) RNA für gewebespezifische Transkriptome und (iii) Proteine für proteomische Analysen. Schließlich wird auch eine Methode beschrieben, um tödliche Probenahmen zu vermeiden, indem aus Flügelclips lebensfähige primäre Zellkulturen erstellt werden. Eine zentrale Motivation dieser Methoden ist es, die Menge der potenziellen molekularen und morphologischen Daten für jede Fledermaus zu maximieren und schlagen optimale Möglichkeiten, um Gewebe zu erhalten, so dass sie ihren Wert behalten, wie neue Methoden in der Zukunft entwickeln. Diese Standardisierung ist besonders wichtig geworden, da Initiativen zur Sequenzierung von chromosomenfreien Genomen von Arten auf der ganzen Welt entstanden sind, in denen mehrere wissenschaftliche Parteien die Sequenzierung verschiedener taxonomischer Gruppen. Die hier beschriebenen Protokolle definieren die idealen Methoden zur Gewebesammlung und Gewebeerhaltung für Bat1K, das Konsortium, das die Genome jeder Fledermausart sequenziert.
Introduction
HTS-Methoden (High-Throughput-Sequenzierung) haben ihre Effizienz schnell weiterentwickelt und die Kosten gesenkt, und es ist nun möglich, diese Ansätze auf Hunderte oder Tausende von Proben zu skalieren. Erkenntnisse, die durch die Anwendung dieser Technologien gewonnen werden, haben enorme Auswirkungen auf mehrere wissenschaftliche Disziplinen, von der Biomedizin bis zur Evolution und Ökologie1,2,3. Dennoch setzen viele HTS-Anwendungen entscheidend auf hochwertige Nukleinsäuren aus einer lebenden Quelle. Diese Einschränkung dürfte mit der Entwicklung der Sequenzierung der dritten Generation auf der Grundlage lang gelesener Moleküle4zunehmend problematisch werden. Aus diesen Gründen ist es notwendig, die Bemühungen auf die Festlegung bewährter Verfahren für die Sammlung von probenfrischen Gewebeproben von Wildorganismen außerhalb des Labors zu konzentrieren, was den Nutzen von Material maximiert und die Anzahl der Personen verringert, die ruhig.
Bat1K ist ein internationales Konsortium von Wissenschaftlern mit einer laufenden Initiative, um das Genom jeder Fledermausart auf Chromosomenebene Assembly5zu sequenzieren. Fledermäuse stellen 20% der Säugetiervielfalt dar und haben außergewöhnliche Anpassungen, die Auswirkungen auf das Verständnis von Alterung, Krankheitsökologie, Sinnesbiologie und Stoffwechsel haben5,6. Viele Fledermäuse sind auch bedroht oder gefährdet durch menschliche Ausbeutung7 oder sind schnell rückläufig aufgrund von Krankheitserregern8,9, und Genom-Ebene Sequenzierung ist von großer Bedeutung für die Erhaltung dieser Arten. Obwohl Bat1K derzeit darauf abzielt, die Genome aller Fledermausarten zu sequenzieren, bleibt die Standardisierung der Sammlung von Gewebeproben für eine hochwertige genomische Sequenzierung eine zentrale Herausforderung in der Gemeinschaft der Organismusbiologen. Neben genomischen Daten erfordert das funktionelle Verständnis der Vielfalt der Fledermausanpassungen gewebespezifische Transkriptom- und Proteinanalysen, die oft separate Sammelprotokolle erfordern. Darüber hinaus ist die Kommunikation von Best Practices, wie bei allen taxonomischen Gruppen, während eine optimale Gewebesammlung und -konservierung für die Erstellung von Daten höchster Qualität für -omics-Analysen unerlässlich ist, aufgrund sich schnell ändernder Technologien und mehrere Forschungsteams, die unabhängig arbeiten.
Die Notwendigkeit, Best Practices für Fledermaus-Omics Forschung zu übernehmen ist besonders dringend, da viele Fledermausarten selten oder bedroht sind. Im Gegensatz zu anderen kleinen Säugetieren wie Nagetiere und Spitzmäuse, Fledermäuse sind langlebig, aufgrund außergewöhnlicher DNA-Reparatur-Mechanismen10 und langsame Fortpflanzung11, mit den meisten Arten, die Geburt nur eine oder (in einigen Fällen) zwei junge pro Jahr. Aus diesen Gründen, Fledermauspopulationen können langsam von Störungen zu erholen, und das Sammeln vieler Personen aus der Wildnis ist weder ratsam noch machbar. Mit anderen Worten, Protokolle müssen optimiert werden, um die maximale Datenmenge für eine einzelne Probe zu erhalten, wodurch die Notwendigkeit verringert wird, unnötigerweise Stichprobenzusazierarbeiten zu replizieren.
