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पूर्व Vivo मानव गर्भनाल रक्त से टेम स्टेम कोशिकाओं के विस्तार-व्युत्पंन CD34+ कोशिकाओं Valproic एसिड का उपयोग

Published: April 11, 2019 doi: 10.3791/59532
Automatic Translation
1, 1, 1
1Division of Hematology/Oncology, Tisch Cancer Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

Summary

यहां, हम CD34 के पूर्व वीवो विस्तार का वर्णन है+ कोशिकाओं से स्टेम कोशिकाओं गर्भनाल रक्त से व्युत्पंन एक cytokine कॉकटेल और vpa के संयोजन के साथ इलाज किया । इस विधि या तो नैदानिक या प्रयोगशाला अनुप्रयोगों के लिए आदिम HSCs के पूर्व vivo विस्तार की एक महत्वपूर्ण डिग्री की ओर जाता है ।

Abstract

गर्भनाल रक्त (UCB) इकाइयों रोगियों जो allogeneic अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण की आवश्यकता के लिए मानव टेम स्टेम सेल (HSCs) का एक वैकल्पिक स्रोत प्रदान करते हैं । जबकि UCB के कई अनूठे फायदे हैं, प्रत्येक UCB इकाई के भीतर HSCs की सीमित संख्या में पुनर्योजी चिकित्सा और वयस्कों में HSCS प्रत्यारोपण में उनके उपयोग की सीमा है । कार्यात्मक मानव hscs के कुशल विस्तार CD34+ ucbs से अलग कोशिकाओं और एक deacetylase अवरोध करनेवाला, वैल्पोरिक एसिड (vpa) के साथ इलाज के पूर्व vivo संवर्धन द्वारा प्राप्त किया जा सकता है । यहां विस्तृत प्रोटोकॉल संस्कृति की स्थिति और पद्धति को तेजी से CD34+ कोशिकाओं को अलग और एक उच्च डिग्री आदिम hscs के एक पूल के लिए विस्तार का वर्णन करता है । विस्तारित एचएससी दोनों अल्पकालिक और दीर्घकालिक एंगर्फटमेंट स्थापित करने में सक्षम हैं और सभी प्रकार के विभेदित टेम कोशिकाओं को जन्म देने में सक्षम हैं । इस पद्धति में भी नैदानिक आवेदन के लिए क्षमता ऑटोलॉगस hsc जीन थेरेपी रखती है और एक आकर्षक दृष्टिकोण प्रदान करता है जीन संपादन के साथ जुड़े कार्यात्मक hsc की हानि को दूर करने के लिए ।

Introduction

पूर्व विवो गर्भनाल रक्त (ucb) इकाइयों से टेम स्टेम सेल (hscs) के विस्तार पुनर्योजी चिकित्सा और प्रत्यारोपण थेरेपी में hscs अनुप्रयोगों के लिए महान वादा रखती है । यूसीबी इकाइयों के साथ प्रत्यारोपण ऐसे आसान संग्रह, उच्च उपलब्धता, संक्रमण का ंयूनतम जोखिम, रोग पतन के कम जोखिम, और graft बनाम मेजबान रोग (GVHD) की कम आवृत्ति के रूप में कई अनूठे लाभ है । तथापि, नैदानिक विन्यास में उनके उपयोग के प्रमुख नुकसान प्रत्येक यूसीबी यूनिट1के भीतर मौजूद एचएससी की सीमित संख्या हैं । Hscs की अपर्याप्त संख्या में देरी engraftment और टेम रिकवरी, भ्रष्टाचार अस्वीकृति के जोखिम, और ंयायपालिका प्रतिरक्षा पुनर्गठन में परिणाम है ।

वर्तमान में, पूर्व वीवो के लिए विभिंन तरीकों और रणनीतियों को विकसित किया गया है UCBs से HSCs की सीमित संख्या का विस्तार । छोटे अणुओं या यौगिकों में पूर्व vivo संस्कृतियों के साथ विभिन्न cytokine कॉकटेल के संयोजन hsc संख्या2,3,4,5,6में विस्तार के विभिन्न डिग्री में परिणाम, 7,8. महत्वपूर्ण बात, पूर्व vivo संस्कृति की स्थिति तनाव प्रेरित, तेजी से सेल प्रसार के लिए अग्रणी, चयापचय गतिविधि और आदिम विशेषताओं है कि प्राथमिक HSCs परिभाषित की हानि वृद्धि हुई है । इसलिए, ऐसे प्रोटोकॉलों का विकास करना जो प्राथमिक आदिम जनजातियों के निकट समान विशेषताओं वाले कार्यात्मक एचएससी की बड़ी संख्या का विस्तार करने की आवश्यकता है ।

