Utarbeidelse av nøytralt-ladet, pH-responsive polymer nanopartikler for cytosolic siRNA levering

Summary

Metoder for å forberede og karakterisere fysikalsk egenskaper og bioactivity av nøytralt-ladet, pH-responsive siRNA nanopartikler er presentert. Kriterier for vellykkede siRNA-nanomedisiner som størrelse, morfologi, overflate ladning, siRNA-lasting og gendeaktivering diskuteres.

Abstract

Suksessen til siRNA som en målrettet molekylær medisin er avhengig av sin effektive cytosolic levering til celler i vevet i patologi. Klinisk suksess for behandling av tidligere ‘ undruggable ‘ lever sykdoms mål med siRNA har blitt oppnådd. Men effektiv tumor siRNA levering nødvendiggjør ytterligere farmakokinetiske design hensyn, inkludert lang sirkulasjon tid, Evasion av klaring organer (f. eks, lever og nyrer), og tumor penetrasjon og oppbevaring. Her beskriver vi utarbeidelse og in vitro fysikalsk/biologisk karakterisering av polymer nanopartikler designet for effektiv siRNA levering, spesielt til ikke-hepatic vev som svulster. Den siRNA nanopartikler er utarbeidet av elektrostatisk kompleks av siRNA og diblokk kopolymer Poly (etylen glykol-b-[2-(dimetylamino) etanol akrylat-co-butyl AKRYLAT]) (PEG-DB) for å danne polyion komplekser ( polyplexes) der siRNA er sequestered innenfor polyplex kjernen og PEG danner en hydrofile, nøytralt-ladet Corona. Videre DB blokken blir membran-lytisk som blemmer av endolysosomal veien acidify (< pH 6,8), utløser endosomal rømme og cytosolic levering av siRNA. Metoder for å karakterisere de fysikalsk egenskapene til siRNA nanopartikler som størrelse, overflate ladning, partikkel morfologi og siRNA-lasting er beskrevet. Bioactivity av siRNA nanopartikler måles ved hjelp av luciferase som en modell gen i en rask og høy gjennomstrømming gen demping analysen. Tegninger hvilke admission card disse Initial prøver (som PEG-DB-basert polyplexes) er betraktet som passende for oversettelse å prekliniske dyr studier vurderingen leveringen av siRNA å svulst eller annet steder av patologi.

Introduction

Fordi siRNAs hemme oversettelsen av proteiner fra mRNA sekvenser, kan de teoretisk brukes til narkotika alle kjente patologi^1,2,3,4,5. Bruken av siRNA i medisin er imidlertid begrenset av den omfattende, fattige farmakokinetiske profilen til siRNA molekyler^6,7. Når injisert intravenøst, siRNAs er raskt tømmes gjennom nyrene og/eller degradert av nukleaser^8,9. På grunn av sin store størrelse og negative ladning, kan siRNA ikke gå inn i celler eller unnslippe endolysosomal veien for å få tilgang til RNA-indusert demping kompleks (RISC) som ligger i stoffer^{10,11,12, 13 i år}. Dermed har omfattende innsats fokusert på design og implementering av siRNA leveranse strategier¹⁴. Dette arbeidet har i stor grad fokusert på utvikling av lipid-og polymer-baserte nanopartikler som pakke siRNA, beskytte den fra klarering og degradering in vivo, og initiere cellulær opptak og endosomal flykte gjennom ionebyttermembraner, kationiske Amin grupper. Mange pre-klinisk suksesser har blitt rapportert og sist, den første kliniske suksessen er rapportert for nanopartikkel-baserte hepatic siRNA levering til behandling arvelig transthyretin-mediert (hATTR) amyloidose¹⁵.

Det er mange kreftfremkallende gener som for tiden er “undruggable” av konvensjonelle farmakologi (dvs. små molekyl narkotika), motiverende utformingen av polymer siRNA nanopartikler (si-NPs) for å behandle kreft¹⁶. Det finnes imidlertid et eget sett med utformings parametere som må vurderes for ikke-hepatic siRNA-levering. Leveringssystemet må skjerme kationiske ladning av polyplex som forårsaker Agglutinasjon innenfor systemisk sirkulasjon^17,18,19. For tumor levering, spesielt, si-np stabilitet er viktig å gi gave lang sirkulasjon og dermed økt akkumulering innen svulster via forbedret permeabilitet og oppbevaring (EPR) effekt^20,21. Videre er kontroll over si-NP størrelse viktig siden bare nanopartikler ca 20-200 NM diameter i størrelse utnytte EPR²², og mindre si-NPs (~ 20-50 NM diameter) utstillingen forbedret tumor penetrasjon over større størrelser nanopartikler og mikropartikler²³.