Dabei konzentriert sich dieses Protokoll speziell auf standardisierte Methoden zur Sammlung und Probenahme von Fledermausgewebe für genomische und transkriptomische Sequenzierungen und Proteinanalysen. Seine oberste Priorität ist es, sicherzustellen, dass Fledermausgewebe ethisch und verantwortungsvoll gesammelt werden, von der Genehmigung sverfahren für die Sammlung, Export von Geweben, die Minimierung von Stress auf das Tier, und langfristige Lagerungsbedingungen. Aufwendige Sezierungen wurden mit dem Ziel entwickelt, die Nützlichkeit der verschiedenen gesammelten Materialien zukunftssicher zu machen. Dieses Manuskript bietet eine Schritt-für-Schritt-Anleitung, um Fledermäuse auf humane Weise zu sammeln, die darauf abzielt, die Auswirkungen auf die Populationen zu minimieren und den wissenschaftlichen Wert zu maximieren. Während der Schwerpunkt dieses Protokolls ist speziell für den Einsatz bei Fledermäusen, viele der Schritte sind relevant für andere Wirbeltiere Taxa, vor allem Säugetiere.
Übersicht über die Gewebesammlung
Das Verfahren für die Gewebeentnahme, einschließlich der Lagertemperatur und der Wahl des Konservierungsmittels, wird durch die Art der geplanten nachgelagerten Analysen bestimmt. Es wird jedoch dringend empfohlen, dass, wenn möglich, Gewebe unter einer Reihe von Methoden gesammelt wird, um seinen zukünftigen Nutzen zu maximieren, auch wenn keine spezifische Analyse geplant ist. Im Allgemeinen wird Gewebe gesammelt und für nachfolgende Analysen von Nukleinsäuren (DNA und RNA) oder Proteinen konserviert. Für jede dieser Anwendungen kann Gewebe durch direktes Einfrieren in flüssigem Stickstoff (LN2) optimal konserviert werden. Ein sofortiges Eintauchen in LN2 ist jedoch nicht immer im Feld möglich. Mit fortschreitender Technologie werden Ressourcen wie spezialisierte Durchstechflaschen zur Speicherung von DNA und RNA bei Umgebungstemperaturen immer leichter verfügbar. Obwohl wir nicht alle derartigen Materialien in diesem Protokoll validiert haben, ermutigen wir andere Forscher, die Leistung neuer Materialien im Vergleich zu dem, was wir hier präsentieren, vergleichsweise zu analysieren. Wir bieten Methoden zur optimalen Gewebekonservierung für unterschiedliche Anwendungen in Situationen, in denen LN2 nicht zugänglich ist, z. B. wenn LN2-Transporte aufgrund des Standortzugangs über kleinfeines Flugzeug im Amazonas gebietnicht möglich sind. Darüber hinaus bieten wir eine Methode zum Sammeln von Gewebe, aus dem lebende Zellen angebaut und vermehrt werden können. Im Folgenden beschreiben wir die wichtigsten Überlegungen zur Materialsammlung für jeden dieser Zwecke und eine Übersicht über die Sammelmethoden finden Sie in Tabelle 1.
Gewebe für DNA
Für alle gesammelten Erntegewebe wird das Speichermedium bestimmen, ob es für die Standard- oder High-Molekular-Gewicht-DNA-Extraktion (HMW) verwendet werden kann. HMW ist für die lang gelesene Sequenzierung erforderlich und derzeit erforderlich, um Genomassemblys auf Chromosomenebene oder ein “Platinstandard”-Genom zu erzeugen. DNA mit niedrigem Molekulargewicht (LMW) kann aus Flash-Frozen, AllProtect (daher als “Gewebestabilisierungslösung” bezeichnet) oder sogar RNAlater (daher “RNA-Stabilisierungslösung”) konservierten Proben extrahiert werden (obwohl Blitz-Gefrierproben optimal bleiben ). DNA, die durch Standardlabormethoden isoliert wird (z. B. Kieselgel-Membran-Spin-Säulen, Phenol-Chlor-Form), kann immer noch DNA-Fragmente von bis zu 20 Kilobasen (kb) ergeben. Daher kann, sofern eine ausreichende Ausbeute vorhanden ist, diese Form der isolierten DNA für die Vorbereitung der Bibliotheksvorbereitung mit ein einsetzender Insert-Größe verwendet werden, bei der die Insert-Größe oft 500 Base-Pairs (bp) beträgt und kurze Sequenzlesungen von 100 bp12erzeugt werden. Diese DNA ist besonders nützlich für die “Resequenzierung” von Projekten oder Studien, bei denen keine Chromosomendaten in voller Länge benötigt werden. HMW DNA (10-150 kb) ist anspruchsvoller und kann nur zuverlässig mit Gewebe gewonnen werden, das in LN2 nach der Ernte schnell eingefroren und bis zur Extraktion bei einem Maximum von -80 °C gehalten wurde.