सीरम मुक्त CD34 की संस्कृतियों+ ucbs से अलग कोशिकाओं और वैल्पोरिक एसिड के साथ इलाज (vpa) आदिम hscs की बड़ी संख्या के विस्तार में परिणाम4,9,10. शहरी सहकारी बैंकों से प्राप्त मौजूदा एचएससी के प्रसार के कारण ही HSC का विस्तार नहीं हो पा रहा है । इसके बजाय, यह विस्तार एक आदिम phenotype के अधिग्रहण के कारण सेल डिवीजनों और प्रसार9की एक सीमित संख्या के साथ संयुक्त है। प्रारंभिक 24 के भीतर-साइटोकिंस और vpa का एक संयोजन के साथ ऊष्मायन के एच, CD34+ कोशिकाओं को एक transcriptomic और लक्षणप्ररूपी प्रोफ़ाइल है कि लंबे समय तक hscs की विशेषता प्राप्त. एचसीएस के प्रतिशत में उल्लेखनीय वृद्धि के साथ एचसीएस की संख्या में तत्काल वृद्धि (वीपीए उपचार के 24 एच के भीतर ६३ गुना वृद्धि) के साथ है । विशेष रूप से, VPA-पूर्व vivo विस्तार रणनीति कम चयापचय गतिविधि है, जो आगे उनके आदिम विशेषताओं पर प्रकाश डाला गया के साथ HSCs फैलता है ।

यहां वर्णित विधि शर्तों और उपचार है कि या तो नैदानिक या प्रयोगशाला अनुप्रयोगों के लिए पूर्व vivo विस्तार के एक महत्वपूर्ण डिग्री के लिए नेतृत्व प्रदान करता है । यह पूर्व vivo विस्तार रणनीति एक cytokine कॉकटेल VPA उपचार के साथ संयुक्त का उपयोग करता है । VPA द्विध्रुवी विकारों और अंय स्नायविक रोगों के उपचार के लिए एक एफडीए को मंजूरी दे दी दवा है । VPA के साथ HSC विस्तार शीघ्र और 7 दिनों के भीतर होता है, हेरफेर के दोनों समय और संदूषण के जोखिम को कम करने । महत्वपूर्ण बात, इस प्रोटोकॉल के अधिग्रहण के लिए अनुमति देता है दीर्घकालिक hsc लक्षणप्ररूपी मार्करों जैसे CD90 और CD49f के भीतर 24-48 एच vpa के साथ उपचार के बाद9। विस्तारित hsc इस प्रोटोकॉल के साथ बनाया grafts के बाद से वे सभी टेम कोशिका वंश में अंतर कर सकते है और myeloablated एनएसजी चूहों में प्रत्यारोपण के बाद लंबी अवधि के engraftment स्थापित करने के लिए टेम प्रणाली पुनर्जीवित करने की क्षमता है मॉडल4। इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल अत्यधिक reproducible है और व्यवहार्य CD34+ ucbs, जो इस प्रक्रिया के औद्योगिकीकरण के लिए महत्वपूर्ण है से कोशिकाओं के कुशल और तेजी से अलगाव के लिए अनुमति देता है ।

VPA ex vivo विस्तार प्रोटोकॉल भी HSCs के महत्वपूर्ण नुकसान जो जीन संपादन11के दौरान होता है पर काबू पाने की क्षमता है । जीन संपादन cytokines, जो साइकिल चालन कोशिकाओं और डीएनए की मरंमत तंत्र के सक्रियकरण के लिए आवश्यक है के लिए जोखिम की आवश्यकता है । VPA उपचार के तुरंत प्रभाव के कारण, इस विधि के समय की अवधि है कि वर्तमान में उपयोग जीन संशोधन प्रोटोकॉल के लिए प्रासंगिक है के भीतर आनुवंशिक रूप से संशोधित कोशिकाओं की एक उच्च संख्या के उत्पादन के लिए फायदेमंद हो सकता है ।

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Protocol

HSC ex vivo विस्तार प्रोटोकॉल माउंट सिनाई स्कूल ऑफ मेडिसिन में रिसर्च एथिक्स कमेटी के दिशानिर्देशों का पालन करता है ।

1. बफर और मीडिया की तैयारी

  1. जुदाई बफर 24 h तैयार करने से पहले CD34 के अलगाव के लिए+ ०.५ एम एथिलीन डायमीन tetra-एसिटिक एसिड (edta) और ३३ मिलीलीटर की ७.५% बोवाइन सीरम एल्ब्युमीन (bsa) के ४६५ मिलीलीटर buffered खारा (1X pbs) के 2 मिलीलीटर जोड़कर ubcs से कोशिकाओं । धीरे मिक्स और 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात बफर बनाए रखने के ।
  2. शुद्धि के दिन कमरे के तापमान पर गर्म मीडिया ।

