-Omics विश्लेषण और प्राथमिक सेल संस्कृति के लिए चमगादड़ के ऊतक संग्रह
Summary
यह जीनोमिक, ट्रांसक्रिप्टोमिक, और चमगादड़ के प्रोटीओमिक विश्लेषण के लिए इष्टतम ऊतक तैयार करने के लिए एक प्रोटोकॉल है जो जंगली में पकड़ा गया है। यह बल्ले पर कब्जा और विच्छेदन, ऊतक संरक्षण, और बल्ले ऊतक के सेल culturing के लिए प्रोटोकॉल भी शामिल है.
Abstract
उच्च थ्रूपुट अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों अग्रिम के रूप में, उच्च गुणवत्ता वाले ऊतक अधिग्रहण और संरक्षण के लिए मानकीकृत तरीकों गैर मॉडल जीवों के लिए इन तरीकों के विस्तार के लिए अनुमति देते हैं। चमगादड़ से ऊतक संग्रह का अनुकूलन करने के लिए प्रोटोकॉल की एक श्रृंखला उच्च थ्रूपुट अनुक्रमण दृष्टिकोण की एक श्रृंखला के लिए विकसित किया गया है। यहाँ रेखांकित चमगादड़, वांछित जनसांख्यिकी प्रत्येक बल्ले के लिए एकत्र किया जा करने के लिए, और अनुकूलित तरीकों ऊतक संग्रह के दौरान एक बल्ले पर तनाव को कम करने के लिए कब्जा करने के लिए प्रोटोकॉल हैं। विशेष रूप से रेखांकित ऊतक को प्राप्त करने के लिए (i) उच्च आणविक वजन जीनोमिक विश्लेषण के लिए डीएनए, (ii) ऊतक-विशिष्ट ट्रांसक्रिप्टम के लिए आरएनए, और (iii) प्रोटीओमिक स्तर के विश्लेषण के लिए प्रोटीन प्राप्त करने के लिए तरीके हैं। अंत में, यह भी रेखांकित विंग क्लिप से व्यवहार्य प्राथमिक सेल संस्कृतियों बनाने के द्वारा घातक नमूना से बचने के लिए एक तरीका है. इन तरीकों की एक केंद्रीय प्रेरणा प्रत्येक बल्ले के लिए संभावित आणविक और रूपात्मक डेटा की मात्रा को अधिकतम करने और ऊतकों को संरक्षित करने के लिए इष्टतम तरीके सुझाने के लिए है ताकि वे भविष्य में विकसित नए तरीकों के रूप में अपने मूल्य को बनाए रखें। यह मानकीकरण विशेष रूप से महत्वपूर्ण हो गया है क्योंकि क्रोमोसोम स्तर, दुनिया भर में प्रजातियों के त्रुटि-मुक्त जीनोम के अनुक्रम के लिए पहल उभरा है, जिसमें कई वैज्ञानिक दलों विभिन्न वर्गीकरण के अनुक्रमण का नेतृत्व कर रहे हैं समूहों. प्रोटोकॉल यहाँ उल्लिखित आदर्श ऊतक संग्रह और Bat1K के लिए ऊतक संरक्षण विधियों को परिभाषित, संघ है कि बल्ले की हर प्रजाति के जीनोम अनुक्रमण है.
Introduction
उच्च थ्रूपुट अनुक्रमण (एचटीएस) तरीकों तेजी से दक्षता में उन्नत और लागत में कमी आई है, और यह सैकड़ों या नमूने के हजारों के लिए इन तरीकों पैमाने पर करने के लिए अब संभव है. इन प्रौद्योगिकियों के अनुप्रयोग द्वारा प्राप्त अंतर्दृष्टि का अनेक वैज्ञानिक विषयों में, बायोमेडिसिन से लेकर विकास तथा पारिस्थितिकी1,2,3तक बहुत अधिक प्रभाव पड़ता है . फिर भी, कई एचटीएस अनुप्रयोगों एक जीवित स्रोत से उच्च गुणवत्ता न्यूक्लिक एसिड पर गंभीर रूप से भरोसा करते हैं. यह सीमा लंबी अवधि के अणुओं के आधार पर तीसरी पीढ़ी अनुक्रमण के विकास के साथ तेजी से समस्याग्रस्त होने की संभावनाहै 4. इन कारणों के लिए, प्रयोगशाला के बाहर जंगली जीवों से ताजा ऊतक नमूने इकट्ठा करने के लिए सर्वोत्तम प्रथाओं की स्थापना पर ध्यान केंद्रित करने की जरूरत है, जो सामग्री की उपयोगिता को अधिकतम करता है और व्यक्तियों की संख्या को कम करता है जो होने की आवश्यकता है एकत्र.