Niedriges Molekulargewicht oder fragmentierte DNA ist oft ausreichend für gezielte Ansätze, einschließlich Genverstärkung über PCR und kurzgelesene Sequenzierung13. PCR-basierte Untersuchungen mit LMW-DNA, die nur auf ein oder wenige Gene abzielen, waren sehr informativ, um die Anpassung und die molekulare Evolution der Fledermaus-Sensorik zu verstehen6,14, Physiologie15, Phylogenetik 5,16, und Konservierung17,18. Erfolgreiche gezielte Sequenzrückeroberung von niedermolekularem Gewicht und fragmentierter DNA wurde auch für zahlreiche Wirbeltiergruppen, einschließlich Fledermäuse19,nachgewiesen. Diese Methoden sind oft kostengünstig und minimal invasiv für die Fledermaus, wie Fäkalienproben und nicht-tödliche Gewebeprobenahme über bukkale Tupfer oder Flügelbiopsie Stempel sind auch häufige Möglichkeiten, um DNA für Niedrigmolekulargewicht Analysen zu erhalten20, 21.
Die Qualität hängt jedoch stark von der Art des Mediums ab, in dem die Probe gespeichert ist22. Nach systematischen und quantitativen Vergleichen von bukkalen Tupfern und Biopsieschlägen haben Flügelbiopsie-Punchs gezeigt, dass sie konstant höhere DNA-Werte ergeben und während der Sammlung weniger belastend für die Fledermaus während der Sammlung22waren. Diese Vergleiche zeigten auch, dass die besten Ergebnisse erzielt wurden, wenn der Flügelschlag in Indikator-Kieselsäure (d. h. einer Art Von-Deiccant aus Kieselgelperlen, die Farbe ändert, wenn Feuchtigkeit beobachtet wird) und nicht in anderen gängigen Speichermedien wie Ethanol oder DMSO22; andere Speichermedien einschließlich Gewebestabilisierungslösung wurden jedoch nicht untersucht. Flügelstanzen können auch verwendet werden, um Fibroblastenzellen in Kultur zu züchten, wie in Kacprzyk et al.23 und wie unten beschrieben (siehe Abschnitt 6). Für diese Methoden sollte der Flügel oder Uropatagium sanft verlängert werden, und ein sauberer Biopsie-Punch, typischerweise 3 mm Durchmesser, sollte verwendet werden, um die Probe zu erhalten. Dieser Ansatz scheint keine bleibenden Schäden zu verursachen, mit Narben Heilung über innerhalb von Wochen in den meisten Fällen24.
HMW DNA (10-150 kb) ist anspruchsvoller und wird derzeit nur zuverlässig mit Gewebe gewonnen, das in LN2 nach der Ernte schnell eingefroren und bis zur Extraktion bei einem Maximum von -80 °C gehalten wurde. HMW DNA (10-150 kb) ist entscheidend für die lang gelesene DNA-Sequenzierung und damit für die De-Novo-Genom-Montage. Während die meisten kommerziellen Kits verwendet werden können, um einige Standard-HMW-DNA zu isolieren, erfüllen die resultierenden Molekülgrößen oft nicht die Anforderungen von Sequenzierungstechnologien der dritten Generation [z. B. solche, die von Unternehmen wie Pacific Biosciences (PacBio) ins Leben gerufen wurden, Oxford Nanopore Technologies, und 10x Genomics, oder durch Montagemethoden von Bionano Genomics oder Dovetail Genomics]. Daher gibt es eine neue Nachfrage nach “ultra HMW” DNA (>150 kb). Bei der Beschaffung von Ultra-HMW-DNA von Fledermäusen, frische Proben von Leber, Gehirn, oder Muskel sind alle geeignet, aber diese müssen sofort flashgefroren in LN2 ohne Speicherpuffer oder Kryoprotektor. Eine vollständige Beschreibung dieser Schritte geht über den Rahmen dieses Papiers hinaus, ist aber an anderer Stelle verfügbar25.
Gewebe für RNA
RNA ist ein einsträngiges Molekül, das weniger stabil ist als DNA. Obwohl es viele Formen von RNA gibt, konzentrieren sich -omics-Analysen in der Regel auf mRNA (Messenger RNA) und kleine RNAs (z. B. microRNAs). Nach der Transkription wird die mRNA zu einem ausgereiften Transkript gespleißt, das keine Introns enthält und den kodierenden Teil von Genen/Genomen darstellt. Kodierungsgene machen einen winzigen Bruchteil der Genomgröße aus (1%-2%), was die Ausrichtung auf mRNA zu einem kostengünstigen Mittel zur Gewinnung von Sequenzdaten für Gene macht. MicroRNAs sind eine Klasse von RNAs, die den Prozess der Übersetzung von mRNA in Proteine regulieren und daher wichtige regulatorische Effektoren sind. RNA-Transkripte können einzeln oder häufiger für -omics-Analysen26,27,28,29,30, als Teil eines Transkriptoms sequenziert werden; d. h. die Summe aller RNA-Transkripte, die in einer bestimmten Probe vorhanden sind.
