फल मक्खी, Drosophila melanogasterके सेलुलर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का आकलन, Vivo Phagocytosis परख में एक का उपयोग
Summary
यह प्रोटोकॉल वयस्क Drosophila मेलानोगैस्टर में vivo phagocytosis परख में एक का वर्णन phagocyte मांयता और माइक्रोबियल संक्रमण की मंजूरी मात्रा ।
Abstract
सभी जानवरों में, सहज प्रतिरक्षा रोगजनकों की एक व्यापक स्पेक्ट्रम के खिलाफ एक तत्काल और मजबूत रक्षा प्रदान करता है । Humoral और सेलुलर प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं सहज प्रतिरक्षा की मुख्य शाखाओं रहे हैं, और इन प्रतिक्रियाओं को विनियमित कारकों के कई विकासवादी और स्तनधारियों के बीच का संरक्षण कर रहे हैं । फेगोसाइटोसिस, सेलुलर सहज प्रतिरक्षा के केंद्रीय घटक, प्रतिरक्षा प्रणाली के विशेष रक्त कोशिकाओं द्वारा किया जाता है । फल मक्खी, Drosophila मेलानोगैस्टर, एक शक्तिशाली आनुवंशिक मॉडल के रूप में उभरा है आणविक तंत्र और पूरे जानवरों में भगोसाइटोसिस के शारीरिक प्रभावों की जांच । यहां हम एक इंजेक्शन का प्रदर्शन-vivo phagocytosis परख में आधारित कण और Drosophila रक्त कोशिकाओं, hemocytes द्वारा विनाश को बढ़ाता है । प्रक्रिया शोधकर्ताओं ठीक कण एकाग्रता और खुराक को नियंत्रित करने के लिए अनुमति देता है, यह समय की एक छोटी राशि में अत्यधिक reproducible परिणाम प्राप्त करने के लिए संभव बनाने. प्रयोग मात्रात्मक, प्रदर्शन करने में आसान है, और मेजबान कारकों है कि रोगज़नक़ मांयता को प्रभावित करने के लिए स्क्रीन पर लागू किया जा सकता है, और मंजूरी ।
Introduction
जन्मजात प्रतिरक्षा सुरक्षा रोगजनक रोगाणुओं के खिलाफ रक्षा की पहली पंक्ति के रूप में । इन प्रतिक्रियाओं कार्यात्मक humoral और सेलुलर सहज प्रतिरक्षा में विभाजित किया जा सकता है, दोनों जिनमें से germline द्वारा मध्यस्थता कर रहे हैं-इनकोडिंग पैटर्न मान्यता रिसेप्टर्स (PRRs) कि नब्ज रोगज़नक़-जुड़े आणविक पैटर्न (PAMPs)1. सिग्नलिंग के कई मार्ग और प्रभावकारिता तंत्र जन्मजात प्रतिरक्षा के स्तनधारियों में संरक्षित कर रहे हैं और इस तरह के सूत्रकृमि, Caenorहैबडाइटिस एलिगेंस , और फल मक्खी, Drosophila melanogaster2के रूप में अकशेरों । फल मक्खी3संक्रामक सूक्ष्मजीवों के खिलाफ मेजबान रक्षा अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली प्रणाली के रूप में उभरा है । Drosophila आनुवंशिक रूप से tractable है, आसानी से और सस्ते प्रयोगशालाओं में मागणी, और एक छोटी पीढ़ी के समय है । इसके अलावा, फल मक्खी रोगाणुओं की एक सरणी के खिलाफ अत्यधिक कुशल सुरक्षा दर्शाती है, वायरल, बैक्टीरियल, कवक, या परजीवी रोगज़नक़े के खिलाफ मेजबान प्रतिरक्षा की परीक्षा को सक्षम करने ।
Drosophila इम्युनिलॉजिस्ट ऐतिहासिक रूप से आगे आनुवंशिक स्क्रीन, जीनोम चौड़ा आरएनए मध्यस्थता हस्तक्षेप (rna) कीट कोशिका लाइनों की स्क्रीनिंग का उपयोग किया है, और पूर्व मौजूदा उत्परिवर्ती मक्खी उपभेदों सहज प्रतिरक्षा की जांच करने के लिए अग्रणी- पहचान और कई विकासवाद के लक्षण वर्णन humoral प्रतिरक्षा रास्ते4,5,6,7,8। Humoral सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया, यकीनन, सबसे अच्छा फल मक्खियों में प्रतिरक्षा रक्षा की विशेषता है । संक्रमण के बाद, humoral प्रतिक्रिया hemolymph में रोगाणुरोधी पेप्टाइड (AMP) अणुओं के उत्पादन और प्रणालीगत रिहाई की ओर जाता है, कीड़े में रक्त के बराबर. AMPs अत्यधिक संरक्षित टोल और आईएमडी सिग्नलिंग मार्ग द्वारा उत्पादित कर रहे हैं । टोल मार्ग स्तनधारी TLR/IL-1R रिसेप्टर सिग्नलिंग के लिए समजात है, और आईएमडी मार्ग एक स्तनधारी ट्यूमर परिगलन फैक्टर-अल्फा सिग्नलिंग के लिए समजातीय है । ड्रोसोफिला में, टोल सिग्नलिंग ग्राम पॉजिटिव बैक्टीरिया, कवक, और ड्रोसोफिला एक्स वीरुएस6,9,10 और आईएमडी सिग्नलिंग द्वारा प्रेरित किया जाता है ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया11 ,12.