Bat1K गुणसूत्र स्तर विधानसभा5के लिए बल्ले की हर प्रजाति के जीनोम अनुक्रम करने के लिए एक सतत पहल के साथ वैज्ञानिकों का एक अंतरराष्ट्रीय संघ है। चमगादड़ स्तनधारी विविधता का 20% का प्रतिनिधित्व करते हैं और असाधारण अनुकूलन है कि उम्र बढ़ने को समझने के लिए निहितार्थ हैं, रोग पारिस्थितिकी, संवेदी जीव विज्ञान, और चयापचय5,6. कई चमगादड़ भी खतरे में हैं या मानव शोषण के कारण खतरे मेंहैं 7 या तेजी से रोगजनकों के कारण गिरावट आ रही है8,9, और जीनोम स्तर अनुक्रमण इन प्रजातियों के संरक्षण के लिए बहुत महत्व का है. हालांकि Bat1K वर्तमान में सभी चमगादड़ प्रजातियों के जीनोम अनुक्रम करना है, उच्च गुणवत्ता वाले जीनोम अनुक्रम के लिए ऊतक के नमूने के संग्रह के मानकीकरण जीव जीव के समुदाय भर में एक प्रमुख चुनौती बनी हुई है. जीनोमिक डेटा के अलावा, चमगादड़ रूपांतरों की विविधता के कार्यात्मक समझ ऊतक विशेष transcriptome और प्रोटीन विश्लेषण की आवश्यकता है, अक्सर अलग संग्रह प्रोटोकॉल की आवश्यकता होती है. इसके अलावा, सभी वर्गीकरण समूहों के साथ के रूप में, जबकि इष्टतम ऊतक संग्रह और संरक्षण के लिए उच्चतम गुणवत्ता डेटा प्राप्त करने के लिए आवश्यक है -omics विश्लेषण, सर्वोत्तम प्रथाओं संवाद अक्सर क्योंकि तेजी से बदलते प्रौद्योगिकियों के लिए मुश्किल है और कई अनुसंधान टीमों स्वतंत्र रूप से काम कर रहे.
कई चमगादड़ प्रजातियों दुर्लभ या धमकी दी है कि यह देखते हुए बल्ले -omics अनुसंधान के लिए सर्वोत्तम प्रथाओं को अपनाने की जरूरत है, विशेष रूप से जरूरी है। ऐसे कृन्तकों और shrews के रूप में अन्य छोटे स्तनधारियों के विपरीत, चमगादड़ लंबे समय तक रहते हैं, असाधारण डीएनए मरम्मत तंत्र के कारण10 और धीमी प्रजनन11,सबसे प्रजातियों सिर्फ एक को जन्म देने के साथ या (कुछ मामलों में) प्रति वर्ष दो युवा. इन कारणों के लिए, बल्ले आबादी अशांति से उबरने के लिए धीमी गति से किया जा सकता है, और जंगली से कई व्यक्तियों को इकट्ठा न तो उचित है और न ही संभव है. दूसरे शब्दों में, प्रोटोकॉल एक नमूना के लिए डेटा की अधिकतम राशि प्राप्त करने के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए, जिससे अनावश्यक रूप से नमूना प्रयासों को दोहराने की आवश्यकता को कम करने.
यहाँ, इस प्रोटोकॉल संग्रह और जीनोमिक और ट्रांसक्रिप्टोमिक अनुक्रमण और प्रोटीन विश्लेषण के लिए बल्ले ऊतक के नमूने के लिए मानकीकृत तरीकों पर विशेष रूप से केंद्रित है. इसकी सर्वोच्च प्राथमिकता यह सुनिश्चित करना है कि चमगादड़ के ऊतकों को नैतिक और जिम्मेदारी से एकत्र किया जाए, संग्रह के लिए अनुमति प्रक्रिया से लेकर, ऊतकों के निर्यात को पशु को तनाव को कम करने के लिए, और दीर्घकालिक भंडारण की स्थिति। भविष्य में एकत्र विभिन्न सामग्रियों की उपयोगिता को प्रूफ करने के उद्देश्य से विस्तृत विच्छेदन विकसित किए गए हैं। इस पांडुलिपि एक मानवीय तरीका है कि आबादी पर प्रभाव को कम करने और वैज्ञानिक मूल्य को अधिकतम करने का इरादा है में चमगादड़ इकट्ठा करने के लिए एक कदम दर कदम गाइड प्रदान करता है. जबकि इस प्रोटोकॉल का ध्यान चमगादड़ में उपयोग के लिए विशेष रूप से है, कदम के कई अन्य कशेरुकी taxa, विशेष रूप से स्तनधारियों के लिए प्रासंगिक हैं.