2. यूसीबी यूनिट से मोनोन्यूक्लियर सेल (MNCs) का अलगाव

  1. पूरी यूसीबी यूनिट को ७५ सेमी2 फ्लास्क में बांटना । कमरे के तापमान पर यूसीबी को पीबीएस की समान मात्रा के साथ पतला और धीरे से मिलाएं ।
  2. पूरे UCB इकाई प्रसंस्करण के लिए आवश्यक ट्यूबों की संख्या का निर्धारण (१ ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब पतला UCB के ३५ मिलीलीटर की प्रक्रिया के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है). घनत्व ढाल मीडिया के 15 मिलीलीटर जोड़ें ( सामग्री की मेजदेखें) प्रत्येक ट्यूब के लिए और दो परतों का निर्माण घनत्व ढाल मीडिया के शीर्ष पर पतला ucb बांटना ।
    नोट: यूसीबी के साथ घनत्व ढाल मीडिया परत के मिश्रण को रोकने के लिए एक ४५ ° कोण पर ट्यूब धारण जबकि पतला UCB बहुत धीरे से बांटना ।
  3. कम त्वरण और मंदी की दर से 30 मिनट के लिए ४०० x g पर सेंट्रीफ्यूज । अपकेंद्रण के बाद, बहुराष्ट्रीय कंपनियाँ प्लाज्मा और घनत्व ग्रेडिएंट मीडिया लेयर के बीच श्वेत परत (buffy coat) का पता लगाएँ ।
  4. धीरे से buffy कोट परत परेशान बिना प्लाज्मा के 2/3 महाप्राण । ध्यान से एक नया ५० मिलीलीटर ट्यूब में buffy कोट परत हस्तांतरण । एक ही UCB इकाई से एक ५० मिलीलीटर ट्यूब में 25 मिलीलीटर तक पहुंचने तक सभी बहुराष्ट्रीय कंपनियों लीजिए । एक नई ट्यूब का उपयोग करें अगर एकत्र बहुराष्ट्रीय कंपनियों की मात्रा 25 मिलीलीटर से अधिक है ।
  5. 25 मिलीलीटर वाली ठंडी पीबीएस को एमएनसी के 25 मिलीलीटर में डालें और अच्छी तरह मिलाएं । 4 ° c पर 10 मिनट के लिए ४०० x g पर सेंट्रीफ्यूज ।
    नोट: शीत पीबीएस कोशिका सतह पर एंटीबॉडी की कैपिंग को रोकने और गैर विशिष्ट लेबलिंग को कम करने के लिए महत्वपूर्ण है ।
  6. ध्यान से supernatant महाप्राण और धीरे फिर से ठंडा PBS के ५० मिलीलीटर में सेल गोली निलंबित ।
  7. गिनती के लिए सेल निलंबन के 20 μL निकालें । एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करके आरिडीन ऑरेंज/प्रोपिडियम आयोडाइड धुंधला से सना हुआ सेल नंबर गिनें । बहुराष्ट्रीय कंपनियों की कुल संख्या की गणना कीजिए ।
    नोट: कोशिका गणना भी trypan नीले बहिष्करण विधि एक hemocytometer का उपयोग करके किया जा सकता है ।
  8. 4 ° c पर 15 मिनट के लिए ४०० x g पर सेंट्रीफ्यूज ।
    नोट: यदि तत्काल आवश्यकता नहीं होती है, तो बहुराष्ट्रीय कंपनियां इस स्तर पर जम सकती हैं ।

3. CD34 के अलगाव+ ucbs से कोशिकाओं

  1. CD34+ बहुराष्ट्रीय कंपनियों से कोशिकाओं के अलगाव के लिए चुंबकीय मोती समाधान के साथ मिलकर CD34+ एंटीबॉडी तैयार करें । मिश्रण ३०० Μl मानव Fcr मानव Igg के १०० μl के साथ (अवरुद्ध अभिकर्मक) और CD34 के अलगाव के लिए CD34 चुंबकीय मोती के १०० μl + प्रत्येक 108 बहुराष्ट्रीय कंपनियों से कोशिकाओं । (> 108) बहुराष्ट्रीय कंपनियों से अधिक संख्या में CD34+ कोशिकाओं के पृथक्करण के लिए तदनुसार अभिकर्मकों को स्केल करें ।
  2. ध्यान से supernatant ट्यूब केन्द्रापसारक से कदम २.८ पर महाप्राण । चरण ३.१ में तैयार CD34 चुंबकीय मोती समाधान में गोली Resuspend (108 कोशिकाओं प्रति समाधान के ५०० μl का उपयोग करें) ।
  3. मिश्रण धीरे और 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते ।
    नोट: इंक्यूबेशन अवधि के दौरान सेल विभाजक डिवाइस ( सामग्री तालिकादेखें) तैयार करें । संग्रहण समाधान को निर्माता के निर्देशों द्वारा दर्शाई गई कार्य बफ़र के साथ बदलें और एक धुलाई प्रोग्राम के बाद एक रिसिंग प्रोग्राम चलाएं ।
  4. जब तक ट्यूब पूरी तरह से भर जाता है सेल मिश्रण युक्त ट्यूब के लिए ठंडा सेल विभाजक चल बफर जोड़ें । 4 ° c पर 15 मिनट के लिए ४०० x g पर सेंट्रीफ्यूज ।
  5. Supernatant महाप्राण और शीत सेल विभाजक चल बफर (2 एमएल/108 कोशिकाओं) में सेल गोली resuspend । 15 मिलीलीटर ट्यूबों में सेल निलंबन मिश्रण के 2 मिलीलीटर स्थानांतरण ।
  6. सेल विभाजक रैक में 15 मिलीलीटर ट्यूबों के 3 सेट लोड 4 डिग्री सेल्सियस पर prechilled । ट्यूबों का एक सेट MNCs, ट्यूबों के दूसरे सेट नकारात्मक अंश और ट्यूबों के तीसरे सेट इकट्ठा करने के लिए शुद्ध CD34+ कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा का उपयोग किया जाएगा शामिल हैं ।
  7. सेल विभाजक डिवाइस में रैक लोड और posseld2 पूर्व निर्धारित कार्यक्रम चलाते हैं ।
    नोट: एक वैकल्पिक विधि है कि मैनुअल चुंबकीय विभाजक का उपयोग करने के लिए सेल विभाजक डिवाइस12 प्रतिस्थापित किया जा सकता है ।
  8. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए ४०० x g पर सकारात्मक अंश के साथ सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों । महाप्राण सीरम मुक्त मीडिया के 1 मिलीलीटर में supernatant और resuspend शुद्ध CD34+ कोशिकाओं ।
  9. एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करके आरिडीन ऑरेंज के साथ दाग कोशिकाओं की गणना/
    नोट: अगर तुरंत आवश्यक नहीं है, शुद्ध CD34+ कोशिकाओं को इस स्तर पर जम सकता है ।

