인체 배설물 미생물에 대한 중재 식이요법의 효과를 추정하는 시험관 내 배치 배양 모델
Summary
이 프로토콜은 인체 배설물 미생물의 체외 배치 배양 발효 시스템을 설명하며, 이눌린(잘 알려진 프리바이오틱 및 가장 널리 연구된 미생물 변조기 중 하나)을 사용하여 특정 한 효과의 효과를 추정하는 데 이 시스템의 사용을 입증합니다. 대변 미생물 구성 및 대사 활동에 대한 개입.
Abstract
몇몇 인간적인 질병에 있는 창자 microbiome의 새로운 역할은 새로운 공구, 기술 및 기술의 돌파구를 요구합니다. 이러한 개선은 인간의 건강 혜택에 대 한 미생물 계전체 변조기의 활용을 해독 하는 데 필요한. 그러나, 미생물군유전체 변조를 검증하고 관련 건강상의 이점을 예측하기 위해 변조기의 대규모 스크리닝 및 최적화는 많은 수의 동물 및/또는 인간 피험자의 필요성으로 인해 실질적으로 어려울 수 있다. 이를 위해, 시험관내 또는 생체외 모델은 미생물군유전체 변조기의 예비 스크리닝을 용이하게 할 수 있다. 본 명세서에서, 프로바이오틱스, 프리바이오틱스 및 기타 식품 성분을 포함한 장내 미생물 군비암 변조기의 다양한 개입의 효과를 조사하는데 사용될 수 있는 생체내 배설물 미생물 배양 시스템을 최적화및 입증하였으며, 이외에도 건강 기능 식품 및 약물, 인간의 창 자 microbiota의 다양성과 구성에. 가장 널리 연구된 프리바이오틱 화합물 및 미생물군유전체 변조기 중 하나인 이눌린(Inulin)은 건강한 배설물 미생물 성분과 배설물 pH 및 유기산의 배설물 수준과 같은 대사 활동에 미치는 영향을 조사하기 위해 여기에 사용됩니다. 젖산 및 짧은 사슬 지방산을 포함 하 여 (SCFAs). 이 프로토콜은 배설물 미생물 프로필에 대한 변조기의 다양한 개입의 효과를 추정하고 건강에 미치는 영향을 예측하는 연구에 유용할 수 있습니다.
Introduction
인간 미생물은 박테리아, 고고학, 바이러스 및 진핵 미생물1로구성된 복잡한 커뮤니티로, 인체내외적으로 서식합니다. 최근 증거는 비만, 당뇨병을 포함한 다양한 인간 질병에서 창자 미생물과 장내 미생물군유전체 (인간 위장관에서 발견되는 미생물및 유전자의 전체 수집)의 근본적인 역할을 확립했습니다. 심혈관 질환,암 1,2,3. 또한, 우리의 창자에 살고있는 미생물은 크게 우리의 건강에 영향을 미치는 대사 산물의 넓은 스펙트럼을 생산하고 또한 여러 질병의 병리 생리학뿐만아니라 다양한 대사 기능에 기여할 수 4, 5.이 창자 미생물 집단의 구성 및 기능에 있는 이상한 변경 (섭동)은 일반적으로 “창자 dysbiosis”로 불거지됩니다. Dysbiosis는 일반적으로 호스트의 건강에 해로운 상태와 연관되고 그러므로 호스트의 건강한 통제 상태와 관련되었던 정상 (정규성) 미생물 공동체에서 분화될 수 있습니다. 창자 미생물 군비 병의 특정 패턴은 종종 다양한질병1, 2,3,6,7에서발견된다.