सेलुलर प्रतिरक्षा, encapsulation के शामिल, मेलानीकरण, और आक्रामक रोगजनकों के phagocytosis, विशेष रक्त कोशिकाओं द्वारा किए गए hemocytes13बुलाया । फल मक्खी में hemocytes के तीन वर्गों रहे हैं: क्रिस्टल कोशिकाओं, पटलीय, और plasmatocytes13. क्रिस्टल कोशिकाओं, जो लार्वा में परिसंचारी hemocytes के 5% बनाने के लिए, जारी proPhenoloxidase (proPO) एंजाइम रोगजनकों और मेजबान ऊतकों के मेलानीकरण के लिए अग्रणी घाव साइटों पर. लैम्लोसाइट्स, जो सामान्य रूप से स्वस्थ भ्रूण या लार्वा में नहीं पाए जाते हैं, वे आसंन कोशिकाएं होती हैं जो विदेशी वस्तुओं को संपुटित करती हैं । इन कोशिकाओं को प्यूप्रिएशन पर प्रेरित किया जाता है या जब लार्वा में परजीवी तसला अंडे जमा होते हैं । फेगोसाइटिक plasmatocytes, जो लार्वा में परिसंचारी hemocytes के ९५% बनाने के लिए और वयस्कों में सभी शेष hemocytes, विकास के दौरान ऊतक remodeling में एक भूमिका निभाते है और विशेष रूप से, Drosophila सेलुलर प्रतिरक्षा के मुख्य effector सेल के रूप में सेवा करते हैं ।
फैगोसाइटोसिस जन्मजात प्रतिरक्षा रक्षा की एक तत्काल और महत्वपूर्ण लाइन; रोगाणुओं है कि उल्लंघन मेजबान उपकला बाधा जल्दी से घिरा हुआ है और भॉगोसाइटिक रक्त कोशिकाओं द्वारा सफाया (भगोशितोसिस के सेल जीव विज्ञान की एक व्यापक समीक्षा के लिए संदर्भ देखें 14) । यह प्रक्रिया शुरू की जाती है जब जर्मलाइन-एनकोडेड पैटर्न मान्यता रिसेप्टर्स (PRRs) hemocytes पर रोगाणु संबंधित आणविक पैटर्न (PAMPs) माइक्रोब्स की पहचान. एक बार अपने लक्ष्य के लिए बाध्य, prrs cascades संकेत है कि ऐक्टिन cytoskeleton remodeling के माध्यम से स्यूडोपॉड्स के गठन के लिए नेतृत्व शुरू । स्यूडोपॉड सूक्ष्मजीव को घेर लेते हैं, जिसे बाद में झंकृत किया जाता है और एक नवजात अंगक में भली भांति किया जाता है । रोगाणु नष्ट हो जाते हैं क्योंकि फेगोसोम फेगोसोम की प्रक्रिया से गुजरता है, जब फेगोसोम रक्तकोशिका के आंतरिक भाग की ओर तस्करी करता है और लाइसोसोम के साथ बातचीत की एक श्रृंखला के माध्यम से acidifies । विट्रो और सेल में जीव विज्ञान के अध्ययन में स्तनधारी प्राथमिक कोशिकाओं की पहचान करने और कारक है कि इस तरह के स्तनधारी एफसी-गामा रिसेप्टर और C3b रिसेप्टर्स15,16के रूप में phagocytosis, को विनियमित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है । फिर भी, बड़े पैमाने पर स्क्रीन या vivo अध्ययन में निष्पादित करने की क्षमता स्तनधारी सिस्टम में सीमित हैं ।
यहां हम एक वयस्क फल मक्खियों, जो पहली २०००17में डेविड Schneider की प्रयोगशाला द्वारा शुरू की प्रक्रिया पर आधारित है में phagocytosis के लिए vivo परख में मौजूद है । Schneider प्रयोगशाला से पता चला कि seसीले hemocytes पेट पृष्ठीय पोत के साथ संकुल आसानी से phagocytose polystyrene मोती और बैक्टीरिया । फगोसाइटोसिस कल्पना करने के लिए, मक्खियों प्रतिदीप्ति लेबल कणों के साथ इंजेक्शन कर रहे हैं (जैसे ई. कोलाई के साथ लेबल फ्लोरेसेइन आइसोथायोसायनेट (ई.