4. VPA पूर्व Vivo शुद्ध UCB के विस्तार-CD34+ कोशिकाओं

  1. थाली के लिए मीडिया की पर्याप्त मात्रा तैयार शुद्ध CD34+ कोशिकाओं ३.३ x 104 कोशिकाओं के घनत्व पर/ संस्कृति मीडिया संरचना सीरम मुक्त संस्कृति मध्यम है ( सामग्री की मेजदेखें) 10 μl/एमएल पेन/strep, १५० एनजी/एमएल स्टेम सेल फैक्टर (scf), १०० एनजी/एमएल एफएमएस की तरह tyrosine कळेनासे रिसेप्टर 3 (FLT3 ligand), १०० एनजी/एमएल थ्रोम्बोपोइटिइन (tpo), और ५० एनजी/एमएल इंटरल्यूकिन 3 (आईएल-3) ।
  2. थाली शुद्ध CD34+ एक 12-well थाली में कोशिकाओं (5 x 104 CD34+ कोशिकाओं/१.५ एमएल मीडिया के) और संस्कृति में ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक 5% सह2 humidified इनयूबेटर ।
  3. चरण ६.३ में नीचे वर्णित के रूप में FACS विश्लेषण द्वारा अलग CD34+ कोशिकाओं और कोशिका संरचना की शुद्धता का आकलन करें ।
  4. कोशिका की संस्कृतियों में 1 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता पर VPA जोड़ें cytokine कॉकटेल के साथ 16 एच के लिए इलाज किया ।
  5. एक 5% सह में ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक अतिरिक्त 7 दिनों के लिए कोशिकाओं संस्कृति-2 humidified इनयूबेटर ।
    नोट: मीडिया पूर्व vivo विस्तार की अवधि के दौरान अपरिवर्तित बनी हुई है ।

5. प्रवाह Cytometry विश्लेषण के लिए एंटीबॉडी धुंधला

  1. 2 x 104-6 x 104 कोशिकाओं और facs गेटिंग रणनीति निर्धारित करने के लिए आइसोटाइप समाधान और गैर-विशिष्ट बाइंडिंग के स्तर का निर्धारण करने के लिए दाग करने के लिए एंटीबॉडी-धुंधला समाधान तैयार करें । पतला एंटीबॉडी (1/100 APC विरोधी CD34, 1/200 FITC विरोधी CD90) और संबंधित isotypes में ५० μL जुदाई बफर की (जुदाई बफर की संरचना चरण १.१ में परिभाषित किया गया है) ।
    नोट: एक FMO गेटिंग रणनीति के लिए प्रत्येक एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं के एक धुंधला प्रदर्शन । कुल एंटीबॉडी मुआवजा मनका किट ( सामग्री की मेजदेखें) मुआवजा सेटअप के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
  2. एकाधिक बार पिख्ता करके कक्ष कल्चर को समरूप बनाना. एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब में कोशिकाओं और पिपेट 5 x 104 कोशिकाओं गिनती ।
  3. कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए ४०० x g पर जुदाई बफर और सेंट्रीफ्यूज के 1 मिलीलीटर जोड़ें ।
  4. Supernatant महाप्राण और दाग समाधान के ५० μL में गोली resuspend । कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए कोशिकाओं को इनसेबेट ।
  5. कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए ४०० x g में जुदाई बफर और सेंट्रीफ्यूज के ४५० Μl जोड़ें ।
  6. Supernatant महाप्राण और जुदाई बफर के १०० μL में गोली resuspend । FACS विश्लेषण करने तक कम से 5 मिनट के लिए बर्फ पर कोशिकाओं रखें. 7 के 1 μL जोड़ें-AAD गेट व्यवहार्य कोशिकाओं के लिए ।
  7. FACS मशीन पर दाग सेल नमूना लोड और सबसे कम प्रवाह दर पर कोशिकाओं को प्राप्त.
  8. प्रत्येक फ्लोरीफोर के लिए, समप्ररूप नियंत्रण और एकल दाग कोशिकाओं के लिए fitc (CD90), apc (CD34), और percp/cy 5.5 (7-AAD) धुंधला करने के लिए सेट अप करने के लिए विश्लेषण ।
  9. गेट PerCP/Cy 5.5 नकारात्मक अंश और प्लॉट APC बनाम FITC व्यवहार्य CD34 का प्रतिशत निर्धारित करने के लिए+, CD90+, और CD34+CD90+ कोशिकाओं है कि संस्कृति में hspc/hsc आबादी को परिभाषित करता है ।