Die Sequenzierung kann nach mehreren Methoden (d.h. über kurzgelesene RNA-Seq oder lang gelesene ganze Isoform Seq) durchgeführt werden, was eine Analyse sowohl der RNA-Überfluss als auch der isoformen Verwendung ermöglicht. Da die Menge und Vielfalt der mRNA-Transkripte zwischen Zellen und Geweben variieren, ermöglicht die RNA-Sequenzierung das Studium und den Vergleich der Genexpression und -regulierung zwischen den Proben. Das Interesse an der Sequenzierung kleiner RNAs und der gesamten isoformen Sequenzierung wächst, da diese Methoden zunehmend biologisch informativer werden. Die Vorbereitung von Gewebeproben zur Sequenzierung verschiedener RNA-Klassen kann auf die gleiche Weise durchgeführt werden, wie in diesem Manuskript dargestellt, wobei nur die nachfolgenden Extraktionsmethoden31,32voneinander abweichen. Da Transkriptome eine hohe Abdeckung des Proteinkodierungsgenoms bieten, kann der zusammengesetzte Datensatz bei der Genommontage und -anmerkung nützlich sein, was die Sammlung von RNA-Seq-Daten über eine Reihe verschiedener Gewebe zu einem wichtigen Bestandteil der Bat1K-Initiative.
Im Gegensatz zur DNA ist rna chemisch instabil und auch zielgerichtet von RNase-Enzymen, die in Gewebelysaten als Abwehrstrategie gegen RNA-basierte Viren allgegenwärtig sind. Aus diesen Gründen beginnt die RNA-Fraktion in Zellen und Geweben kurz nach dem Zeitpunkt der Probenahme und/oder Euthanasie zu abbauen. Die Erhaltung der RNA erfordert daher Schritte, um ihren Abbau zu verhindern. Dazu gehört in der Regel die Konservierung von frisch gesammeltem Gewebe bei 4 °C in einem stabilisierenden Mittel wie einer RNA-Stabilisierungslösung zur Inaktivierung der in Geweben natürlich endenden RNasen, gefolgt vom Einfrieren für eine längerfristige Lagerung. Als bevorzugte Alternative kann Gewebe in LN2 eingefroren werden; Obwohl, wie oben erwähnt, der Transport von LN2 ins Feld und die Aufrechterhaltung von Konzentrationen, um das Auftauen des Gewebes zu verhindern, logistisch schwierig sein kann.
Gewebe für Protein
Proteinzusammensetzung und relative Häufigkeit variieren zwischen Zellen und Geweben in ähnlicher Weise wie das, was für RNA diskutiert wurde; Proteine sind jedoch im Durchschnitt stabiler als RNA. Die Proteinidentifikation mit Proteomik entspricht in der Regel einem Bruchteil und nicht der gesamten Proteinsequenz, kann aber Informationen über die Expression über Gewebe liefern und die vorhandenen Krankheitserreger charakterisieren. Da viele Proteinsequenzen bei Säugetieren konserviert werden, können Fledermausproben für Proteomik leicht mit konservierten menschlichen Proteinen kontaminiert werden, was sterile Protokolle (z. B. Handschuhe, Zangen) während der Entnahme erfordert. Während Das Flash-Freezing in LN2 der beste Weg ist, um den Abbau von Proteinen zu verhindern, sind die Verwendung von Trockeneis, -20 °C Gefrierschränken und sogar Eis geeignet, wenn es keine anderen Mittel gibt. Mit steigenden Temperaturen steigt auch das Risiko eines differentialen Proteinabbaus. Stabilisierungsmittel wie Gewebestabilisierungslösung sind wirksam bei der Erhaltung der Proteinfraktion von Geweben bei Raumtemperatur und eignen sich für die kurzfristige Konservierung (bis zu einer Woche), wenn das Flash-Freezing nicht lebensfähig ist.
Das enzymatische Profil eines gegebenen Gewebes beeinflusst direkt die Konservierung von Protein enden. Gewebe mit geringer enzymatischer Aktivität wie Muskel können Proteinprofile auch bei höheren Temperaturen in einem Haushalts-Gefrierschrank erhalten. Im Gegensatz dazu ist Lebergewebe enzymatisch reaktiv, und seine Proteine haben höhere Erniedrigungswahrscheinlichkeiten während der Zubereitung. Die wachsende Anzahl von Protokollen zur Gewinnung von humanen proteomischen Profilen aus formal-fixierten Paraffin-eingebetteten (FFPE)-Proben legt nahe, dass die Paraformaldehyd-Fixierung von Geweben eine kostengünstige Proteinkonservierung beim Einfrieren bei der Entnahme nicht machbar33,34. Obwohl in hohem Maße abhängig von Konservierungszeit und Zustand, Proteine wurden durch Immunhistochemie aus formalinfixierten, Ethanol-konservierten Fledermausproben35identifiziert. Dieser Ansatz ist nicht skalierbar für probenfreundliche Proben auf proteomischer Ebene, hebt aber das Potenzial hervor, dass formal fixiertes Fledermausgewebe Proteinprofile liefert, wenn das Flash-Freezing nicht verfügbar ist und andere Stabilisierende zu teuer sind.