ऊतक संग्रह अवलोकन
ऊतक संग्रह के लिए प्रक्रिया, भंडारण के लिए तापमान और संरक्षण एजेंट के विकल्प सहित, किसी भी बहाव विश्लेषण की योजना बनाई की प्रकृति द्वारा निर्धारित किया जाएगा. हालांकि, यह दृढ़ता से सिफारिश की है कि, जब संभव हो, ऊतक तरीकों की एक श्रृंखला के तहत एकत्र की है अपनी भविष्य उपयोगिता को अधिकतम भले ही कोई विशिष्ट विश्लेषण की योजना बनाई है. सामान्य में, ऊतक एकत्र और या तो न्यूक्लिक एसिड (डीएनए और आरएनए), या प्रोटीन के बाद विश्लेषण के लिए संरक्षित किया जाता है। इन अनुप्रयोगों में से प्रत्येक के लिए, ऊतक बेहतर तरल नाइट्रोजन (LN2) में सीधे फ्लैश ठंड से संरक्षित किया जा सकता है. हालांकि, LN2 में तत्काल विसर्जन हमेशा क्षेत्र में संभव नहीं है. प्रौद्योगिकी अग्रिम के रूप में, परिवेश के तापमान पर डीएनए और आरएनए स्टोर करने के लिए विशेष शीशियों जैसे संसाधन अधिक आसानी से उपलब्ध होते जा रहे हैं। जबकि हम इस प्रोटोकॉल में ऐसी सभी सामग्रियों को मान्य नहीं है, हम अन्य शोधकर्ताओं को प्रोत्साहित करने के लिए तुलनात्मक रूप से क्या हम यहाँ मौजूद के सापेक्ष नई सामग्री के प्रदर्शन का विश्लेषण. हम आदर्श स्थितियों में जहां LN2 पहुँचा नहीं जा सकता है में विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए ऊतक को संरक्षित करने के लिए तरीके प्रदान करते हैं, उदाहरण के लिए, जब LN2 परिवहन अमेज़न में छोटे विमान के माध्यम से साइट का उपयोग करने के कारण संभव नहीं है. इसके अलावा, हम ऊतक इकट्ठा करने के लिए एक विधि प्रदान करते हैं जिसमें से जीवित कोशिकाओं को उगाया और प्रचारित किया जा सकता है। नीचे हम इन संबंधित प्रयोजनों में से प्रत्येक के लिए सामग्री एकत्र करने के लिए मुख्य विचारों की रूपरेखा और संग्रह विधियों का अवलोकन तालिका 1में दिया गया है।
डीएनए के लिए ऊतक
एकत्र सभी काटा ऊतक के लिए, भंडारण मीडिया निर्धारित करेगा अगर यह या तो मानक या उच्च आणविक वजन (HMW) डीएनए निष्कर्षण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. HMW लंबे समय से पढ़ने अनुक्रमण के लिए आवश्यक है और वर्तमान में गुणसूत्र स्तर जीनोम विधानसभाओं, या एक “प्लेटिनम मानक” जीनोम उत्पन्न करने के लिए आवश्यक है. कम आणविक वजन (LMW) डीएनए फ्लैश जमे हुए से निकाला जा सकता है, AllProtect (henceforth के रूप में संदर्भित “ऊतक स्थिर समाधान”), या यहां तक कि RNAlater (इसलिए “RNA स्थिर समाधान”)-संरक्षित नमूने (हालांकि फ्लैश जमे हुए नमूने इष्टतम रहते हैं ). डीएनए मानक प्रयोगशाला विधियों (उदा., सिलिका जेल झिल्ली स्पिन कॉलम, फिनोल-क्लोरोफॉर्म) द्वारा अलग, अभी भी $ 20 किलोबेस (केबी) तक के डीएनए टुकड़े उपज सकता है। इसलिए, बशर्ते वहाँ पर्याप्त उपज है, अलग डीएनए के इस रूप एकल डालने आकार पुस्तकालय की तैयारी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जिसमें डालने के आकार अक्सर है $500 आधार-जोड़ों (बीपी), और कम अनुक्रम के पढ़ता है $100 बीपी उत्पन्न कर रहे हैं12. यह डीएनए विशेष रूप से “पुन: अनुक्रमण” परियोजनाओं या अध्ययन जिसमें पूर्ण लंबाई गुणसूत्र डेटा की आवश्यकता नहीं है के लिए उपयोगी है। HMW डीएनए (10-150 kb) अधिक चुनौतीपूर्ण है और केवल मज़बूती से ऊतक है कि तेजी से फसल के बाद LN2 में जमे हुए फ्लैश किया गया है और निष्कर्षण तक -80 डिग्री सेल्सियस की एक अधिकतम पर बनाए रखा का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है.
