La sclérose en plaques est une maladie démyélinisatrice inflammatoire sans traitement. L’analyse des tissus cérébraux fournit des indices importants pour comprendre la pathogénie de la maladie. Ici nous discutons la méthodologie et l’analyse en aval du tissu cérébral de SP rassemblée par un programme d’autopsie rapide unique en opération à la clinique de Cleveland.
Nous décrivons un programme rapide de don de tissus pour les personnes atteintes de sclérose en plaques (SEP) qui exige que les scientifiques et les techniciens soient sur appel 24 heures sur 24, 7 jours sur 7, 365 jours par année. Les participants consentent à faire don de leur cerveau et de leur moelle épinière. La plupart des patients ont été suivis par des neurologues au Cleveland Clinic Mellen Center for MS Treatment and Research. Leurs cours cliniques et les incapacités neurologiques sont bien caractérisés. Peu de temps après la mort, le corps est transporté au Centre d’imagerie de la SP, où le cerveau est scanné in situ par imagerie par résonance magnétique 3 T (IRM). Le corps est ensuite transféré à la salle d’autopsie, où le cerveau et la moelle épinière sont enlevés. Le cerveau est divisé en deux hémisphères. Un hémisphère est immédiatement placé dans une boîte de découpe et d’autres tranches de 1 cm d’épaisseur sont soit fixées en paraformaldéhyde de 4 % pendant deux jours, soit rapidement congelées dans de la glace sèche et 2 méthylbutane. Les tranches de cerveau à courte durée déterminée sont stockées dans une solution de cryoconservation et utilisées pour les analyses histologiques et la détection immunocytochimique des antigènes sensibles. Les tranches congelées sont stockées à -80 oC et utilisées pour les études moléculaires, immunocytochimiques et in situ d’hybridation/ARN. L’autre hémisphère est placé dans un paraformaldéhyde de 4 % pendant plusieurs mois, placé dans la boîte de découpe, rescanné dans le scanner à résonance magnétique 3 T (MR) et découpé en tranches d’un centimètre d’épaisseur. Les images m.in situ post mortem (IRM) sont co-enregistrées avec des tranches de cerveau de 1 cm d’épaisseur pour faciliter les corrélations IRM-pathologie. Toutes les tranches de cerveau sont photographiées et les lésions de matière blanche de cerveau sont identifiées. La moelle épinière est coupée en segments de 2 cm. Les segments alternatifs sont fixés dans 4% de paraformaldéhyde ou rapidement congelés. L’acquisition rapide de tissus post mortem de la SP permet des analyses pathologiques et moléculaires des cerveaux et de la moelle épinière de la SP et des corrélations pathologiques des anomalies de l’IRM cérébrale. La qualité de ces tissus post-mortem rapidement traités (habituellement dans les 6 h de la mort) est d’une grande valeur pour la recherche sur la SP et a donné lieu à de nombreuses découvertes à fort impact.
Une des meilleures façons d’étudier une maladie est d’examiner le tissu malade lui-même. Cela présente des défis pour ceux qui étudient les maladies du système nerveux central (SNC). Les biopsies du cerveau et de la moelle épinière malades sont extrêmement rares et impliquent habituellement des cas atypiques. Les taux d’autopsie chez les personnes atteintes de maladies du SNC ont considérablement diminué au cours des dernières années, et lorsqu’ils sont exécutés, ils n’assurent souvent pas l’approvisionnement rapide des tissus. Ces défis ont abouti à la création de banques cérébrales centrées sur la maladie, dont plusieurs ont porté sur la collecte de tissus auprès de personnes atteintes de sclérose en plaques (SEP). La SP est une maladie inflammatoire du SNC qui détruit la myéline, les oligodendrocytes (cellules formant la myéline), les neurones et les axones. La majorité des patients atteints de SP ont un cours de maladie bi-phasique qui commence par des épisodes d’incapacité neurologique avec un rétablissement variable qui évolue finalement en une maladie progressivement progressive qui est probablement neurodégénérative dans la nature1. Pour la majorité des cerveaux de SP donnés, les intervalles post mortem (PMI) entre la mort et le traitement des tissus dépassent 24 h. Bien que ces tissus aient fourni des informations précieuses sur les changements pathologiques dans les cerveaux de la SP, ils ne sont pas adaptés à des études moléculaires plus avancées qui peuvent fournir des informations puissantes sur la pathophysiologie de la maladie. C’est particulièrement le cas pour les études de profilage génétique, qui nécessitent un ARN intact.
