Induzindo a periodontite apical em camundongos

Summary

Aqui, nós apresentamos um protocolo para induzir localmente o periodontite apical nos ratos. Nós mostramos como perfurar um furo no dente do rato e expor sua polpa, a fim causar a inflamação local. Métodos de análise para investigar a natureza desta inflamação, tais como Micro-CT e histologia, também são demonstrados.

Abstract

Os mecanismos envolvidos na inflamação induzida local podem ser estudados usando vários modelos animais disponíveis. Uma delas é a indução da periodontite apical (AP). O periodontite apical é uma patologia comum de uma natureza inflamatório nos tecidos peridentais que cercam a raiz de dente. A fim compreender melhor a natureza e o mecanismo desta patologia é vantajoso executar o procedimento nos ratos. A indução desta inflamação odontogenic é conseguida perfurando no dente do rato até que a polpa dental esteja expor. Em seguida, a polpa dentária permanece exposta para ser contaminada pela flora oral natural ao longo do tempo, causando periodontite apical. Após este período de tempo, o animal é sacrificado, e o dente e o osso da mandíbula podem ser analisados de várias maneiras. As análises típicas incluem a imagem latente do Micro-CT (para avaliar o resorption do osso), a mancha histológica, Immunohistochemistry, e a expressão do RNA. Este protocolo é útil para a pesquisa no campo da biologia oral para compreender melhor este processo inflamatório em um ajuste in vivo experimental com circunstâncias uniformes. O procedimento exige uma manipulação cuidadosa dos ratos e da maxila isolada, e uma demonstração visual da técnica é útil. Todos os aspectos técnicos dos procedimentos que conduzem ao periodontite apical induzido e sua caracterização em um modelo do rato são demonstrados.

Introduction

O objetivo deste método é induzir o periodontite apical em um rato contaminando o vértice com a microflora natural, e para estudar então várias características deste processo patológico.

O periodontite apical (AP) é uma patologia comum de uma natureza inflamatório nos tecidos peridentais que cercam a raiz de dente. Esta doença dental pode causar a dor severa e deve ser tratada por um dentista. As opções do tratamento incluem o tratamento do canal de raiz (preliminar ou secundário), a cirurgia Endodontic, a extração do dente, ou a continuação dependendo dos resultados clínicos e radiográficos, e da opinião do clínico. O mecanismo desse processo inflamatório, embora estudado por várias décadas^{1,2,3, ainda}não é compreendido de forma compreensiva. Considerando a gravidade desta patologia, há, portanto, uma clara necessidade de pesquisa abordando sua natureza fundamental. Assim, os sistemas onde o estudo da AP é possível são de grande interesse científico.

Uma vez que o AP é um processo patológico complexo envolvendo os tecidos locais e o sistema imunológico, estudos in vitro são insuficientes para uma compreensão completa dos processos. O estudo de amostras clínicas desta doença também é problemático devido a limitações éticas e variabilidade significativa entre diferentes pessoas e diferentes estágios clínicos^4,5, e daí a necessidade de modelos in vivo. Esses modelos baseiam-se no conceito de expor a polpa dentária à contaminação e observar a reação inflamatória do corpo a esse estímulo nos tecidos periapicais^6,7. Os modelos comuns in vivo incluem roedores ou animais maiores, como cães. Apesar do desafio clínico no tratamento de camundongos, que são animais muito pequenos com dentes em miniatura, as vantagens do modelo do mouse são significativas: praticamente, trabalhar com camundongos é tecnicamente simples em termos de instalações e é mais rentável, e cientificamente, o camundongo é um modelo animal bem estudado, com ferramentas genéticas e moleculares prontamente disponíveis e um genoma bem estudado. De fato, estudos prévios utilizaram um modelo de camundongo para o estudo de sinais de reabsorção inflamatória e óssea e células envolvidas na periodontite apical^8,9,10,11. Conseqüentemente, um protocolo desobstruído em como usar um modelo do rato para o estudo do AP é necessário. Aqui, nós descrevemos tal protocolo.

O protocolo descrito aqui é tem a grande vantagem de ser apropriado para estudar knock-out (KO) camundongos e aprender como a falta de um gene específico afeta a inflamação dental^7,12. Outras aplicações úteis deste protocolo incluem o estudo dos efeitos dos medicamentos e as condições sistêmicas sobre o desenvolvimento da periodontite apical¹³, o efeito da periodontite apical no desenvolvimento de osteonecrose das mandíbulas^{14 , 15} e terapia com células-tronco para regeneração óssea¹⁶.