कम आणविक वजन या खंडित डीएनए अक्सर लक्षित दृष्टिकोण के लिए पर्याप्त है, पीसीआर और कम पढ़ा अनुक्रमण13के माध्यम से जीन प्रवर्धन सहित. पीसीआर आधारित जांच LMW डीएनए का उपयोग कर कि केवल एक या कुछ जीन लक्ष्य अनुकूलन और बल्ले संवेदी जीव विज्ञान के आणविक विकास के बारे में अत्यधिक जानकारीपूर्ण किया गया है6,14, शरीर क्रिया विज्ञान15, phylogenetics 5,16, और संरक्षण17,18. सफल लक्षित अनुक्रम कम आणविक वजन और खंडित डीएनए के पुनः कब्जा भी चमगादड़19सहित कई कशेरुकी समूहों के लिए प्रदर्शन किया गया है. इन तरीकों अक्सर लागत प्रभावी और बल्ले के लिए न्यूनतम इनवेसिव हैं, के रूप में मल के नमूने और गैर घातक ऊतक नमूने buccal swabs या विंग बायोप्सी घूंसे के माध्यम से भी आम तरीके कम आणविक वजन विश्लेषण के लिए डीएनए प्राप्त करने के लिए कर रहे हैं20, 21|
तथापि, गुणवत्ता मीडिया के प्रकार पर काफी निर्भर करती है जिसमें नमूना22संग्रहीत किया जाता है। मुख swabs और बायोप्सी घूंसे के व्यवस्थित और मात्रात्मक तुलना के बाद, पंख बायोप्सी घूंसे डीएनए के लगातार उच्च स्तर उपज दिखाया गया है और संग्रह22के दौरान बल्ले के लिए कम तनावपूर्ण थे . इन तुलना ओंकार सिलिका में विंग पंच संरक्षित किया गया था जब सबसे अच्छा परिणाम प्राप्त किया गया था कि (यानी, सिलिका जेल मोती से बना desiccant का एक प्रकार है कि जब नमी मनाया जाता है रंग बदलता है) के बजाय अन्य लोकप्रिय भंडारण मीडिया में इस तरह के रूप में इथेनॉल या DMSO22; हालांकि, ऊतक स्थिरीकरण समाधान सहित अन्य भंडारण मीडिया की जांच नहीं की गई. विंग घूंसे भी संस्कृति में फाइब्रोब्लास्ट कोशिकाओं को विकसित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जैसे Kacprzyk एट अल में23 और के रूप में नीचे वर्णित (अनुभाग 6 देखें). इन तरीकों के लिए, विंग या uropatagium धीरे बढ़ाया जाना चाहिए, और एक साफ बायोप्सी पंच, आम तौर पर 3 मिमी व्यास में, नमूना प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए. इस दृष्टिकोण के लिए कोई स्थायी नुकसान का कारण प्रतीत होता है, ज्यादातर मामलों में सप्ताह के भीतर खत्म निशान के साथ24.
HMW डीएनए (10-150 kb) अधिक चुनौतीपूर्ण है और वर्तमान में केवल मज़बूती से ऊतक है कि तेजी से LN2 में जमे हुए फसल के बाद फ्लैश किया गया है और निष्कर्षण तक -80 डिग्री सेल्सियस की एक अधिकतम पर बनाए रखा का उपयोग कर प्राप्त की है. HMW डीएनए (10-150 kb) लंबे समय से पढ़ा डीएनए अनुक्रमण के लिए महत्वपूर्ण है और इसलिए de नोवो जीनोम विधानसभा के लिए. वास्तव में, जबकि सबसे वाणिज्यिक किट कुछ मानक HMW डीएनए को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जिसके परिणामस्वरूप अणु आकार अक्सर तीसरी पीढ़ी अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों की आवश्यकताओं को पूरा नहीं करते हैं जैसे, प्रशांत बायोसाइंसेज (PacBio) जैसी कंपनियों द्वारा शुरू की गई उन, ऑक्सफोर्ड नैनोपोर टेक्नोलॉजीज, और 10x जीनोमिक्स, या बायोनैनो जीनोमिक्स या Dovetail जीनोमिक्स द्वारा की पेशकश की विधानसभा तरीकों के माध्यम से]। इस तरह के रूप में, वहाँ के लिए एक नई मांग है “अल्ट्रा HMW” डीएनए (gt; 150 kb). जब चमगादड़ से अल्ट्रा HMW डीएनए प्राप्त करने, जिगर, मस्तिष्क, या मांसपेशियों के ताजा नमूने सभी उपयुक्त हैं, लेकिन इन तुरंत किसी भी भंडारण बफर या cryoprotectant बिना LN2 में जमे हुए फ्लैश किया जाना चाहिए. इन चरणों का पूर्ण विवरण इस काग़ज़ के दायरे से बाहर है लेकिनयहकहीं और उपलब्ध है।