कोलाई-fitc)), 30 मिनट के लिए इनक्बल्ड करने के लिए hemocytes समय कणों निगल करने के लिए अनुमति देते हैं, और फिर ट्राइपैन ब्लू के साथ इंजेक्ट किया जाता है, जो इनक्यूबेशन अवधि के दौरान कणों की प्रतिदीप्ति को नहीं फैलाए । मक्खी पृष्ठीय जहाजों तो एक औंधा फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग कर imaged हैं । यह लाभदायक कागज, एक अपेक्षाकृत सरल प्रयोग का उपयोग करते हुए, प्रदर्शन किया है कि hemocytes फैगोसाइटोज बैक्टीरिया और लेटेक्स मोती, कि जीवाणु भक्षककोशिका पूर्व से हिचकी जा सकता है लेटेक्स मोती के साथ मक्खियों इंजेक्शन, और है कि दोनों सेलुलर और humoral बिना मक्खियों प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को भी ई.कोलाई के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं । इस रिपोर्ट में प्रस्तुत परख Schneider लैब के काम पर बनाता है विवो phagocytosis में पृष्ठीय पोत से घिरा हुआ कणों की प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापने के द्वारा निर्धारित hemocytes ।
स्तनधारी प्रणालियों में लिया दृष्टिकोण के समान, drosophila आनुवंशिकी शुरू में जीनोम चौड़ा इस्तेमाल किया विट्रो rnai स्क्रीन में सेलुलर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के लिए आवश्यक जीन की पहचान करने के लिए18,19,20 ,21,22,23. हालांकि, vivo phagocytosis परख में वयस्क के विकास के अनुवर्ती प्रयोगों को आसानी से पूरे जानवरों में किया जा सक्षम है, इस प्रकार शोधकर्ताओं जैविक विट्रो अध्ययन में पहचान कारकों की भूमिका को सत्यापित करने की अनुमति । इस तरह के साथ मामला था ट्रांस्मेल् ड रिसेप्टर आदमखोर, जो पहली बार एक RNAi स्क्रीन में एक जीवाणु ग्राही के रूप में पहचान की गई S2 की कोशिकाओं का उपयोग कर24 और फिर बाद में मध्यस्थता करने के लिए दिखाया गया escherichia कोलाई (ई.कोलाई), enterococcus फेकैलिस, और स्टैफिलोकोकस ऑरियस (एस. ऑरियस) वयस्कों में फगोसाइटोसिस25.
हमारे प्रयोगशाला आगे आनुवंशिक स्क्रीन और जीनोम व्यापक एसोसिएशन के अध्ययन में vivo phagocytosis परख में कार्यरत ( Drosophila आनुवंशिक संदर्भ पैनल (dgrp) का उपयोग कर) उपंयास जीन है कि वयस्क hemocytes में phagocytosis को विनियमित की पहचान । इन अध्ययनों के लक्षण वर्णन रिसेप्टर्स PGRP-SC1A और PGRP-एसए26, intracellular आशय के अवैध व्यापार Rab1427, ग्लूटेमेट ट्रांसपोर्टर polyphemus28, और आरएनए-बाध्यकारी प्रोटीन फॉक्स-129के लिए नेतृत्व किया ।
हमें आशा है कि भविष्य vivo भगोसाइटोसिस में शामिल स्क्रीन अतिरिक्त जीन है कि Drosophilaमें सेलुलर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के लिए महत्वपूर्ण है की पहचान करने के लिए नेतृत्व कर सकता है । इस तरह के dgrp या drosophila सिंथेटिक जनसंख्या संसाधन (dspr) के रूप में पूरी तरह से sequenced अंत: प्रजात लाइनों, का उपयोग कर स्क्रीन, phagocytosis या hemocyte विकास को प्रभावित करने वाले प्राकृतिक वेरिएंट की पहचान कर सकते हैं । इसके अलावा, तकनीक drosophila की अन्य प्रजातियों में अपनाया जा सकता है या इस तरह के २५० drosophila प्रजातियों के संग्रह के रूप में नए समुदाय संसाधनों, स्क्रीन करने के लिए इस्तेमाल किया राष्ट्रीय Drosophila प्रजाति स्टॉक सेंटर द्वारा बनाए रखा (ndssc ) कॉर्नेल में । इन प्रयोगों से बाहर किया जा सकता है प्रतिदीप्ति-लेबल जीवाणु या कवक दीवार bioparticles कि व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है या जीवाणु या कवक प्रजातियों में से किसी भी संख्या का उपयोग किया जा सकता है-बशर्ते कि सूक्ष्म जीव फ्लोरोसेंट मार्कर व्यक्त .