6. प्रवाह Cytometry कोशिका छंटाई के लिए एंटीबॉडी धुंधला

  1. विस्तारित कक्षों को एकाधिक बार पिख्ता करके पुनः भेजें । सेल संख्या गिनती और एक 15 मिलीलीटर या ५० मिलीलीटर ट्यूब में पूरी संस्कृति हस्तांतरण ।
  2. ठंडा जुदाई बफर के साथ ट्यूब भरें
  3. 4 ° c पर 15 मिनट के लिए ४०० x g पर सेंट्रीफ्यूज ।
  4. एंटीबॉडी-धुंधला समाधान 5 x 105– 2 x 106 कोशिकाओं और 1 x 105 कोशिकाओं दाग और facs गेटिंग का निर्धारण करने के लिए समप्ररूप समाधान तैयार करें । पतला 1/10 (APC विरोधी CD34), 1/20 (FITC-CD90) एंटीबॉडी और प्रत्येक शर्त के प्रति जुदाई बफर के ५०० μL में इसी isotypes ।
  5. एक रंग मुआवजा कुल एंटीबॉडी मुआवजा का उपयोग कर नियंत्रण तैयार मनका किट निर्माता के निर्देशों के अनुसार ।
  6. स्टेप ५.२ से सुपरनैंट को एक नए ट्यूब में ट्रांसफर करें और ३७ डिग्री सेल्सियस पर रखें । इस संस्कृति मीडिया सॉर्ट कोशिकाओं संस्कृति के लिए पुन: उपयोग किया जाएगा ।
  7. 5 x 105 कोशिकाओं/एमएल की एकाग्रता प्राप्त करने के लिए कोल्ड सेपरेशन बफर में सेल पेलेट को पुन भिजवाएं । स्थानांतरण 1 x 105 कोशिकाओं में १.५ मिलीलीटर ट्यूबों समप्ररूप धुंधला होना और शेष कोशिकाओं है कि अन्य १.५ मिलीलीटर ट्यूबों में हल हो जाएगा के लिए ।
  8. सेंट्रीफ्यूज ४०० एक्स जी पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए ट्यूबों ।
  9. समप्ररूप धुंधला करना समाधान और कोशिकाओं है कि एंटीबॉडी धुंधला समाधान में हल हो जाएगा की गोली में कोशिकाओं के supernatant और resuspend छर्रों छोड़ दें ।
  10. 4 ° c पर 30 मिनट के लिए इनसेबेट ।
  11. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए ४०० x g में पृथक्करण बफर और सेंट्रीफ्यूज की ४५० Μl जोड़ें ।
  12. ठंड जुदाई बफर के 2 मिलीलीटर के साथ छर्रों Resuspend ।
  13. Clogs रोकने के लिए, एक ४० μm सेल छलनी के माध्यम से नमूनों को फिल्टर और FACS तक बर्फ पर जगह है ।
  14. सेट अप सही मापदंडों के साथ छंटाई के लिए सेल सॉर्टर ।
  15. वोल्टेज और आगे और पक्ष तितर बितर और नकारात्मक प्रतिदीप्ति आबादी की पहचान के लिए लाभ सेट करने के लिए समप्ररूप नमूने चलाएँ.
  16. क्षतिपूर्ति गुणांक सेट करें और संग्रह प्रोटोकॉल के लिए क्षतिपूर्ति पैरामीटर लागू करने के लिए एकल रंग नियंत्रण चलाएँ ।
  17. (एबी) नमूना (~ ५०,००० घटनाओं) का एक छोटा सा aliquot चलाने के लिए gating रणनीति स्थापित करने के लिए ।
  18. CD34+ CD90- कक्ष भिंन को एकत्रित करने के लिए सॉर्ट निर्णय सेट करें ।
  19. 2 मिलीलीटर जुदाई बफर के साथ लेपित संग्रह ट्यूबों में कोशिकाओं को सॉर्ट करें ।
  20. छंटाई के बाद, कोशिकाओं को फिर से बयान और उंहें ४०० x g पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज ।
  21. Supernatant छोड़ें और मीडिया में गोली ५.५ कदम में बरामद करने के लिए 3 x 104 कोशिकाओं/एमएल की एक अंतिम एकाग्रता तक पहुंचने ।
  22. प्लेट CD34+ CD90- प्यूरिफाइड कोशिकाओं में 12-वेल प्लेट्स विथ १.५ ml मीडियम/वेल (5 x 104 CD34+ CD90- सेलों/1.5 ml ऑफ़ मीडिया/वेल).
  23. FACS विश्लेषण द्वारा शुद्धता का आकलन कोशिकाओं युक्त मीडिया के ५० μL का उपयोग कर.
  24. CD34 की संस्कृतियों का इलाज+CD90- vpa के साथ कोशिकाओं 1mm अंतिम एकाग्रता में ।
  25. ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक 5% सह2 humidified इनयूबेटर में सेते ।