आरएनए के लिए ऊतक
आरएनए एक एकल-स्लेड अणु है जो डीएनए की तुलना में कम स्थिर है। हालांकि आरएनए के कई रूप हैं, -omics विश्लेषण MRNA (संदेश आरएनए) और छोटे आरएनए (जैसे, microRNAs) पर ध्यान केंद्रित करते हैं। प्रतिलेखन के बाद, MRNA एक परिपक्व प्रतिलिपि है कि कोई introns शामिल हैं और जीन / जीनोम की कोडिंग भाग का प्रतिनिधित्व करता है बनाने के लिए spliced है. कोडिंग जीन जीनोम आकार (1%-2%) का एक छोटा सा अंश के लिए खाते हैं, लक्ष्य MRNA जीन के लिए अनुक्रम डेटा प्राप्त करने का एक लागत प्रभावी साधन बना रही है. MicroRNAs आरएनए का एक वर्ग है कि प्रोटीन में mRNA के अनुवाद की प्रक्रिया को विनियमित कर रहे हैं और इस प्रकार महत्वपूर्ण नियामक effectors हैं. आरएनए प्रतिलिपियों को व्यक्तिगत रूप से अनुक्रमित किया जा सकता है , या अधिक सामान्यतः -ओमिक्स विश्लेषण26,27,28,29,30, एक ट्रांसक्रिप्टोम के भाग के रूप में ; अर्थात, किसी दिए गए नमूने में मौजूद सभी आरएनए प्रतिलिपियों की कुल.
अनुक्रमण कई तरीकों का पालन किया जा सकता है (यानी, लघु पढ़ने के लिए आरएनए-सेक या लंबे समय से पढ़ा पूरे आइसोफॉर्म सेक के माध्यम से), दोनों आरएनए बहुतायत और समरूप उपयोग के विश्लेषण की अनुमति. के रूप में मात्रा और MRNA प्रतिलिपि की विविधता कोशिकाओं और ऊतकों के बीच भिन्न होता है, आरएनए अनुक्रमण यह संभव अध्ययन और नमूनों में जीन अभिव्यक्ति और विनियमन की तुलना करने के लिए बनाता है. अनुक्रमण में रुचि छोटे RNAs और पूरे आइसोफॉर्म अनुक्रमण बढ़ रहा है, के रूप में इन तरीकों तेजी से और अधिक जैविक रूप से जानकारीपूर्ण होते जा रहे हैं. आरएनए के विभिन्न वर्गों के अनुक्रम के लिए ऊतक के नमूने तैयार करने के रूप में इस पांडुलिपि में प्रस्तुत के रूप में एक ही तरह से किया जा सकता है, केवल बाद निष्कर्षण विधियों31,32भिन्न के साथ . अंत में, क्योंकि transcriptomes प्रोटीन-कोडिंग जीनोम के एक उच्च कवरेज सबसेट की पेशकश, इकट्ठे डेटासेट जीनोम विधानसभा और एनोटेशन में उपयोगी हो सकता है, विभिन्न ऊतकों की एक श्रृंखला भर में आरएनए-सेक डेटा का संग्रह बनाने का एक महत्वपूर्ण घटक Bat1K पहल.
डीएनए के विपरीत, आरएनए रासायनिक अस्थिर है और यह भी RNase एंजाइमों, जो सर्वव्यापक रूप से आरएनए आधारित वायरस के खिलाफ एक रक्षात्मक रणनीति के रूप में ऊतक lysates में मौजूद हैं द्वारा लक्षित है. इन कारणों के लिए, कोशिकाओं और ऊतकों में आरएनए अंश नमूना और / आरएनए के संरक्षण के लिए इसके क्षरण को रोकने के लिए कदम उठाने की आवश्यकता होती है। यह आम तौर पर एक स्थिर एजेंट में 4 डिग्री सेल्सियस पर ताजा एकत्र ऊतक के संरक्षण शामिल है आरएनए स्थिर समाधान के रूप में ऊतकों में स्वाभाविक रूप से मौजूद RNases निष्क्रिय करने के लिए, लंबी अवधि के भंडारण के लिए ठंड के बाद. एक पसंदीदा विकल्प के रूप में, ऊतक LN2 में जमे हुए फ्लैश किया जा सकता है; हालांकि जैसा कि ऊपर उल्लेख किया है, क्षेत्र में LN2 परिवहन और ऊतक thawing को रोकने के स्तर को बनाए रखने logically चुनौतीपूर्ण हो सकता है.