Gewebe für die Zellkultur
Probenahmegewebe und Flash-Freezing bietet eine begrenzte Menge an Material zu verwenden, und sobald das Material verwendet wird, ist es nicht mehr verfügbar. Alternativ bieten Zellkulturen lebende Zellen, die sofort für zukünftige Studien verwendet oder konserviert werden können. Kulturen erleichtern auch die Expansion von Zellen, um die Ausbeute zu erhöhen, wenn Gewebeproben klein sind. Sie ist besonders nützlich in Fällen, in denen die Gewebesammlung begrenzt ist, wie z. B. Experimente mit seltenen Arten, bei denen nicht-tödliche Probenahmen unerlässlich sind und daher weitreichende Auswirkungen auf die Erhaltung haben. Beschrieben ist ein Protokoll, in dem Zellkultur durch nicht-tödliche Probenahme von Flügelmembrangewebe möglich ist, aber Kultivierung ist mit mehreren Gewebetypenmöglich 36,37. Das hier bereitgestellte Protokoll wählt für anhimante Zellen aus. Die Kombination von Quellgewebe und Wachstumsmedien macht dieses Protokoll geeignet, um Fibroblasten auszuwählen und anzubauen, aber auf Wunsch können alternative Protokolle verwendet werden, um für andere Zelltypen auszuwählen. Im Rahmen des Bat1K-Projekts wird vorausgesagt, dass bei seltenen und bedrohten Arten die nicht-tödliche Probenahme von Flügelmembranen und die Erweiterung von Proben über die Kultivierung unerlässlich ist, um das Volumen der DNA zu erzeugen, das für die verwendeten verschiedenen Technologien benötigt wird5 .
Fledermaus-Capture
Alle Menschen, die mit Fledermäusen umgehen, sollten von einem Fledermaus-kompetenten Forscher trainiert und gegen Tollwut mit einer Reihe von Pre-Exposition-Injektionen geimpft werden. Wenn gebissen, ist eine weitere Reihe von Post-Exposition-Injektionen noch notwendig. Zu den Standardmethoden für die Aufnahme von Fledermäusen gehören Nebelnetze (Abbildung 1) und Harfenfallen (Abbildung 2). Nebelnetze werden am häufigsten verwendet und sind ideal für Bereiche mit geringer bis mäßiger Aktivität, da sie die größte Sorgfalt für die Minimierung von Fledermausnot erfordern. Kleine Fledermäuse sind besonders anfällig und können an Stress sterben, wenn sie nicht schnell gepflegt werden. Häufige Netzinspektionen minimieren Fledermausverletzungen und Sterblichkeit sowie Schäden am Nebelnetz. Dieses Detail ist wichtig, weil die richtige Gewebesammlung erfordert, dass das Gewebe frisch ist, und unsachgemäße Aufmerksamkeit auf die Nebelnetze bei Fledermäusen kann zu unnötiger Sterblichkeit oder vorzeitiger Sterblichkeit führen, bevor der Forscher Proben richtig verarbeiten kann. Da mehrere Fledermäuse in einer Harfenfalle mit minimaler Not ruhen können, ist dieser Ansatz ideal für Bereiche mit hoher Fledermausaktivität, wie in der Nähe einer Höhle oder großer Roost. Detaillierte Anweisungen für die richtige Fledermauserfassung und Datenverarbeitung für die Sammlung von morphologischen und demografischen Informationen sind in den ergänzenden Methoden verfügbar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das in diesem Manuskript diskutierte Protokoll beschreibt die besten Probenahmeverfahren für verschiedene molekulare Analysen von Fledermäusen mit hohem Durchsatz. Alle erfolgreichen -omics-Studien erfordern qualitativ hochwertiges Gewebe, aber die Probenahme von Fledermausgewebe, sowie andere Nicht-Modellorganismen, tritt oft unter Feldbedingungen auf, die nicht auf die gleichen Standards wie die einer kontrollierten Laborumgebung eingestellt werden können. Probenahme findet häufig an abgelegenen Orten mit minimalen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Centro de Ecologa y Biodiversidad CEBIO, Erika Paliza, Miluska Sénchez, Jorge Carrera, Edgar Rengifo Vésquez, Harold Porocarrero Zarria, Jorge Ruz Leveau, Jaime Pecheco Castillo, Carlos Tello, Fanny Cornejo und Fanny Fernandez Melo für die Herstellung von Gewebe Sammlung in Peru möglich. Wir danken auch allen Mitgliedern der Grupo Jaragua und Yolanda Leon für die Möglichkeit der Gewebesammlung in der Dominikanischen Republik, sowie Bernal Rodriguez Hernandez, Bernal Matarrita und allen in der Biologischen Forschungsstation La Selva in Costa Rica für die Herstellung von Probenahme möglich. Wir danken Ella Lattenkamp & Lutz Wiegrebe für den Zugang und die Mustersammlung von Flügelschlägen von Phyllostomus Verfärbung Fledermäuse für die Zellkultur-Generation. Phyllostomus Verfärbungfledermäuse stammen aus einer Zuchtkolonie im Fachbereich Biologie II der Ludwig-Maximilians-Universität München. Die Genehmigung zum Halten und Züchten der Fledermäuse wurde vom Landesveterinäramt München erteilt. LMD, SJR, KTJD und LRY wurden von NSF-DEB 1442142 finanziert. LMD wurde von NSF-DEB 1838273 finanziert. LRY wurde vom NSF-PRFB 1812035 finanziert. SCV und PD wurden durch einen Max-Planck-Forschungsgruppenpreis und ein Human Frontiers Science Program (HFSP) Research Grant (RGP0058/2016) gefördert. SJR, JHTP und KTJD wurden vom Europäischen Forschungsrat (ERC Starting Grant 310482 [EVOGENO]) an SJR, ECT wurde durch stipendium des Europäischen Forschungsrats (ERC-2012-StG311000) finanziert.