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Representative Results

Ex vivo प्रोटोकॉल यहां वर्णित आदिम HSCs CD34 से उत्पंन की संख्या+ ucbs से अलग कोशिकाओं (चित्रा 1) बढ़ जाती है । CD34 के भड़काना+ एक cytokine कॉकटेल के साथ 16 एच के लिए कोशिकाओं, एक अतिरिक्त 7 दिनों के लिए vpa के साथ उपचार के बाद, hsc विस्तार की एक महान डिग्री की ओर जाता है । उल्लेखनीय है, विस्तारित कोशिकाओं के पूल HSCs, जो phenotypically CD34+CD90+ मार्करों द्वारा परिभाषित कर रहे है के लिए अत्यधिक समृद्ध है । केवल cytokine कॉकटेल के साथ इलाज संस्कृतियों में नाभिक कोशिकाओं (TNCs) की कुल संख्या काफी अधिक cytokine कॉकटेल और VPA के साथ इलाज संस्कृतियों में मनाया कोशिकाओं की संख्या से अधिक है (चित्रा 2A) । TNCs की अधिक संख्या के बावजूद, केवल cytokine कॉकटेल प्राप्त संस्कृतियों में HSCs की संख्या पूरी विस्तार अवधि के दौरान कम रहता है cytokine कॉकटेल और VPA के साथ इलाज संस्कृतियों की तुलना में (चित्रा 2B) । HSCs की सबसे बड़ी संख्या cytokine कॉकटेल और VPA (चित्रा 2b) का एक संयोजन के साथ इलाज संस्कृतियों में उत्पंन होता है । विशेष रूप से, एचएससी की संख्या में सबसे बड़ा विस्तार VPA उपचार के बाद 5 – 7 दिनों के बाद तक पहुंच गया है (चित्र 2B) । एचसीएस की बढ़ी हुई संख्या एचएससी के प्रतिशत में शीघ्र वृद्धि के साथ संबद्ध है, जो वीपीए उपचार के 24 एच के भीतर उल्लेखनीय है (चित्र 2c) । जबकि एचसीएस के प्रतिशत में वृद्धि उच्च है और पूर्व vivo संस्कृति के पहले 4 दिनों के दौरान बनाए रखा, यह VPA के साथ उपचार के 5-7 दिनों के बाद उत्तरोत्तर गिरावट आती है (चित्र 2c) । तथापि, यह कमी एचएससी की पूर्ण संख्या में वृद्धि के साथ व्युत्क्रमानुसंबन्धित है ।

महत्वपूर्ण बात, HSCs के प्रतिशत में तेजी से वृद्धि VPA इलाज संस्कृतियों में मनाया CD90 phenotype के अधिग्रहण के कारण है । CD34+ कोशिकाओं CD90 लक्षणप्ररूपी मार्कर व्यक्त लगभग 40% तक पहुंचता है-कोशिकाओं के 45% पूर्व वीवो 4 दिनों के लिए cytokine कॉकटेल और vpa के साथ इलाज संस्कृतियों में विस्तार (चित्र 2c,डी) । CD90 phenotype के अधिग्रहण और उच्च शुद्ध CD34+ कोशिकाओं है कि CD90 मार्कर की अभिव्यक्ति की कमी के पूर्व vivo विस्तार द्वारा पुष्टि की है । VPA उपचार के 24 एच के भीतर, पूर्व vivo के लगभग ७५% CD34 हल के साथ शुरू की संस्कृतियों में कोशिकाओं का विस्तार+CD90- कोशिकाओं एक्सप्रेस CD90 के रूप में cytokine कॉकटेल अकेले (चित्रा 2e) युक्त संस्कृतियों में कोशिकाओं के 0% का विरोध किया । महत्वपूर्ण बात, CD90 phenotype अत्यधिक पूर्व vivo VPA के साथ इलाज संस्कृतियों में पहले 4 दिनों के दौरान बनाए रखा है (चित्रा 2E) ।

Figure 1
चित्रा 1: पूर्व vivo विस्तार संस्कृति की योजनाबद्ध प्रस्तुति । शुद्ध CD34+ ucbs से कोशिकाओं पूर्व वीवो संस्कृति में संकेत cytokines के संयोजन के साथ पूरक 16 एच के लिए primed हैं । संस्कृतियों VPA (1mM) के साथ एक अतिरिक्त 7 दिनों के लिए इलाज कर रहे हैं । पूर्व vivo विस्तारित कोशिकाओं तो myoablated एनएसजी चूहों में प्रत्यारोपित किया जा सकता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: VPA उपचार CD90 के अधिग्रहण ट्रिगर HSCs की एक बड़ी संख्या के विस्तार में जिसके परिणामस्वरूप । (क) भूतपूर्व वीवो संस्कृतियों में विस्तारित कुल व्यवहार्य केन्द्रक कोशिकाओं की निरपेक्ष संख्या9। शुद्ध CD34+ ucbs से कोशिकाओं खंड 3 में वर्णित cytokine कॉकटेल अकेले या cytokine कॉकटेल और vpa का एक संयोजन के रूप में वर्णित के रूप में धारा 4 acridine ऑरेंज द्वारा गिना गया था/प्रोपिडियम आयोडाइड धुंधला (n = 16) । संख्या vpa के साथ उपचार के दिनों को निरूपित करते हैं, जबकि पीसी प्राथमिक असभ्य CD34+ ucbs से अलग कोशिकाओं को दर्शाता है । (ख, ग) निरपेक्ष संख्या और CD34 का प्रतिशत+CD90+ कोशिकाओं पूर्व vivo में 7 दिनों तक विस्तारित विवो अकेले कॉकटेल या cytokine कॉकटेल और vpa (एन = 21) के संयोजन के साथ इलाज संस्कृतियों । CD34 का प्रतिशत+CD90+ कोशिकाओं धारा 4 में वर्णित के रूप में दाग कोशिकाओं के प्रवाह cytometry विश्लेषण द्वारा निर्धारित किया जाता है । (घ) यूसीबी से छांटे गए CD34+ कोशिकाओं का लक्षणप्ररूपी विश्लेषण (स्टेप ५.३) पूर्व वीवो संस्कृतियों में विस्तारित 4 दिनों के लिए संकेत के रूप में माना जाता है । बाएँ पैनल अन्य पैनलों जबकि एक प्रकार का धुंधला समप्ररूप का उपयोग कर रणनीति को इंगित करता है दाग कोशिकाओं cytokine कॉकटेल अकेले या vpa के साथ cytokine कॉकटेल का एक संयोजन युक्त संस्कृतियों में विस्तार का संकेत है । संख्याएं CD34-CD90+ कक्षों, CD34+CD90- कक्षों और CD34+CD90+ कक्षों के प्रतिशत को निरूपित करती हैं । (ई) CD34 का प्रतिशत+CD90+ कोशिकाओं के साथ शुरू की गई संस्कृतियों में विस्तारित CD34+CD90- ubcs से कोशिकाओं और CYTOKINE कॉकटेल अकेले या cytokine कॉकटेल और vpa के संयोजन के साथ इलाज के लिए संकेत दिन । प्रतिशत प्रवाह cytometry विश्लेषण (n = 4) द्वारा निर्धारित होता है । द: जैविक replicates की संख्या । SEM के साथ त्रुटि पट्टियां; p ≤ ०.०००१ के रूप में एक और बी के लिए नकारात्मक द्विपद मॉडल द्वारा निर्धारित, डी के लिए बीटा मॉडल और पैनल ई. पैनलों ए के लिए 2 तरह ANOVA-सी और ई पिताजी एट अल से संशोधित किया गया है.9कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