प्रोटीन के लिए ऊतक
प्रोटीन संरचना और सापेक्ष बहुतायत क्या आरएनए के लिए चर्चा की गई थी करने के लिए एक समान तरीके से कोशिकाओं और ऊतकों के बीच बदलती हैं; तथापि, प्रोटीन आरएनए की तुलना में औसतन अधिक स्थिर होते हैं। प्रोटीन पहचान proteomics का उपयोग कर आम तौर पर के एक अंश से मेल खाता है, और नहीं पूरे, प्रोटीन अनुक्रम, लेकिन यह ऊतकों में अभिव्यक्ति पर जानकारी की आपूर्ति और मौजूद रोगजनकों की विशेषता कर सकते हैं. के रूप में कई प्रोटीन दृश्यों स्तनधारियों भर में संरक्षित कर रहे हैं, proteomics के लिए बल्ले के नमूने आसानी से संरक्षित मानव प्रोटीन के साथ दूषित किया जा सकता है, बाँझ प्रोटोकॉल की आवश्यकता होती है (जैसे, दस्ताने, संदंश) संग्रह के दौरान. जबकि LN2 में फ्लैश फ्रीजिंग प्रोटीन की गिरावट को रोकने के लिए सबसे अच्छा तरीका है, सूखी बर्फ का उपयोग, -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर, और यहां तक कि बर्फ उपयुक्त हैं अगर कोई अन्य साधन नहीं हैं. जैसे-जैसे तापमान बढ़ता है, अंतर प्रोटीन टूटने का खतरा भी बढ़ जाता है। इस तरह के ऊतक स्थिरीकरण समाधान के रूप में स्थिर एजेंटों कमरे के तापमान पर ऊतकों के प्रोटीन अंश के संरक्षण में प्रभावी रहे हैं और अल्पकालिक संरक्षण के लिए उपयुक्त हैं (एक सप्ताह तक) जब फ्लैश फ्रीजिंग व्यवहार्य नहीं है.
दिए गए ऊतक की एंजाइमी प्रोफाइल उसमें प्रोटीन के संरक्षण को सीधे प्रभावित करती है। इस तरह की मांसपेशियों के रूप में कम एंजाइमी गतिविधि के साथ ऊतक भी एक घर फ्रीजर में उच्च तापमान पर प्रोटीन प्रोफाइल की रक्षा कर सकते हैं। इसके विपरीत, जिगर के ऊतकों enzymatically प्रतिक्रियाशील है, और इसके प्रोटीन तैयारी के दौरान अपमानजनक के उच्च संभावनाओं है. औपचारिक रूप से तय पैराफिन-एम्बेडेड (FFPE) नमूनों से मानव प्रोटीओमिक प्रोफाइल प्राप्त करने के लिए प्रोटोकॉल की बढ़ती संख्या से पता चलता है कि ऊतकों के paraformaldehyde फिक्सिंग कम लागत प्रोटीन संरक्षण के लिए वादा रखती है जब संग्रह पर ठंड नहीं है संभव33,34. हालांकि संरक्षण समय और स्थिति पर अत्यधिक निर्भर है, प्रोटीन formalin-फिक्स्ड, इथेनॉल संरक्षित चमगादड़ नमूनों से इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के माध्यम से पहचान की गई है35. इस दृष्टिकोण proteomic स्तर के नमूने के लिए स्केलेबल नहीं है, लेकिन औपचारिक रूप से तय चमगादड़ ऊतकों के लिए क्षमता पर प्रकाश डाला गया प्रोटीन प्रोफाइल उपज जब फ्लैश फ्रीजिंग अनुपलब्ध है और अन्य स्थिर एजेंटों बहुत महंगा कर रहे हैं.