Protocol
Representative Results
Discussion
वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध है, प्रतिदीप् त लेबल कणों सामान्य (०.२ μm कार्बोक्सिलेट-संशोधित microspheres) या रोगाणुओं की phagocytosis (प्रतिदीप् ति-लेबल गर्मी-या रासायनिक रूप से मारे गए बैक्टीरिया या खमीर) में भगोसाइटो…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों ने वीवो फैगोसाइटोसिस प्रयोगों में ले जाने में सहायता के लिए डॉ बेथ गोंजालेज और डॉ अपरजिता गर्ग का धन्यवाद । एक NSF UMD अग्रिम बीज अनुदान और UMD NIH T32 प्रशिक्षण अनुदान, सेल और आणविक जीव विज्ञान (CMB) और मेजबान-रोगज़नक़ बातचीत (HPI), इस काम के वित्त पोषित ।
Materials
| 0.2μm Red Fluorescent Carboxylate Modified FluoSpheres | Invitrogen | F8810 | Fluorescently-labeled latex beads to test general phagocytic capacity of phagocytes. (~580/~605 nm) Inject a 1:20 dilution in PBS with 5% dye. |
| 5430-10 PicoNozzle Kit | World Precision Instruments | 5430-10 | Holder for 1.0mm pipette |
| E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate | Invitrogen | E13231 | Killed E. coli labeled with Alexa Fluor 488. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~495/~519 nm) |
| E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugate | Invitrogen | E23370 | Killed E. coli labeled with Alexa Fluor 594. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~590/~617 nm) |
| E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Fluorescein conjugate | Invitrogen | E2861 | Killed E. coli labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~494/~518 nm) |
| E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Texas Red conjugate | Invitrogen | E2863 | Killed E. coli labeled with Texas Red. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~595/~615 nm) |
| E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Texas Red conjugate | Invitrogen | E2863 | Killed E. coli labeled with Texas Red. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~595/~615 nm) |
| Needle Pipette Puller | David Kopf Instruments | Model 725 | |
| pHrodo Red E. coli BioParticles Conjugate for Phagocytosis | Invitrogen | P35361 | Killed E. coli labeled with pHrodo Red. Use to test phagocyte reconition, uptake, and phagosome maturation of gram-negative bacteria. (~560/~585 nm). No need to quench with Trypan Blue. |
| pHrodo Red S. aureus BioParticles Conjugate for Phagocytosis | Invitrogen | A10010 | Killed S. aureus labeled with pHrodo Red. Use to test phagocyte reconition, uptake, and phagosome maturation of gram-positve bacteria. (~560/~585 nm). No need to quench with Trypan Blue. |
| Pneumatic PicoPump PV820 | World Precision Instruments | SYS-PV820 | The World Precision Instruments Pneumatic PicoPump PV820 uses differential pressures to hold liquid in the glass needle between injections. The user manually controls short bursts of gas pressure to expel the liquid – allowing delivery of sub-nanoliter volumes. The amount of liquid delivered depends on two main variables – the size of the glass needle opening and the amount of time injection pressure is applied. set the instrument to 100 ms “TIMED” mode. |
| S. aureus (Wood Strain without protein A) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate | Invitrogen | S23371 | Killed S. aureus labeled with Alexa Fluor 488. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-positive bacteria. (~495/~519 nm) |
| S. aureus (Wood Strain without protein A) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugate | Invitrogen | S23372 | Killed S. aureus labeled with Alexa Fluor 594. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-positive bacteria. (~590/~617 nm) |
| S. aureus (Wood Strain without protein A) BioParticles, Fluorescein conjugate | Invitrogen | E2851 | Killed S. aureus labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-positive bacteria. (~494/~518 nm) |
| Thin Wall Glass Capillaries | World Precision Instruments | TW100F-3 | Needles for injection. OD = 1.0 mm |
| Trypan Blue Solution (0.4%) | Sigma | T8154 | Used to quench extracellular fluorescence of Fluorescein, Alexa Fluor, or Texas Red labeled particles. |
| ZEISS SteREO Microscope (Discovery.V8) | Zeiss | SteREO Discovery.V8 | Inverted fluorescence microscope for imaging flies. Use a digital camera (example: AxioCam HC camera) and the accompanying software (example: AxioVision 4.7 software) to take pictures. |
| Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate | Invitrogen | Z23373 | Killed labeled with Alexa Fluor 488. Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~495/~519 nm) |
| Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugate | Invitrogen | Z23374 | Killed labeled with Alexa Fluor 594. Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~590/~617 nm) |
| Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Fluorescein conjugate | Invitrogen | Z2841 | Killed labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~494/~518 nm) |
| Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Texas Red | Invitrogen | Z2843 | Killed labeled with Texas Red. Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~595/~615 nm) |
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