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Discussion

इसके साथ ही, हम यूसीबी से कार्यात्मक मानव एचएससी की संख्या में तेजी से विस्तार करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर पायलट और काइनेटिक अध्ययनों से संकेत मिलता है कि पूर्व वीवो विस्तार कोशिकाओं को तुरंत प्राप्त करने और CD90 के साथ ही आदिम hsc चयापचय लक्षण9सहित कई hsc लक्षणप्ररूपी मार्कर की अभिव्यक्ति बनाए रखने.

यह पूर्व vivo विस्तार प्रोटोकॉल अपेक्षाकृत सरल और विश्वसनीय है । सेल विभाजक डिवाइस ( सामग्री की तालिकादेखें) के साथ CD34+ कोशिकाओं का शुद्धिकरण अत्यधिक reproducible और तेजी से, अलग कोशिकाओं की तेजी से वसूली के लिए अनुमति देता है । इस विधि के शुद्ध CD34+ कोशिकाओं की एक उच्च उपज में परिणाम (> 90%) के रूप में मैनुअल immunomagnetic जुदाई का विरोध किया । इसके अलावा, इस पूर्व vivo विस्तार प्रोटोकॉल विशेष और जटिल उपकरणों या फेड-बैच संस्कृति सिस्टम है कि ताजा मीडिया के बड़े संस्करणों की निरंतर आपूर्ति की जरूरत नहीं है3,13साइटोकिंस के साथ पूरक की आवश्यकता नहीं है । तदनुसार, इस विधि की लागत सीमा । महत्वपूर्ण बात, इस प्रोटोकॉल एक कम समय है, जो संदूषण आवृत्ति के लिए एक महत्वपूर्ण सीमित कारक है के भीतर HSC पूल के विस्तार के लिए अनुमति देता है ।

CD34+ इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर कोशिकाओं से आदिम hscs प्राप्त करने के लिए कई बिंदुओं पर विचार किया जाना चाहिए. CD34+ कोशिकाओं cytokine कॉकटेल और vpa आदिम दीर्घकालिक hscs के एक पूल की पीढ़ी के लिए नेतृत्व के साथ इलाज संस्कृतियों में 4 दिनों के लिए विस्तारित । इन HSCs न केवल CD34, CD90 और CD49f के उच्च अभिव्यक्ति स्तर द्वारा, लेकिन यह भी एक बहुत ही आदिम चयापचय प्रोफ़ाइल है, जो मुख्य रूप से ग्लाइकोलिसिस9पर निर्भर करता है की विशेषता है । 7 दिनों के लिए vpa के साथ अधिक लंबे समय तक ऊष्मायन के दौरान, विस्तारित संस्कृतियों लेकिन अधिक विषम है और दोनों दीर्घकालिक और अल्पकालिक के रूप में के रूप में अच्छी तरह से विभेदित कोशिकाओं के रूप में 4 दिनों के लिए विस्तारित कोशिकाओं के लिए की एक बड़ी संख्या में होते हैं । यह परिणाम मुख्य रूप से संस्कृति में VPA की थकावट और सेल डिवीजनों की संख्या में वृद्धि के कारण है9। इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल के लिए कोशिकाओं के दो अलग पूल के विस्तार को प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है: 4 दिन और 7 दिन विस्तारित कोशिकाओं । 7-दिन के विस्तार उत्पाद का उपयोग एलोगेनिक HSC ट्रांसप्लांटेशन के लिए किया जा सकता है जहां अधिक तेजी के साथ-साथ निरंतर बहुवंशावली engraftment की आवश्यकता है । 4 दिन के विस्तार प्रोटोकॉल आनुवंशिक संशोधन रणनीतियों है कि लक्ष्य लंबी अवधि के पुनर्जनसंख्या कोशिकाओं के लिए सबसे अच्छा अनुकूल हो सकता है । यह भी संभावना है कि VPA और cytokine कॉकटेल के इस संयोजन CD34 से HSCs के पूल का विस्तार कर सकते है+ एक ही डिग्री या उच्च पर कोशिकाओं जब मीडिया के अलावा अंय मीडिया का उपयोग कर ( सामग्री की मेजदेखें) इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया ।