सेल संस्कृति के लिए ऊतक
नमूना ऊतक और फ्लैश फ्रीजिंग सामग्री की एक सीमित राशि के लिए इस्तेमाल किया जा प्रदान करता है, और एक बार सामग्री का उपयोग किया जाता है, यह अब उपलब्ध नहीं है. वैकल्पिक रूप से, सेल संस्कृतियों लाइव कोशिकाओं है कि तुरंत इस्तेमाल किया जा सकता है या भविष्य के अध्ययन के लिए संरक्षित प्रदान करते हैं. संस्कृति भी कोशिकाओं के विस्तार की सुविधा के लिए उपज बढ़ाने के लिए जब ऊतक के नमूने छोटे हैं. यह विशेष रूप से उन मामलों में उपयोगी है जहां ऊतक संग्रह सीमित है, जैसे दुर्लभ प्रजातियों के साथ प्रयोग जिसमें गैर घातक नमूना आवश्यक है और इसलिए संरक्षण के लिए व्यापक निहितार्थ हैं। वर्णित एक प्रोटोकॉल है जिसमें कोशिका संस्कृति पंख झिल्ली ऊतक के गैर घातक नमूना के माध्यम से संभव है, लेकिन कई ऊतक प्रकार36,37के साथ culturing संभव है. यहाँ प्रदान किया गया प्रोटोकॉल अनुलग्न कक्षों के लिए चयन करता है. स्रोत ऊतक और विकास मीडिया का इस्तेमाल किया संयोजन इस प्रोटोकॉल का चयन करें और फाइब्रोब्लास्ट्स विकसित करने के लिए उपयुक्त बनाता है, लेकिन अगर वांछित, वैकल्पिक प्रोटोकॉल अन्य प्रकार के लिए चयन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. Bat1K परियोजना के संदर्भ में, यह भविष्यवाणी की है कि दुर्लभ और धमकी दी प्रजातियों के लिए, पंख झिल्ली के गैर घातक नमूना और culturing के माध्यम से नमूनों के विस्तार के लिए कई प्रौद्योगिकियों कार्यरत कई प्रौद्योगिकियों के लिए आवश्यक डीएनए की मात्रा उत्पन्न करने के लिए आवश्यक है5 .
चमगादड़ पर कब्जा
चमगादड़ों को संभालने वाले सभी लोगों को बल्ले-कांस्ट अनुसंधानकर्ता द्वारा प्रशिक्षित किया जाना चाहिए और रेबीज के खिलाफ पूर्व-एक्सपोजर इंजेक्शन की एक श्रृंखला के साथ टीका लगाया जाना चाहिए। अगर काट लिया, पोस्ट-एक्सपोजर इंजेक्शन की एक और श्रृंखला अभी भी आवश्यक है. चमगादड़ों को पकड़ने के मानक विधियों में कुहास जाल (चित्र 1) और वीणा जाल (चित्र 2) शामिल हैं . धुंध जाल सबसे अधिक इस्तेमाल किया और मध्यम गतिविधि के लिए कम के साथ क्षेत्रों के लिए आदर्श हैं, के रूप में वे बल्ले संकट को कम करने के लिए सबसे अधिक देखभाल की आवश्यकता है. छोटे चमगादड़ विशेष रूप से कमजोर होते हैं और तनाव से मर सकते हैं अगर जल्दी से नहीं होता है। लगातार नेट निरीक्षण बल्ले की चोट और मृत्यु दर को कम करने के साथ ही धुंध जाल को नुकसान. यह विस्तार महत्वपूर्ण है क्योंकि उचित ऊतक संग्रह ऊतक ताजा होने की आवश्यकता है, और चमगादड़ में धुंध जाल के लिए अनुचित ध्यान अनावश्यक मृत्यु या समय से पहले मृत्यु के लिए नेतृत्व कर सकते हैं इससे पहले कि शोधकर्ता ठीक से नमूने प्रक्रिया कर सकते हैं. क्योंकि कई चमगादड़ कम से कम संकट के साथ एक वीणा जाल में आराम कर सकते हैं, इस दृष्टिकोण उच्च बल्ले गतिविधि के साथ क्षेत्रों के लिए आदर्श है, जैसे एक गुफा या बड़े बसेरा के पास के रूप में. रूपात्मक और जनसांख्यिकीय जानकारी के संग्रह के लिए उचित चमगादड़ पर कब्जा और डेटा प्रसंस्करण के लिए विस्तृत निर्देश पूरक विधियों में उपलब्ध हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस पांडुलिपि में चर्चा किए गए प्रोटोकॉल में चमगादड़ों के विभिन्न उच्च-थ्रूपुट आण्विक विश्लेषणों के लिए सर्वोत्तम नमूना पद्धतियों का वर्णन किया गया है। सभी सफल -omics अध्ययन उच्च गुणवत्ता ऊतक की आवश्यकत?