زراعه وقياس الجنين والوليد العظام الطويلة Murine
Summary
هنا ، نقدم طريقه للثقافة المجرية السابقة للعظام طويلة murine في مرحلتي الجنين وحديثي الولادة ، ومناسبه لتحليل العظام والغضروف التنمية والتوازن في الظروف التي تسيطر عليها في حين تلخيص عمليه في الجسم المجري.
Abstract
العظام الطويلة هي هياكل معقده وديناميكية ، والتي تنشا من تعظم داخل التحجر عن طريق الغضروف المتوسط. الوصول المحدود إلى العظام البشرية السليمة يجعل استخدام نماذج الثدييات ، مثل الفار والفئران ، قيمه خاصه للنظر في جوانب مختلفه من نمو العظام والتوازن. بالاضافه إلى ذلك ، فان تطوير الاداات الوراثية المتطورة في الفئران يسمح باجراء دراسات أكثر تعقيدا لنمو العظام الطويل ويطلب التوسع في التقنيات المستخدمة لدراسة نمو العظام. هنا ، نقدم بروتوكولا مفصلا لثقافة العظام السابقة الجسم الفيفو ، والذي يسمح بدراسة العظام والغضروف بطريقه تسيطر عليها باحكام بينما يلخص معظم عمليه في الجسم المجري. الطريقة الموصوفة تسمح بثقافة مجموعه من العظام ، بما في ذلك عظم الساق ، عظم الفخذ ، وعظام المشط ، ولكننا نركز بشكل رئيسي علي الثقافة الظنبوبيه هنا. وعلاوة علي ذلك ، يمكن استخدامه بالاقتران مع التقنيات الأخرى ، مثل التصوير الحي الفاصل الزمني أو العلاج بالعقاقير.
Introduction
نمو الجهاز يجب ان يتم ضبطها باحكام لمنع ظهور اضطرابات النمو, وينطوي علي تنظيم أنواع متعددة من الخلايا, المسارات الجزيئية والمتقاطعة بين أجزاء مختلفه من الجسم. تقنيات التصوير ضرورية لمعالجه التغيرات التي تحدث مع مرور الوقت في الاجنه المتنامية ، في الظروف العادية ، وكذلك بعد الاضطراب المستحث في النظام. الاجنه مع النمو في الرحم ، مثل نماذج القوارض المستخدمة علي نطاق واسع ، تشكل تحديا إضافيا للتصوير الحي والعلاج من المخدرات ، والتي يمكن التغلب عليها جزئيا عن طريق استخدام تقنيات الثقافة المجرية السابقة. لتلخيص بنجاح في العمليات المجرية والحصول علي نتائج ذات مغزى ، يصبح من الضروري العثور علي الظروف المناسبة لزراعه لكل عضو أو الانسجه.
تنمو معظم عظام الهيكل العظمي الثدييات من خلال تعظم داخل التحجر ، حيث الغضروف الجنيني (تتالف من خلايا تسمي غضروفي) محركات النمو الطولي ويتم استبدال تدريجيا بالعظم. تحدث هذه العملية في لوحات النمو ، وتقع في نهاية العظام الطويلة ، حيث يمكن تمييز ثلاث مناطق: يستريح ، التكاثري ، وفرط التغذية1،2. أولا ، غضروفي الطليعة المستديرة في الانتقال إلى منطقه الراحة في الغضروفي عمودي الدراجات في المنطقة التكاثرية. خلال المرحلة التالية من التمايز ، وهذه غضروفي تصبح فرط التغذية والبدء في إفراز نوع X الكولاجين. الغضروفي المفرطة تنسق الخطوات التالية من التحجر: انها تفرز جزيئات الإشارات الرئيسية ، مثل عامل نمو النسيج الضام ، والبروتينات العظمية والقنفذ الهندي ، وتوجيه المعادن من المصفوفة ، وتجنيد الاوعيه الدموية إلى الجزء الأوسط من العظم ، وعند موت الخلايا المبرمج ، والسماح عظم (العظام تشكيل الخلية) لغزو المصفوفة لتشكيل مركز التحجر الابتدائي3،4. المصفوفة المعدنية تسهل تغلغل الاوعيه الدموية التي من خلالها عظم تهاجر لتحل محل هذا الغضروف المتدهور مع مصفوفة العظام5. معظم عظم تغزو مصفوفة الغضروف من البيريتشوندريوم ، طبقه ليفية التي يلتف الغضروف6. بدلا من ذلك ، فان نسبه من فرط الغضروفي قادره علي البقاء علي قيد الحياة والتفريق إلى عظم7،8،9. ويرجع الطول النهائي للعظام إلى النمو المتراكم للغضروف العابر ، الذي يعتمد معدل نموه بدوره علي عدد وحجم الغضروفي التضخمية ، وإنتاج مصفوفة10. بالاضافه إلى ذلك, وقد تبين مؤخرا ان مده المرحلة الاخيره تضخم يرتبط مع الطول النهائي للعظام11. ولذلك ، فان التنظيم المحكم لانتشار وتمايز هذه الخلايا مطلوب لضمان الحجم السليم للعظام.