वर्तमान जीन संपादन प्रक्रियाओं HSCs, जो उनके नैदानिक आवेदन सीमा की एक महत्वपूर्ण नुकसान के साथ जुड़े रहे हैं । पूर्व वीवो संस्कृतियों में VPA उपचार के 2-4 दिनों के भीतर प्राप्त आदिम HSCs की बड़ी संख्या में HSCS संख्या में इस नुकसान को दूर करने की क्षमता है । इस प्रकार, यह प्रोटोकॉल मौजूदा जीन संपादन प्रोटोकॉलों में सुधार करने और β-थैलासीमिया और सिकल सेल रोग के लिए एचएससी ट्रांसप्लांटेशन-आधारित उपचारों में आनुवंशिक उत्परिवर्तनों के सुधार को सक्षम करने के लिए लाभकारी हो सकता है । इसके अलावा, यह HSCs में जीन कार्यों की व्याख्या पर ध्यान केंद्रित अध्ययनों के लिए जीन जोड़तोड़ के दौरान एचसीएस की बड़ी संख्या को बनाए रखने के लिए लागू किया जा सकता है और hematopoiesis में ।

अंत में, विधि यहां वर्णित पूर्व vivo विस्तार के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है दोनों मानव और murine एचसीएस और विशिष्ट नैदानिक अनुप्रयोगों के अनुरूप किया जा सकता है और साथ ही बुनियादी अनुसंधान में जांच की एक व्यापक स्पेक्ट्रम के लिए ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम के लिए NYSTEM अनुदान C030136 द्वारा समर्थित किया गया था आरएचताहिलियानी हम उनकी प्रतिक्रिया और पांडुलिपि के संशोधन के लिए Bartek Jablonski शुक्रिया अदा करना चाहूंगा

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Expansion Media Sigma-Aldrich Stemline II stem cell expansion media S0192-500ML
AO/PI (acridine orange/propidium iodide) staining solution for live/dead Mammalian nucleated cells. Nexcelom CS2-0106-25mL
APC Mouse Anti-Human CD34 Clone 581 BD BIOSCIENCE 555824
APC Mouse IgG1, κ Isotype Control Clone MOPC-21 BD BIOSCIENCE 555751
autoMACS Rinsing Solution MACS Miltenyi Biotec 130-091-222
BD Falcon 15 mL Tube BD Biosciences 352097
BD Falcon 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube BD Biosciences 352063
BD Falcon 50 mL Tube BD Biosciences 352098
Bovine serum albumine solution Sigma-Aldrich A8412
CD34 MicroBead Kit, contain cd34 beads and fcr blocking reagent, human Miltenyi Biotec 130-046-703
Cell analyzer BD Biosciences FACS Canto II
Cell analyzer and sorter BD Biosciences FACS Aria II
Cell counter Nexcelom Cellometer Auto 2000 Cell Viability Counter
Cell separator device autoMACS Pro Separator Miltenyi Biotec
Counting Chambers Nexcelom CHT4-PD100-002
Density gradient media GE Healthcare Bio-Sciences AB 17-1440-03
Ethylene diamine tetra-acetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich E8008-100ML
FITC anti-human CD90 (Thy1) Clone 5E10 BIOLEGEND 328108
FITC Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl (FC) Antibody BIOLEGEND 400109
Inverted microscope
PBS Corning cellgro 21-040-CV
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122
Recombinant Human Flt-3 Ligand Protein R&D Systems 308FKN
Recombinant Human IL-3 Protein (IL-3) R&D Systems 203-IL
Recombinant Human SCF Protein R&D Systems 255-SC
Recombinant Human Thrombopoietin Protein (TPO) R&D Systems 288-TP
Total Antibody Compensation Bead Kit thermofisher A10497
Umbilical Cord-blood Placental Blood Program at the New York Blood Center http://nybloodcenter.org/products-services/blood-products/national-cord-blood-program/cord-blood-101/
Valproic acid sodium salt Sigma-Aldrich P4543

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References

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चिकित्सा अंक १४६ गर्भनाल रक्त CD34+ कोशिकाओं पूर्व vivo संस्कृति Vpa hscs पूर्व vivo विस्तार प्रत्यारोपण जीन थेरेपी
पूर्व Vivo मानव गर्भनाल रक्त से टेम स्टेम कोशिकाओं के विस्तार-व्युत्पंन CD34<sup>+</sup> कोशिकाओं Valproic एसिड का उपयोग
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Papa, L., Djedaini, M., Hoffman, R.… More

Papa, L., Djedaini, M., Hoffman, R. Ex Vivo Expansion of Hematopoietic Stem Cells from Human Umbilical Cord Blood-derived CD34+ Cells Using Valproic Acid. J. Vis. Exp. (146), e59532, doi:10.3791/59532 (2019).

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