소화되지 않은 음식, 특히 발효 가능한 탄수화물/섬유의 발효는 에너지를 생산할 뿐만 아니라 짧은 사슬 지방산(SCFA), 젖산, 포메이트, 이산화탄소, 메탄, 수소 및 에탄올6. 또한, 장내 미생물은 엽산, 비오틴, 트리메틸아민-N-산화물, 세로토닌,트립토판, 감마-아미노부티르산, 도파민, 노르에피네프린, 아세틸콜린, 히스타민, 데옥시콜산, 4-에틸페닐 황산염. 이것은 주로 여러 신체 과정, 대사 기능 및 후생 유전학 변화에 기여하는 호스트 미생물 틈새 시장 내의 본질적인대사 플럭스의 활용을 통해 발생 1,8,9, 10. 그러나, 이러한 미생물 제품에 대한 다양한 개입의 효과는 쉽고 효율적이며 재현 가능한 프로토콜의 부족으로 인해 불분명하거나 불분명하게 남아 있습니다. 인간의 창 자 microbiota 구성은 매우 복잡 하 고 다양 한 생태계, 따라서, 인간의 건강 및 질병 병 리에 그것의 역할에 대 한 많은 질문 여전히 대답 남아. 장내 미생물의 조성 및 대사 기능에 대한 많은 일반적인 장내 미생물 군비세포 조절제(예: 프로바이오틱스, 프리바이오틱스, 항생제, 대변 이식 및 감염)의 효과는 대체로 애매합니다. 또한, 생체 내에서 이러한 효과의 검사 및 검증이 어렵다, 특히 장내 미생물에 의해 생성 된 영양소와 대사 산물의 대부분이 흡수 또는 동시에 그리고 창자에 신속하게 폐기되기 때문에; 따라서, 생체 내에서 이들 대사산물(예를 들어, SCFA)의 생산, 양 및 처리를 측정하는 것은 여전히 실질적인 과제로 남아 있다. 실제로, 동물과 인간 피험자와 같은 생리학적 모델은 장내 미생물군유전체의 역할과 숙주 건강에 대한 변조를 결정하는 데 중요하지만, 이로 인해 다양한 유형의 미생물군유전체 변조기의 대규모 스크리닝에는 적합하지 않을 수 있습니다. 윤리적, 금전적 또는 시간적 제약을 가할 수 있습니다. 이를 위해, 체외 및/또는 생체 내 생체 내 모델, 체외에서 창 자 microbiota의 배양 하 고 다음 다른 microbiota 변조기와 개입, 시간 및 비용 절약 기회를 제공할 수 있습니다 및 따라서 예비 또는 대규모 스크리닝을 허용할 수 있습니다. 다양 한 구성 요소 (프로바이오틱스 등, prebiotics, 그리고 다른 내정간섭 화합물) 검사/배설물 microbiota 다양성에 미치는 영향을 예측, 구성 및 신진 대사 프로필. 장내 미생물군유전체의 이러한 생체외 및 생체내 시스템을 이용한 연구는 숙주 건강과 질병에 기여하는 숙주 미생물군유전체 상호작용에 대한 추가 이해를 촉진할 수 있으며, 또한 미생물군유전체를 표적으로 하는 새로운 치료법을 찾는 것으로 이어질 수 있다. 숙주 건강을 개선하고 다양한 질병을예방하고 치료합니다 1.
시험관 내 장 내 미생물 배양 시스템은 실제 장 조건을 진정으로 복제 할 수 없지만, 여러 실험실은 이러한 모델을 개발하기 위해 노력했으며, 그 중 일부는 어느 정도 실용적이라고 밝혀졌으며 성공적으로 사용되었습니다. 다른 목적을 가지고 있습니다. 최근 창자 모델 중 하나는 인간 장 미생물 생태계의 시뮬레이터, 전체 인간의 위장을 모방, 위 포함 하 여, 소장, 그리고 결 장의 다른 영역. 그러나 이러한 기술적으로 복잡한 모델은 전 세계 다른 연구 시설에서는 접근하지 못할 수 있습니다. 따라서, 미생물군유전체 변조기와 장내 미생물 군비유및 숙주 건강에 미치는 영향을 연구하는 실험실에 대해 비교적 간단하고 저렴하며 실용적인 새로운 대체 모델의 개발에 대한 중요한 필요성이 여전히 존재합니다. 따라서, 시험관내(또는 생체내) 배설물 미생물 배양 시스템의 사용은 이러한 내정간섭의 효과를 연구하는데 유용할 것이다11,12. 구체적으로, 장내 미생물의 다양성과 조성, 배설물 pH 및 SCFAs 및 락테이트를 포함한 미생물 대사산물의 주기적인 변화의 관점에서 미생물발효 능력에 대한 상이한 프리바이오틱스의 효과를 연구할 수 있다. 13.본 명세서에서, 이눌린(가장 널리 연구된 프리바이오틱 성분 중 하나)을 마이크로바이브로메 변조기의 예로 사용하여, 이러한 간단한 생체내 미생물 배치 배양 시스템의 단계별 프로토콜을 사용하여 이를 추정하는 데 그 사용을 입증하는 것으로 설명되어 있다. 대변 미생물 및 미생물 대사 산물의 변화는 미생물 군변기와 의한 개입에 따른다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 제시 된 시험관 내 배설물 슬러리 발효 모델은 인간 배설물 미생물의 조성에 대한 다른 기질 및 미생물 균주 (예를 들어, 프리 바이오틱스 및 프로바이오틱스)의 효과를 근사화하는 간단한 단일 배치 모델입니다. 대변 pH 및 SCFAs 수준의 신진 대사 활동. 본 명세서에 제시된 결과는 이눌린의 접종이 배설물 pH를 감소시키고 비처리된 배설물 미생물 배양에 비해 이눌린 처리된 배설물<strong class…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 감사하게도 당뇨병, 비만 및 물질 대사 및 임상 및 번역 과학 센터, 의학의 웨이크 포레스트 학교, 국방부 자금 조달 (보조금 번호: W81XWH-1-0118)의 자금 지원을 인정합니다. 커밋 글렌 필립스 II 심장 혈관 의학의 의자; 건강의 국가 학회는 클로드 D. 페퍼 이전 미국인 센터 자금 (P30AG12232에 의해 자금); R01AG18915; R01DK114224 및 임상 및 번역 과학 센터 (UL1TR001420에 의해 투자 된 임상 연구 단위), 또한 고맙게도 인정. 우리는 또한 대변 샘플을 제공 해 자원 봉사자에 대 한 감사, 그리고 그들의 기술 적인 도움에 대 한 우리의 다른 실험실 구성원이 이 실험 동안.