Pour surmonter les limites mentionnées ci-dessus, nous avons développé un programme de don rapide de tissus qui permet l’IRM/corrélations pathologiques. Ce protocole fournit des tissus bien conservés adaptés aux études moléculaires modernes et permet une comparaison directe de la pathologie cérébrale et des anomalies de l’IRM dans le cerveau de la SP. Le Cleveland Clinic Multiple Sclerosis Tissue Donation Program existe depuis plus de 20 ans. Ce programme rapide de don de tissus procure des cerveaux et des moelles épinières à des personnes atteintes de SP et d’autres affections neurologiques auto-immunes associées. Le programme vise à obtenir des IRM in situ dans les 6 h suivant la mort, suivies de l’ablation du cerveau et de la moelle épinière pour le traitement des tissus.
recrutement
Les dons sont obtenus par consentement ante-mortem obtenu directement auprès de patients (pré-consentement) ou de parents proches après le décès. Les patients préconsents sont généralement identifiés à partir de la population clinique du Mellen Center for Multiple Sclerosis Treatment and Research à Cleveland, Ohio. Bien que la préférence dans le recrutement dans le programme rapide de don de tissus soit donnée aux patients qui ont été suivis dans des études de recherche longitudinales, il est ouvert à tous les patients vus au centre. Les participants qui s’inscrivent avant le décès reçoivent des instructions aux membres de la famille ou aux fournisseurs de soins de communiquer avec l’équipe de recherche, soit au moment du décès, soit lorsque le décès est considéré comme imminent. La deuxième méthode pour les personnes d’entrer dans le programme de don de tissus est au moment du décès par consentement de la plus proche parente. L’État de l’Ohio exige que les décès soient dirigés vers une organisation d’achat d’organes mandatée par le gouvernement fédéral, LifeBanc, qui opère dans 20 comtés du nord-est de l’Ohio. LifeBanc examine tous les décès pour un diagnostic de SP, ce qui est une exclusion pour le don d’organes. Des dispositions ont été prises pour que LifeBanc avise les enquêteurs du programme de don de tissus de SP pour tous les décès avec un diagnostic associé de SP se produisant dans un rayon de 75 milles de la clinique de Cleveland. Les proches et le personnel hospitalier sont ensuite contactés par le personnel du Programme de don de tissus et le consentement est obtenu pour le don de tissus cérébraux et de moelle épinière. Ces deux méthodes de recrutement ante-mortem et post-mortem par LifeBanc se traduisent par environ 10-12 dons de cerveau par an. Des ajustements sont apportés à la limite d’âge supérieure du décès pour gérer le nombre de renvois dérivés de LifeBanc.
Achat de dons
Le programme exige une couverture de 24 h, 365 jours par année par les membres du programme de don de tissus pour l’approvisionnement en tissus. L’équipe clinique utilise un système centralisé de notification de don de tissus par courriel/pager/appareil mobile pour les dons de tissus. LifeBanc reçoit des numéros pour communiquer avec le personnel de garde pour le programme de don de tissus. Les membres sont avisés du décès par les fournisseurs d’hôpitaux ou les proches (préconsents) ou par LifeBanc et d’autres sources d’aiguillage. Tout d’abord, une détermination de l’heure du décès et la faisabilité du don de tissus est faite. Les décès sont ensuite examinés pour des conditions qui peuvent entraîner des tissus de mauvaise qualité, y compris l’hypoxie pré-mortem prolongée, tissu cérébral destructeur massif (par exemple, une hémorragie intracrânienne importante, des accidents vasculaires cérébraux bihéssphériques étendus, une tumeur étendue charge de ventilateur prolongée ( 3 jours) et utilisation prolongée d’agents vasoactifs (3 jours) avant le décès. Lorsqu’un médecin légiste est impliqué dans un décès, le neurologue de l’étude peut parler avec le médecin légiste pour explorer un moyen de recevoir des tissus en temps opportun sans compromettre la responsabilité du médecin légiste. Si des tissus viables sont ressentis comme présents, le consentement écrit est obtenu (s’il n’est pas obtenu avant l’autopsie) et des préparatifs sont faits pour le transport du corps. Un service de transport décélérateur précédemment sous contrat est ensuite contacté pour le transport vers les installations d’IRM à la clinique de Cleveland. Il est fait attention de s’assurer que le corps reste à température ambiante et n’est pas placé en réfrigération, car des températures corporelles plus basses sont associées à des altérations des caractéristiques du signal d’IRM.