علي الرغم من المعرفة الكبيرة التي اكتسبت علي مر السنتين علي تنظيم وتطوير لوحات النمو ، وتستند معظم هذه الاستنتاجات علي مراقبه الأقسام النسيجية الثابتة. يوفر المناديل الورقية معلومات قيمه حول هذه العملية ، ولكن يمكن ان تكون مليئه التحف الفنية ، لذلك لا يمكن ان تكون دائما تستخدم بشكل موثوق لتقدير التغيرات المورفولوجية أو حجم بين مراحل مختلفه. بالاضافه إلى ذلك ، مع نمو العظام هو عمليه ديناميكية ، والصور الثابتة ثنائيه الابعاد (2D) تقدم نظره محدوده في حركه الخلايا في لوحه النمو ، في حين ان التصوير الفاصل الزمني علي الانسجه الحية يمكن ان توفر معلومات قيمه عن سلوك غضروفي في لوحه النمو.
كل هذه القيود يمكن حلها باستخدام ثقافات العظام الجسم السابق. في حين تم تطوير بروتوكولات ثقافة العظام منذ بعض الوقت ، فقد تم تطبيقها بشكل محدود علي العظام الطويلة للمونين. معظم الدراسات استخدام العظام الفرخ بسبب المزايا التقنية التي تقدمها الفرخ نموذج12,13. طبقت ثقافات [ارغميك] (هواء/سائله واجهه) كان إلى فرخ [فيورس] جنينيه, اي كان حافظت في ثقافة ل 10 أيام14. الاداات الوراثية المتطورة المتاحة في الماوس جعل هذا النموذج جذابة جدا لاستخدامها في ثقافة العظام الجسم السابق. الدراسات التي استخدمت الفئران للنظر في نمو العظام عملت في الغالب مع عظام المشط15, ربما بسبب صغر حجمها والحصول علي اعداد أكبر لكل جنين16. علي الرغم من ان تعتبر تقليديا العظام الطويلة ، والمشط دخول الشيخوخة (تتميز بانخفاض الانتشار والتفاف من لوحه النمو17) في وقت سابق من العظام الطويلة الأخرى في الجسم الآخر ، التالي نموها المستمر السابق الفيفو لا تلخيص حقا في عمليه الجسم المجري. لأغراض هذه المادة ، وسوف نستخدم مصطلح عظام طويلة للعظام من مناطق الأطراف القريبة والمتوسطة. استخدمت العديد من الدراسات السابقة العظام murine طويلة ، مثل الساق ، في الثقافات السابقة المجرية ولاحظت نموا كبيرا في الغضروف ولكن التحجر قليلا18. كما استخدمنا الظنبوبي الثقافات مؤخرا ، أساسا لدراسة ديناميات غضروفي19. دراسات أخرى استخدمت رؤوس الفخذ من الفئران الصغيرة20 أو فقط الجزء البعيد من عظم الفخذ للثقافة21. بعض أكثر الاعمال الاخيره بنجاح الجمع بين الثقافة الحية السابقة من العظام الكامل مع التصوير الفاصل الزمني للحصول علي ثلاثه ابعاد (3d) الأفلام من غضروفي في انسجه الفار المعيشة22,23. وتمكن المؤلفون من مراقبه الاحداث التي لم يلاحظها أحد في السابق في أعاده ترتيب الغضروفي إلى المنطقة التكاثرية23 في مثال جيد للتطبيق المحتمل لثقافة العظام السابقة المجرية. والبديل ، اي تحليل الصور الثابتة ، يتطلب تقنيات غير مباشره ومعقده. وقد تجسد ذلك في دراسة أجريت مؤخرا لتقييم اهميه المستنسخات الموجهة عبر الطريق لنمو الغضروف ، حيث استخدمت التتبع الجيني مع سلالات الفئران متعددة ألوان المراسلة مع النمذجة الرياضية24. ولذلك ، فان ثقافة الجسم الحي السابق قد تساعد في اكتساب نظره ثاقبه علي العمليات الديناميكية بطريقه أسرع وأكثر وضوحا.