Materials
| Ammonium Bicarbonate (NH4HCO3) | Sigma-Aldrich | 217255 | |
| Ammonium Sulfate (NH4)2SO4 | TGI | C2388 | Toxic |
| Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2•2H2O) | Sigma-Aldrich | C3306 | Irritating |
| Cobaltous Chloride Hexahydrate (CoCl2•6H2O) | Sigma-Aldrich | 255599 | |
| Cupric Chloride Dihydrate (CuCl2•2H2O) | Acros organics | 2063450000 | Toxic, Irritating |
| Cysteine-HCl | Sigma-Aldrich | C121800 | |
| D-biotin | Sigma-Aldrich | B4501 | |
| D-Pantothenic acid | Alfa Aesar | A16609 | |
| Disodium Ethylenediaminetetraacetate Dihydrate (Na2EDTA) | Biorad | 1610729 | |
| DL-α-methylbutyrate | Sigma-Aldrich | W271918 | |
| Ferrous Sulfate Heptahydrate (FeSO4•7H2O) | Sigma-Aldrich | F8263 | Toxic |
| Folic acid | Alfa Aesar | J62937 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Hemin | Sigma-Aldrich | H9039 | |
| Hepes | Alfa Aesar | A14777 | |
| Isobutyrate | Alfa Aesar | L04038 | |
| Isovalerate | Alfa Aesar | A18642 | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate (MgCl2•6H2O) | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Manganese Chloride Tetrahydrate (MnCl2•4H2O) | Sigma-Aldrich | 221279 | |
| Niacin (Nicotinic acid) | Sigma-Aldrich | N4126 | |
| Nickel(Ii) Chloride Hexahydrate (NiCl2•6H2O) | Alfa Aesar | A14366 | Toxic |
| N-valerate | Sigma-Aldrich | 240370 | |
| P-aminobenzoic acid | MP China | 102569 | Toxic, Irritating |
| Phosphoric Acid (H3PO4) | Sigma-Aldrich | P5811 | |
| Potassium Dihydrogen Phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5504 | |
| Potassium Hydrogen Phosphate (K2HPO4) | Sigma-Aldrich | 1551128 | |
| Pyridoxine | Alfa Aesar | A12041 | |
| Resazurin | Sigma-Aldrich | R7017 | |
| Riboflavin | Alfa Aesar | A11764 | |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | Sigma-Aldrich | 1613757 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher BioReagents | 7647-14-5 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Chemicals | S320 | |
| Sodium Molybdate Dihydrate (Na2MoO4•2H2O) | Acros organics | 206375000 | |
| Thiamine Hydrochloride (Thiamin-HCl) | Acros organics | 148991000 | |
| Trypticase | BD Biosciences | 211921 | |
| Vitamin B12 | Sigma-Aldrich | V2876 | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | 70161 | |
| Zinc Sulfate Heptahydrate (ZnSO4•7H2O) | Sigma-Aldrich | Z0251 | |
| 0.22 µm membrane filter | |||
| AMPure magnetic purification beads | Agencourt | ||
| Anaerobic chamber with incubatore | Forma anaerobic system, Thermo Scientific, USA | ||
| Bottle filter | Corning | ||
| Cheesecloth | |||
| Illumina MiSeq sequencer | Miseq reagent kit v3 | ||
| pH meter | |||
| Qiagen PowerFecal kit | Qiagen | ||
| Quantitative Insights into Microbial Ecology (QIIME) software | |||
| Qubit-3 fluorimeter | InVitrogen | ||
| Vortex | Thermoscientific | ||
| Waters-2695 Alliance HPLC system | Waters Corporation |
References
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