Materials
| 1.5 mL Eppendorf Safelock tubes | Fischer Scientific | 10509691 | 1.5 mL sterile tubes used during cell culture protocol |
| 15 mL tubes | Sarstedt | 62,554,002 | 15 mL sterile tubes used during cell culture protocol |
| 2 mL cryovials | Thomas Scientific | 1154P75 | cryogenic vials for tissues to be stored in liquid nitrogen |
| 3-mm biopsy punch | Medline | MIL3332 | wing biopsy punch for cell culture |
| 6 well plate | Greiner | 83,392 | Culture vessle |
| Allprotect Tissue Reagent | Qiagen | 76405 | for fecal samples; tissue stabilizing solution |
| Cell counting slides for TC10/TC20 cell counter, dual chamber | Bio-Rad | 145-0011 | Chambers for the count cells using the automated cell counter TC20 by Bio-Rad |
| collagenase IV | Stemcell Technologies | 7909 | For dissociation of primary cells |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2650-5X5ML | Prevents crystalization of water during freezing of the cells. |
| DMEM–Dulbecco's Modified Eagle Medium | Thermo Fisher | 12491-015 | culture media |
| Dulbecco's PBS | Invitrogen | 14190169 | Balanced salt solution used for washing cells |
| Fetal bovine serum (FBS) | Fischer Scientific | 10270106 | Serum-supplement for in vitro cell culture of eukaryotic cells |
| Gentamycin sulfate salt | Sigma Aldrich | G1264-250MG | Antibiotic for culture media |
| Nalgene Mr. Frosty | Thermo Scientific | 5100-0050 | Freezing container which provides 1°C/min cooling rate |
| PARAFILM | Sigma | P7793 | Wrapping tubes etc for sealing |
| Penicillin-streptomycin (pen-strep), 100x | Invitrogen | 15140130 | Antibiotic for culture media |
| Phosphate-buffered saline (PBS) 10x, pH 7.4 | Thermo Fisher | 10010023 | salt buffer used for washes and storage of bone tissue; dilute to 10X using de-ionized water |
| RNAlater | Thermo Fisher | AM7021 | RNA stabilizing solution |
| RNAse away | Genetech | 83931-250mL | breaks down enzymes that lead to RNA degradation |
| Silica gel | Fisher Scientific | 7631-86-9 | dessicant agent |
| TC20 Automated Cell Counter | Bio-Rad | 1450102 | Automated cell counter |
| Trypan blue | Bio-Rad | 145-0013 | Cell stain used to assess cell viability |
| trypsin-EDTA | Sigma Aldrich | T4049 | For dissociation of cells during splitting |
References
- Jiao, W. B., Schneeberger, K. The impact of third generation genomic technologies on plant genome assembly. Current Opinion in Plant Biology. 36, 64-70 (2017).
- van Dijk, E. L., Jaszczyszyn, Y., Naquin, D., Thermes, C. The third revolution in sequencing technology. Trends in Genetics. 34 (9), 666-681 (2018).
- Lee, H., et al. Third-generation sequencing and the future of genomics. bioRxiv. , 048603 (2016).
- Mayjonade, B., et al. Extraction of high-molecular-weight genomic DNA for long-read sequencing of single molecules. BioTechniques. 62 (1), xv (2017).
- Teeling, E., et al. Bat biology, genomes, and the Bat1K project: To generate chromosome-level genomes for all living bat species. Annual Review of Animal Biosciences. 6 (12), 1-24 (2018).
- Jones, G., Teeling, E. C., Rossiter, S. J. From the ultrasonic to the infrared: molecular evolution and the sensory biology of bats. Frontiers in Physiology. 4 (117), 1-16 (2013).
- Vincenot, C. E., Florens, F. B. V., Kingston, T. Can we protect island flying foxes. Science. 355 (6332), 1368-1370 (2017).