Este protocolo também pode ser generalizado como um modelo para estudar a inflamação local. Para estudar o processo inflamatório, vários modelos de mouse foram desenvolvidos, que incluem, por exemplo, colite induzida ou artrite^17,18. Estes modelos têm efeitos sistêmicos e não têm controle embutido no mesmo animal. Modelos para periodontite apical induzida, que incluem um controle contralateral sem inflamação, têm a vantagem de superar essas limitações^14,19.

O protocolo descrito abaixo é, portanto, útil para pesquisadores que estão interessados em processos inflamatórios locais. A natureza controlada desta inflamação, seu confinamento a um local específico, e o dente de controle contralateral, todos tornam este protocolo valioso para o estudo dos mecanismos envolvidos nesse processo. Além disso, o protocolo é útil para pesquisadores interessados nos aspectos clínicos da inflamação periapical. O modelo do camundongo é ideal para estudar diferentes variáveis da doença, além da vantagem de ser capaz de realizar facilmente manipulações genéticas no modelo do camundongo, para investigar a atividade de genes específicos na inflamação periapical.

Tecnicamente, o procedimento clínico é desafiador para realizar devido às pequenas dimensões dos dentes dos camundongos. Será benéfico para visualizar este procedimento, a fim de aprender sobre o posicionamento, equipamentos necessários, e desempenho.

Protocol

Todos os métodos aqui descritos foram aprovados pelo Comitê institucional de cuidado e uso de animais (IACUC) da Universidade Hebraica (ética não. MD-17-15093-5). 1. anestesia animal e posicionamento Prepare soluções estéreis conforme descrito abaixo. Prepare 5 mL de 7 mg/mL de cetamina e 0, 9 mg/mL de medetomidina diluído em solução tampão fosfato (PBS)/Saline. Prepare uma solução estéril de Atipamezol (0,4 mg/mL) diluída em PBS/soro fisiológico (r…

Representative Results

Um fluxograma das etapas experimentais é apresentado na Figura 1. Como mencionado no protocolo, os camundongos são anestesiados, e seu primeiro molar mandibular de um lado é perfurado até a exposição da polpa, enquanto o dente contralateral é deixado como um controle. Em seguida, os dentes são deixados para ser contaminado pela flora oral por 42 dias, durante o qual eles são monitorados e recebem medicação para a dor. Após 42 dias, os camundongos …

Discussion

Um método é introduzido aqui para a indução do periodontite apical nos ratos. O objetivo do método é explorar a condição de periodontite apical para estudar mecanismos e conseqüências desse processo inflamatório. O periodontite apical foi induzido em 6-8 ratos velhos da semana, uma idade em que as raizes são desenvolvidas inteiramente²⁴. A fim causar o periodontite apical neste modelo, a polpa de dente de molares mandibulares do rato é expor usando uma rebarba dental. Bac…

Materials

Atipamezole hydrochloride	Eurovet Animal Health	CAS 104075-48-1
ATR	dentsply	tecnika
blocking machine	Leica	EG1150H
buprenorphine	vetmarket	163451
clinical microscope/binocular	Olympus	Sz61
dental bur	Komet dental	ZR8801L 315 008
dental spatula	Premier	1003737
EDTA	J.T Baker	8993
entelan	mercury	1.07961
Eosin Y solution, alcoholic	SIGMA	HT110116
hematoxylin solution, Mayer's	SIGMA	MHS 16
Ketamine hydrochloride	Vetoquinol	CAS 1867-669
Medetomidine hydrochloride (cepetor)	CP-pharma GmbH	CAS 86347-15-1
Mepivacaine HCl 3%	Teva	CAS 96-88-8
microbrushes- adjustable precision applicators	PARKELL	S379
micro-ct scanner	scanco	uCT 40
parafin	Leica	39602004
PBS	SIGMA	D8537
PFA	EMS	15710
Chloramphenicol eye ointment (5%)	Rekah pharmaceutical	CAS 56-75-7
tweezers	WAM	Ref-CT
xylazine	Eurovet Animal Health	CAS 7361-61-7
xylene	Gadot	CAS 1330-20-7