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम सेंट्रो डे इकोलॉजी वाई बायोडाइडिसिडैड CEBIO, एरिका पैलिज़ा, मिलुस्का सांचेज़, जॉर्ज कैरेरा, एडगर रेंगिफो वीज़, हेरोल्ड पोरोकैरेरो ज़रिया, जॉर्ज रुज़ लेवेउ, जैमे पेचेको कैस्टिलो, कार्लोस टेलो, फैनी कोर्नेजो, और फैनी फर्नान्डेज को धन्यवाद देते हैं। पेरू में संग्रह संभव. हम भी डोमिनिकन गणराज्य में ऊतक संग्रह संभव बनाने के लिए Grupo Jaragua और Yolanda Len के सभी सदस्यों को धन्यवाद, साथ ही Bernal Rodriguez Hernandez, Bernal Matarrita, और कोस्टा रिका में ला सेल्वा जैविक अनुसंधान स्टेशन में हर कोई बनाने के लिए, नमूना संभव है. हम सेल संस्कृति पीढ़ी के लिए Phyllostomus discolor चमगादड़ से उपयोग और पंख घूंसे के नमूना संग्रह के लिए एला Lattenkamp और Lutz Wiegrebe धन्यवाद. Phyllostomus discolor चमगादड़ म्यूनिख में लुडविग-मैक्सिमिलियन्स विश्वविद्यालय के विभाग जीव विज्ञान द्वितीय में एक प्रजनन कॉलोनी से उत्पन्न. म्यूनिख जिला पशु चिकित्सा कार्यालय द्वारा चमगादड़ों को रखने और प्रजनन करने की स्वीकृति जारी की गई थी। LMD, SJR, KTJD, और LRY NSF-डीईबी 1442142 द्वारा वित्त पोषित किया गया. एलएमडी NSF-DEB 1838273 द्वारा वित्त पोषित किया गया था. एलआरवाई को एनएसएफ-पीआरएफबी 1812035 द्वारा वित्त पोषित किया गया था। SCV और पीडी एक मैक्स प्लैंक अनुसंधान समूह पुरस्कार, और एक मानव फ्रंटियर्स विज्ञान कार्यक्रम (HFSP) अनुसंधान अनुदान (RGP0058/2016) द्वारा वित्त पोषित किया गया. SJR, JHTP, और KTJD यूरोपीय अनुसंधान परिषद द्वारा वित्त पोषित किया गया (ईआरसी शुरू अनुदान 310482 [EVOGENO]) SJR को सम्मानित किया, ईसीटी यूरोपीय अनुसंधान परिषद अनुदान (ईआरसी-2012-StG311000) द्वारा वित्त पोषित किया गया था।
Materials
| 1.5 mL Eppendorf Safelock tubes | Fischer Scientific | 10509691 | 1.5 mL sterile tubes used during cell culture protocol |
| 15 mL tubes | Sarstedt | 62,554,002 | 15 mL sterile tubes used during cell culture protocol |
| 2 mL cryovials | Thomas Scientific | 1154P75 | cryogenic vials for tissues to be stored in liquid nitrogen |
| 3-mm biopsy punch | Medline | MIL3332 | wing biopsy punch for cell culture |
| 6 well plate | Greiner | 83,392 | Culture vessle |
| Allprotect Tissue Reagent | Qiagen | 76405 | for fecal samples; tissue stabilizing solution |
| Cell counting slides for TC10/TC20 cell counter, dual chamber | Bio-Rad | 145-0011 | Chambers for the count cells using the automated cell counter TC20 by Bio-Rad |
| collagenase IV | Stemcell Technologies | 7909 | For dissociation of primary cells |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2650-5X5ML | Prevents crystalization of water during freezing of the cells. |
| DMEM–Dulbecco's Modified Eagle Medium | Thermo Fisher | 12491-015 | culture media |
| Dulbecco's PBS | Invitrogen | 14190169 | Balanced salt solution used for washing cells |
| Fetal bovine serum (FBS) | Fischer Scientific | 10270106 | Serum-supplement for in vitro cell culture of eukaryotic cells |
| Gentamycin sulfate salt | Sigma Aldrich | G1264-250MG | Antibiotic for culture media |
| Nalgene Mr. Frosty | Thermo Scientific | 5100-0050 | Freezing container which provides 1°C/min cooling rate |
| PARAFILM | Sigma | P7793 | Wrapping tubes etc for sealing |
| Penicillin-streptomycin (pen-strep), 100x | Invitrogen | 15140130 | Antibiotic for culture media |
| Phosphate-buffered saline (PBS) 10x, pH 7.4 | Thermo Fisher | 10010023 | salt buffer used for washes and storage of bone tissue; dilute to 10X using de-ionized water |
| RNAlater | Thermo Fisher | AM7021 | RNA stabilizing solution |
| RNAse away | Genetech | 83931-250mL | breaks down enzymes that lead to RNA degradation |
| Silica gel | Fisher Scientific | 7631-86-9 | dessicant agent |
| TC20 Automated Cell Counter | Bio-Rad | 1450102 | Automated cell counter |
| Trypan blue | Bio-Rad | 145-0013 | Cell stain used to assess cell viability |
| trypsin-EDTA | Sigma Aldrich | T4049 | For dissociation of cells during splitting |
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