هنا ، نقدم طريقه للثقافة العظام الطويلة murine ، والتي يمكن الجمع بينها مع العلاجات الجزيئية المختلفة و/أو مع التصوير الحي الفاصل الزمني. يتكيف هذا البروتوكول مع الأساليب المستخدمة في التقارير السابقة15،18،25، ولكنه يعالج بعض القضايا الاضافيه ويركز علي عظام طويلة مثل عظم الساق ، بدلا من عظام المشط. وأخيرا ، فانه يستكشف إمكانات استخدام المقارنات المزدوجة القوية إحصائيا عن طريق ذبح العظام اليمني واليسرى بشكل منفصل في وجود مواد مختلفه.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد استخدمت العظام السابقين الجسم الحيوي أساليب الثقافة لبعض الوقت لتقييم بيولوجيا نمو العظام28, ولكن نادرا ما طبقت علي العظام الطويلة murine. مع تطوير تقنيات التصوير ، تقدم ثقافة العظام السابقة الفيفو طريقه جذابة لدراسة نمو العظام في الوقت الحقيقي في وضع يشبه بشكل وثيق في ظروف ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونود ان نشكر الكسندرا جوينر علي دعمها عندما تم إنشاء هذا البروتوكول ، Edwina McGlinn ويي تشنغ تشانغ لتقاسم حمض الريتينويك. ويدعم المعهد الأسترالي للطب التجديدي بمنح من حكومة ولاية فيكتوريا والحكومة الاستراليه.
Materials
| 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine | Santa Cruz | CAS 61135-33-9 | |
| 5-Bromo-2′-deoxyuridine | Sigma | B5002 | |
| 50mL Conical Centrifuge Tubes | Falcon | 352070 | |
| 60 mm TC-treated Center Well Organ Culture Dish, 20/Pack, 500/Case, Sterile | Falcon | 353037 | |
| Adobe Photoshop | Adobe | CS4 | |
| Ascorbic acid | Sigma | A92902 | |
| Base unit for the scope | Zeiss | 435425-9100-000 | |
| Betaglycerophosphate | Sigma | G9422 | |
| Binocular scope | Zeiss | STEMI-2000 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) fraction v | Roche/Sigma | 10735086001 | |
| DigiRetina 500 camera | Aunet | ||
| Dissection kit | Cumper Robbins | PFS00034 | |
| DMEM | Gibco | 11960044 | |
| DMSO | Sigma | D8418 | |
| Eppendorf 2-mL tubes | Eppendorf | 0030120094 | |
| Ethanol 96% | Merk | 159010 | |
| Forceps Dumont#5 Inox08 | Fine Science Tools | T05811 | |
| Heracell 150 CO2 incubator | Thermo Fisher | 51026282 | |
| Minimum Essential Medium Eagle | Sigma | M2279 | |
| Multiwell 24 well | Falcon | 353047 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | |
| Plastic pipettes 1mL Sterile Individually wrapped | Thermo | 273 | |
| Syringe filter 0.2 um | Life Sciences | PN4612 | |
| Terumo syringe 20 mL | Terumo | DVR-5174 | |
| Tretinoin (retinoic acid) | Sigma | PHR1187-3X | |
| Trinocular scope | Aunet | AZS400T |
References
- Long, F., Ornitz, D. M. Development of the endochondral skeleton. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (1), a008334 (2013).
- Mackie, E. J., Ahmed, Y. A., Tatarczuch, L., Chen, K. S., Mirams, M. Endochondral ossification: how cartilage is converted into bone in the developing skeleton. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 40 (1), 46-62 (2008).
- Goldring, M. B., Tsuchimochi, K., Ijiri, K. The control of chondrogenesis. Journal of Cellular Biochemistry. 97 (1), 33-44 (2006).
- Kronenberg, H. M. Developmental regulation of the growth plate. Nature. 423 (6937), 332-336 (2003).
- Mackie, E. J., Tatarczuch, L., Mirams, M. The skeleton: a multi-functional complex organ: the growth plate chondrocyte and endochondral ossification. The Journal of Endocrinology. 211 (2), 109-121 (2011).
- Maes, C., et al. Osteoblast precursors, but not mature osteoblasts, move into developing and fractured bones along with invading blood vessels. Developmental Cell. 19 (2), 329-344 (2010).
- Park, J., et al. Dual pathways to endochondral osteoblasts: a novel chondrocyte-derived osteoprogenitor cell identified in hypertrophic cartilage. Biology Open. 4 (5), 608-621 (2015).
- Yang, L., Tsang, K. Y., Tang, H. C., Chan, D., Cheah, K. S. Hypertrophic chondrocytes can become osteoblasts and osteocytes in endochondral bone formation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (33), 12097-12102 (2014).
- Zhou, X., et al. Chondrocytes transdifferentiate into osteoblasts in endochondral bone during development, postnatal growth and fracture healing in mice. PLoS Genetics. 10 (12), e1004820 (2014).