Antécédents cliniques
L’histoire clinique comprend des détails sur le diagnostic de la SP, l’enclence des symptômes, les traitements utilisés, les résultats des essais cliniques et paracliniques (potentiels évoqués, résultats du liquide céphalo-rachidien, tomographie de cohérence optique), la sclérose en plaques composite fonctionnelle , et l’élargissement de l’échelle de l’état d’invalidité (EDSS, réelle ou estimée), qui sont recueillies à partir du dossier médical (le cas échéant) et l’entrevue directe des plus proches parents. L’IRM pré-mortem est également collectée.
Nous décrivons un protocole qui a été utilisé pour obtenir et traiter rapidement les tissus de plus de 150 personnes atteintes de SP. Une caractéristique importante de ce protocole est que les scientifiques qui utilisent le tissu sont également en charge d’établir le protocole et d’effectuer la collecte des tissus. Cela permet de répondre aux besoins scientifiques des projets de recherche individuels. Plusieurs aspects de ce protocole améliorent son utilité. Les patients sont généralement bien caractérisés avant la mort, comme beaucoup d’entre eux ont été suivis par des neurologues à notre centre. Une étape critique est le traitement des dons de tissus peu de temps après la mort, ce qui augmente la qualité du tissu congelé par rapport à certaines autres banques de cerveau. Cela permet des études moléculaires qui sont d’une grande valeur dans la description des changements dans les produits géniques transcriptionnels et translationnels, qui sont essentiels pour la justification des observations histologiques et immunocytochimiques. L’exploitation des données morphologiques/immunocytochimiques et moléculaires dans de multiples cas améliore la fiabilité des conclusions. Ceci est le mieux illustré par notre description des changements de gène mitochondrial dans le cortex cérébral et les changements neuronaux de gène dans l’hippocampi demyelinated. De nouveaux protocoles de profilage génétique sont en cours de développement à un rythme rapide et le tissu congelé dans notre banque devrait fournir de l’ARN de haute qualité pour l’analyse des tissus et des cellules individuelles.
Un autre aspect précieux de notre protocole est les tranches de cerveau à court fixe. Ces tissus sont coupés en sections flottantes de 30 m d’épaisseur. Ces sections sont idéales pour l’utilisation de la microscopie confocale pour analyser deux ou plusieurs antigènes en trois dimensions. Les bons exemples incluent l’interaction des processus prémyélinéins d’oligodendrocyte avec des axones dystrophiques dans les lésions chroniques de MS, aussi bien que l’identification des raccordements axonaux simples aux ampoules de rétraction axonale transectées. Cela contraste avec l’utilisation systématique de sections de paraffine de 7 m d’épaisseur, où les images 3D ne sont pas réalisables. Les tissus incorporés à la paraffine ont une grande valeur pour certaines questions, en particulier la quantification des densités neuronales dans les sections hémisphériques de 7 m d’épaisseur. Nos protocoles de traitement des tissus sont donc diversifiés et offrent une flexibilité pour assurer des tissus fixes et rapidement congelés.
Une autre caractéristique unique de notre protocole est l’IRM du cerveau in situ post mortem. Les IRM cérébrales sont un biomarqueur irremplaçable de la sP. Il est donc essentiel d’établir les corrélations pathologiques des signaux d’IRM anormaux. Nos études ont établi que les DEUX T2 seulement et les ROI T2T1MTR sont souvent myélinisés. Cette conclusion soutient la nécessité de modalités d’imagerie plus spécifiques qui distinguent de façon fiable entre la matière blanche cérébrale myélinisée et demyelinated. MrI semble être sensible pour la détection de la myéline, mais nos études démontrent que même une combinaison de T1/T2/MTR n’est pas spécifique pour identifier la myélinisation. Notre protocole post mortem fournit une plate-forme idéale pour tester la capacité de nouvelles modalités d’imagerie à distinguer entre la matière blanche cérébrale myélinisée et la matière blanche cérébrale démyélinisée. L’IRM fournit également le véhicule idéal pour la traduction des résultats scientifiques de base dans la pratique clinique, étant donné l’utilisation de l’IRM dans notre recherche translationnelle et son utilisation clinique répandue chez les patients vivants.