- Blehert, D. S., et al. Bat white-nose syndrome: An emerging fungal pathogen?. Science. 323 (5911), 227 (2009).
- Foley, J., Clifford, D., Castle, K., Cryan, P., Ostfeld, R. S. Investigating and managing the rapid emergence of White Nose Syndrome, a novel, fatal, infectious disease of hibernating bats. Conservation Biology. 25 (2), 223-231 (2011).
- Foley, N. M., et al. Growing old, yet staying young: The role of telomeres in bats’ exceptional longevity. Science Advances. 4, (2018).
- Dammann, P. Slow aging in mammals—Lessons from African mole-rats and bats. Seminars in Cell and Developmental Biology. 70, 154-163 (2017).
- Tsagkogeorga, G., Parker, J., Stupka, E., Cotton, J. A., Rossiter, S. J. Phylogenomic analyses elucidate the evolutionary relationships of bats. Current Biology. 23 (22), 2262-2267 (2013).
- Rohland, N., Reich, D. C. o. s. t. -. e. f. f. e. c. t. i. v. e. high-throughput DNA sequencing libraries for multiplexed target capture. Genome Research. 22 (5), 939-946 (2012).
- Yohe, L. R., et al. Trpc2 pseudogenization dynamics in bats reveal ancestral vomeronasal signaling, then pervasive loss. Evolution. 71 (4), 923-935 (2017).
- Shen, B., Han, X., Zhang, J., Rossiter, S. J., Zhang, S. Adaptive evolution in the glucose transporter 4 gene Slc2a4 in Old World fruit bats (family: Pteropodidae). PLoS ONE. 7 (4), e33197 (2012).
- Rojas, D., Warsi, O. M., Dávalos, L. M. Bats (Chiroptera: Noctilionoidea) challenge a recent origin of extant neotropical diversity. Systematic Biology. 65 (3), 432-448 (2016).
- Vonhof, M. J., Russell, A. L. Genetic approaches to the conservation of migratory bats: a study of the eastern red bat (Lasiurus borealis). PeerJ. 3, e983 (2015).
- Korstian, J. M., Schildt, A. J., Bennett, V. J., Williams, D. A., Hale, A. M. A method for PCR-based identification of bat species from fecal samples. Conservation Genetics Resources. 7 (4), 803-806 (2015).
- Bailey, S. E., et al. The use of museum samples for large-scale sequence capture: A study of congeneric horseshoe bats (family Rhinolophidae). Biological Journal of the Linnean Society. 117 (1), 58-70 (2016).
- Boston, E. S. M., et al. Empirical assessment of non-invasive population genetics in bats: Comparison of DNA quality from faecal and tissue samples. Acta Chiropterologica. 14 (1), 45-52 (2012).
- Puechmaille, S. J., Mathy, G., Petit, E. J. Good DNA from bat droppings. Acta Chiropterologica. 9 (1), 237-249 (2007).
- Corthals, A., et al. From the field to the lab: Best practices for field preservation of bat specimens for molecular analyses. PLoS ONE. 10 (3), 1-12 (2015).
- Kacprzyk, J., Teeling, E. C., Kelleher, C., Volleth, M. Wing membrane biopsies for bat cytogenetics: Finding of 2n = 54 in Irish Rhinolophus hipposideros (Rhinolophidae, Chiroptera, Mammalia) supports two geographically separated chromosomal variants in Europe. Cytogenetic and Genome Research. 148 (4), 279-283 (2016).
- Greville, L. J., Ceballos-Vasquez, A., Valdizón-Rodríguez, R., Caldwell, J. R., Faure, P. A. Wound healing in wing membranes of the Egyptian fruit bat (Rousettus aegyptiacus) and big brown bat (Eptesicus fuscus). Journal of Mammalogy. 99 (4), 974-982 (2018).
- Green, M. R., Sambrook, J. Isolation and quantification of DNA. Cold Spring Harbor Protocols. 6 (6), 403-414 (2018).
- Shaw, T. I., et al. Transcriptome sequencing and annotation for the Jamaican fruit bat (Artibeus jamaicensis). PLoS one. 7 (11), e48472 (2012).
- Seim, I., et al. Genome analysis reveals insights into physiology and longevity of the Brandt’s bat Myotis brandtii. Nature communications. 4, 2212 (2013).
- Lei, M., Dong, D., Mu, S., Pan, Y. H., Zhang, S. Comparison of brain transcriptome of the greater horseshoe bats (Rhinolophus ferrumequinum) in active and torpid episodes. PLoS ONE. 9 (9), (2014).
- Lee, A. K., et al. De novo transcriptome reconstruction and annotation of the Egyptian rousette bat. BMC Genomics. 16 (1), 1-11 (2015).
- Francischetti, I. M. B., et al. The “Vampirome”: Transcriptome and proteome analysis of the principal and accessory submaxillary glands of the vampire bat Desmodus rotundus, a vector of human rabies. Journal of Proteomics. 82, 288-319 (2013).