- Wilsman, N. J., Bernardini, E. S., Leiferman, E., Noonan, K., Farnum, C. E. Age and pattern of the onset of differential growth among growth plates in rats. Journal of Orthopaedic Research: Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 26 (11), 1457-1465 (2008).
- Cooper, K. L., et al. Multiple phases of chondrocyte enlargement underlie differences in skeletal proportions. Nature. 495 (7441), 375-378 (2013).
- Smith, E. L., Rashidi, H., Kanczler, J. M., Shakesheff, K. M., Oreffo, R. O. The effects of 1alpha, 25-dihydroxyvitamin D3 and transforming growth factor-beta3 on bone development in an ex vivo organotypic culture system of embryonic chick femora. PloS One. 10 (4), e0121653 (2015).
- Li, Y., Li, A., Junge, J., Bronner, M. Planar cell polarity signaling coordinates oriented cell division and cell rearrangement in clonally expanding growth plate cartilage. eLife. 6, (2017).
- Kanczler, J. M., Smith, E. L., Roberts, C. A., Oreffo, R. O. A novel approach for studying the temporal modulation of embryonic skeletal development using organotypic bone cultures and microcomputed tomography. Tissue Engineering. Part C, Methods. 18 (10), 747-760 (2012).
- Houston, D. A., Staines, K. A., MacRae, V. E., Farquharson, C. Culture of Murine Embryonic Metatarsals: A Physiological Model of Endochondral Ossification. Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).
- Abubakar, A. A., Noordin, M. M., Azmi, T. I., Kaka, U., Loqman, M. Y. The use of rats and mice as animal models in ex vivo bone growth and development studies. Bone & Joint Research. 5 (12), 610-618 (2016).
- Lui, J. C., et al. Differential aging of growth plate cartilage underlies differences in bone length and thus helps determine skeletal proportions. PLoS Biology. 16 (7), e2005263 (2018).
- Agoston, H., et al. C-type natriuretic peptide regulates endochondral bone growth through p38 MAP kinase-dependent and -independent pathways. BMC Developmental Biology. 7, 18 (2007).
- Rosello-Diez, A., Madisen, L., Bastide, S., Zeng, H., Joyner, A. L. Cell-nonautonomous local and systemic responses to cell arrest enable long-bone catch-up growth in developing mice. PLoS Biology. 16 (6), e2005086 (2018).
- Marino, S., Staines, K. A., Brown, G., Howard-Jones, R. A., Adamczyk, M. Models of ex vivo explant cultures: applications in bone research. BoneKEy Reports. 5, 818 (2016).
- Okubo, N., et al. Prolonged bioluminescence monitoring in mouse ex vivo bone culture revealed persistent circadian rhythms in articular cartilages and growth plates. PloS One. 8 (11), e78306 (2013).
- Hirota, K., et al. Live imaging analysis of the growth plate in a murine long bone explanted culture system. Scientific Reports. 8 (1), 10332 (2018).
- Romereim, S. M., Conoan, N. H., Chen, B., Dudley, A. T. A dynamic cell adhesion surface regulates tissue architecture in growth plate cartilage. Development (Cambridge, England). 141 (10), 2085-2095 (2014).
- Kaucka, M., et al. Oriented clonal cell dynamics enables accurate growth and shaping of vertebrate cartilage. eLife. 6, (2017).
- Alvarez, J., et al. TGFbeta2 mediates the effects of hedgehog on hypertrophic differentiation and PTHrP expression. Development (Cambridge, England). 129 (8), 1913-1924 (2002).
- De Luca, F., et al. Retinoic acid is a potent regulator of growth plate chondrogenesis. Endocrinology. 141 (1), 346-353 (2000).
- Stern, T., et al. Isometric Scaling in Developing Long Bones Is Achieved by an Optimal Epiphyseal Growth Balance. PLoS Biology. 13 (8), e1002212 (2015).
- Minkin, C., et al. Skeletal development and formation of osteoclast-like cells from in situ progenitors in fetal mouse metatarsals cultured in chemically defined medium. Bone and Mineral. 12 (3), 141-155 (1991).
- Erben, R. G. . Handbook of histology methods for bone and cartilage. , 99-117 (2003).
- Hu, D. P., et al. Cartilage to bone transformation during fracture healing is coordinated by the invading vasculature and induction of the core pluripotency genes. Development (Cambridge, England). 144 (2), 221-234 (2017).
- Fritton, S. P., McLeod, K. J., Rubin, C. T. Quantifying the strain history of bone: spatial uniformity and self-similarity of low-magnitude strains. Journal of Biomechanics. 33 (3), 317-325 (2000).
- Duncan, R. L., Turner, C. H. Mechanotransduction and the functional response of bone to mechanical strain. Calcified Tissue International. 57 (5), 344-358 (1995).