Bien que la coupe de tranches courtes et longues ainsi que les tranches congelées offre un avantage pour le traitement des tissus dans plusieurs modes pour différentes études, il ya quelques limites avec cette méthode. L’évaluation de l’ensemble d’une structure peut être limitée, car certaines parties peuvent être traitées différemment sur des tranches adjacentes. Le grand volume de la banque de tissus, cependant, offre la possibilité d’étudier une structure d’intérêt dans plusieurs sujets pour améliorer l’échantillonnage. Une autre limitation générale aux études utilisant des tissus post mortem est qu’ils sont transversaux. Les conclusions concernant le moment et la progression des changements doivent être interprétées dans ce contexte. Il peut y avoir un biais de sélection pour les patients qui font don de leurs tissus, ce qui peut limiter la généralisation des données à tous les patients atteints de SP. Puisque la plupart des donneurs meurent des complications de la SP avancée, il peut ne pas être approprié d’extrapoler les résultats de ces patients à ceux des stades précoces de la SP. Néanmoins, nous avons reçu des tissus de patients plus jeunes qui sont morts de maladies non liées à la SP (c.-à-d. infarctus aigu du myocarde, surdose de drogue, suicide). La portée de notre protocole n’inclut pas l’échantillonnage d’autres organes (p. ex. gastro-intestinaux et moelle osseuse) qui ont été impliqués dans la SP. Nous croyons que les forces du programme l’emportent largement sur ses limites.
The authors have nothing to disclose.
Les auteurs tient également à remercier le Dr Christopher Nelson pour son aide éditoriale. Le programme d’autopsie est soutenu en partie par la subvention R35 NS097303 à BDT. Le travail dans le laboratoire de RD est soutenu par des subventions de NINDS (NS096148) et de la National Multiple Sclerosis Society, USA (RG 5298).
Antibodies | |||
Biotinylated goat anti-mouse IgG | Vector Laboratories | BA-9200 | 1:500 dilution for hemispheric; 1:1000 for 30µm free-floating. RRID: AB_2336171 |
Biotinylated goat anti-rabbit IgG | Vector Laboratories | BA-1000 | 1:500 dilution. |
Biotinylated goat anti-rat IgG | Vector Laboratories | BA-9400 | 1:500 dilution for hemispheric; 1:1000 for 30µm free-floating. RRID: AB_2336208 |
Glial fibrillary acid protein (GFAP) | Dako | Z0334 | 1:700 dilution for hemispheric. RRID: AB_10013382 |
HuR, mouse IgG, 3A2 clone | Santa Cruz | SC-5261 | 1:500 for 30µm free floating. RRID: AB_627770 |
Major histocompatibility complex (MHC) class II HLA-DR CR3/43 | Dako | Mo746 | 1:250 dilution for hemispheric; 1:500 for 30µm free floating. RRID: AB_2313661 |
Non-phosphorylated neurofilament (SMI32) | Biolegend | 801701 | 1:5000 dilution for hemispheric; 1:2500 for 30µm free-floating. RRID: AB_2564642 |
Phosphorylated neurofilament (SMI31) | Biolegend | 801601 | 1:5000 dilution for hemispheric; 1:2500 for 30µm free-floating. RRID: AB_2564641 |
Proteolipid protein (PLP) | Gift from Wendy Macklin | 1:250 dilution for IHC; alternative anti-PLP antibodies commercially available. | |
Reagents | |||
125 mm filter paper | Whatman | 1452-125 | For filtering PFA. |
50% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16320 | Electron microscopy grade. |
Cytoseal | ThermoScientific | 8310-16 | |
Ethylene glycol | Fisher Chemical | BP230-4 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G7893 | 400mL/2L Cryoprotection solution. |
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized | Millipore-Sigma | SLHV033RB | |
Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 19200 | Prills form. |
Polyvinylpyrolidone (PVP-40) | Fisher Chemical | BP220-212 | |
Sodium azide | Fisher Chemical | S227I | 2g/2L Sorenson's buffer. |
Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S0876 | 98.8g/2L Sorenson's buffer. |
Sodium phosphate mono basic monohydrate | Sigma-Aldrich | S9638 | 14.352g/2L Sorenson's buffer. |
Sucrose | Sigma-Aldrich | PVP40-500G | |
VectaStain ABC Kit | Vector Laboratories | PK-6100 | 1:1000 dilution of A and B. RRID: AB_2336819 |
Waterproof drawing black ink | Higgins | 44201 | |
Xylene | Fisher Chemical | X3S | Histological grade. |
Equipment | |||
3T MRI Magnetom Prisma | Siemens Healthineers | ||
7T MRI Agilent 830AS | Siemens Healthineers |