- Wen, M., et al. Exploring the genome and transcriptome of the cave nectar bat Eonycteris spelaea with PacBio long-read sequencing. GigaScience. (September), 1-8 (2018).
- Gonzalez-Garay, M. L. Introduction to isoform sequencing using pacific biosciences technology (Iso-Seq). Transcriptomics and Gene Regulation. , 141-160 (2016).
- Paulo, J. A., Lee, L. S., Banks, P. A., Steen, H., Conwell, D. L. Proteomic analysis of formalin-fixed paraffin-embedded pancreatic tissue using liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). Pancreas. 41 (2), 175 (2012).
- Wiśniewski, J. R. Proteomic sample preparation from formalin fixed and paraffin embedded tissue. Journal of visualized experiments: JoVE. (79), (2013).
- Sadier, A., et al. Evidence for multifactorial processes underlying phenotypic variation in bat visual opsins. bioRxiv. , 300301 (2018).
- Sotero-Caio, C. G., et al. Integration of molecular cytogenetics, dated molecular phylogeny, and model-based predictions to understand the extreme chromosome reorganization in the Neotropical genus Tonatia (Chiroptera: Phyllostomidae). BMC Evolutionary Biology. 15 (1), 1-15 (2015).
- Baker, R. J., Hamilton, M. J., Parish, D. A. . Preparations of mammalian karyotypes under field conditions. , (2003).
- Song, H., Buhay, J. E., Whiting, M. F., Crandall, K. A. Many species in one: DNA barcoding overestimates the number of species when nuclear mitochondrial pseudogenes are coamplified. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (36), 13486-13491 (2008).
- Pooniya, S., Lalwani, S., Raina, A., Millo, T., Das Dogra, T. Quality and quantity of extracted deoxyribonucleic Acid (DNA) from preserved soft tissues of putrefied unidentifiable human corpse. Journal of Laboratory Physicians. 6 (1), 31 (2014).
- Camacho-Sanchez, M., Burraco, P., Gomez-Mestre, I., Leonard, J. A. Preservation of RNA and DNA from mammal samples under field conditions. Molecular Ecology Resources. 13, 663-673 (2013).
- Phelan, K., May, K. M. Basic techniques in mammalian cell tissue culture. Current Protocols in Cell Biology. 66 (1), 1 (2015).
- Database, J. S. E. Using a hemacytometer to count cells. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2018).
- Dávalos, L. M., Velazco, P. M., Warsi, O. M., Smits, P. D., Simmons, N. B. Integrating incomplete fossils by isolating conflicting signal in saturated and non-independent morphological characters. Systematic Biology. 63 (4), 582-600 (2014).
- Schroeder, A., et al. The RIN: An RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7, 1-14 (2006).
- Mueller, O., Lightfoot, S., Schroeder, A. RNA Integrity Number (RIN)-Standarization of RNA quality control. Nano. , 1-17 (2004).
- Leary, S., et al. . AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition. , (2013).
- Sampaio-Silva, F., Magalhães, T., Carvalho, F., Dinis-Oliveira, R. J., Silvestre, R. Profiling of RNA degradation for estimation of post morterm interval. PLoS ONE. 8 (2), (2013).
- Hecht, A. M., Braun, B. C., Krause, E., Voigt, C. C., Greenwood, A. D., Czirják, G. Plasma proteomic analysis of active and torpid greater mouse-eared bats (Myotis myotis). Scientific Reports. 5, 1-10 (2015).
- Ball, H. C., Levari-Shariati, S., Cooper, L. N., Aliani, M. Comparative metabolomics of aging in a long-lived bat: Insights into the physiology of extreme longevity. PLoS ONE. 13 (5), 1-20 (2018).
- Kacprzyk, J., et al. A potent anti-inflammatory response in bat macrophages may be linked to extended longevity and viral tolerance. Acta Chiropterologica. 19 (2), 219-228 (2017).
- Littlefair, J. E., Clare, E. L. Barcoding the food chain: from Sanger to high-throughput sequencing. Genome. 59 (11), 946-958 (2016).
- Phillips, C. D., et al. Microbiome analysis among bats describes influences of host phylogeny, life history, physiology and geography. Molecular Ecology. 21 (11), 2617-2627 (2012).
- Carrillo-Araujo, M., et al. Phyllostomid bat microbiome composition is associated to host phylogeny and feeding strategies. Frontiers in Microbiology. 6 (May), 1-9 (2015).
- Hughes, G. M., Leech, J., Puechmaille, S. J., Lopez, J. V., Teeling, E. C. Is there a link between aging and microbiome diversity in exceptional mammalian longevity?. PeerJ. 6, e4174 (2018).
- Pannkuk, E. L., et al. Fatty acid methyl ester profiles of bat wing surface lipids. Lipids. 49 (11), 1143-1150 (2014).
- Pannkuk, E. L., et al. Glycerophospholipid profiles of bats with white-nose syndrome. Physiological and Biochemical Zoology. 88 (4), 425-432 (2015).