For å håndtere disse ekstra design begrensningene for systemisk tumor levering av siRNA etter intravenøs administrering, er det utviklet nøytralt pH-responsiv si-NPs (figur 1)²⁴. Disse si-NPs er pegylert, eller sist, Zwitterionated²⁵, for nøytral overflate ladning og resistens mot absorpsjon av protein og opsonization i sirkulasjon. Siden de ikke kan stole utelukkende på kationiske karakter for å kjøre intracellulære levering, er ekstremt effektiv endosomal å unnslippe avgjørende for å oppnå potent gen-deaktivering. Følgelig er kjernen i disse si-NPs består av en svært endosomolytic kjerne som er inert på ekstracellulære pH (7,4), men som utløses i en Switch-lignende måte i de surgjort forholdene i endolysosomal veien [pH 6,8 (tidlig endosomes)-5,0 ( lysosomer)]. Endelig, en blanding av kationiske og hydrofobe innhold i kjernen av si-NPs gir både elektrostatisk og Van der Waals stabilisering styrker, forbedre stabiliteten i si-NPs i blodet i forhold til bare kationiske systemer.

Integreringen av mange funksjoner i en relativt enkel design er mulig ved hjelp av reversibel tillegg-fragmentering kjeden Transfer (RAFT) kontrollerte polymerisering å produsere polymerer med kompleks arkitektur og presis sammensetning. Å produsere si-NPs med nøytral overflate ladning, pH-respons, og NP stabilitet, er FLÅTEN som brukes til å syntetisere Poly (etylen glykol-b-[2-(dimetylamino) etanol akrylat-co-butyl AKRYLAT]) (PEG-DB; Figur 1a). PEG-DB er elektrostatisk complexed med siRNA, forming si-NPs med en PEG Corona og DB/siRNA kjerne (figur 1B). PEG danner et inert, nøytralt hydrofile lag på si-NP Corona. DB-blokken består av en 50:50 molar ratio på 2-(dimetylamino) etanol akrylat (DMAEMA) og butyl akrylat (BMA). Kationiske DMAEMA elektrostatisk komplekser negativt ladet siRNA. BMA Self-Associates i NP-kjernen av van der Waals interaksjoner, økende NP stabilitet. Sammen, DMAEMA og BMA meddele pH-avhengig lipid bilayer-lytisk oppførsel til DB polymer blokk. Ved ekstracellulære pH er DB-blokken sequestered til si-NP-kjernen og er inert til lipid bilayers. Under Sure forhold, slik som de i endolysosomal veien, ionebyttermembraner DMAEMA innenfor DB blokken Letter Proton svamp effekt, der endosomal bufring fører til osmotisk hevelse og brudd²⁶. I tillegg hydrofobe BMA andeler i DB-blokken aktivt integreres i og lyse lipid bilayers, noe som resulterer i potent endosomolysis. Således, siRNA er complexed med PEG-DB å blankett si-NPs det er nøytralt-ladet og høylig stabile for ekstracellulære pH bortsett fra hvilke avbryte lipid bilayers for syrlig pH, forsikrer cytosolic leveranse av det siRNA payload.

Heri beskrives de eksperimentelle prosedyrene for å produsere si-NPs fra PEG-DB. Metoder for å karakterisere fysikalsk parametre og bioactivity av si-NPs er presentert og diskutert. For å raskt kunne vurdere si-NP-bioactivity, brukes luciferase som modell gen for knockdown studier. Firefly luciferase er proteinet som er ansvarlig for “gløden” av ildfluene²⁷. Følgelig, pattedyrceller transfekterte med Firefly luciferase genet produsere en Puerto Mosquito “glød” som kan fanges opp ved hjelp av en luminometeret å kvantifisere nivåer av luciferase uttrykk. Her bruker vi luciferase å vurdere bioactivity av si-NPs ved å levere siRNA mot luciferase og kvantifisere tilsvarende reduksjon i bioluminesens i luciferase-uttrykker celler i forhold til celler som mottar en forvrengt siRNA.

Protocol

1. klargjøring og karakterisering av si-NPs si-NP Forberedelse Oppløse polymer i 10 mM sitronsyre buffer (pH 4,0) ved 3,33 mg/mL. Polymer kan først oppløses ved 10x konsentrasjon i etanol for å sikre oppløsning.Merk: polymer kan oppløses ved lavere konsentrasjoner, men bruk ved konsentrasjoner over 3,33 mg/mL kan forhindre homogen NP-dannelse. Legg til siRNA (50 μM i di2O) for å resultere i N+:P- forhold på 10. Bland polymer og siRNA løsninger g…

Representative Results

Noen viktige egenskaper ved effektiv si-NPs for in vivo siRNA levering er riktig størrelse (~ 20-200 NM diameter), siRNA emballasje, og gendeaktivering bioactivity. Selv om dette ikke er en uttømmende liste (som omtalt i diskusjonen), bør disse grunnleggende egenskapene bekreftes før du vurderer videre testing av en formulering. Figur 2 illustrerer karakterisering av si-np størrelse og overflat…

Discussion

Si-NPs beskrevet her er dannet av elektrostatisk sammenslutning av anioniske siRNA og kationiske polymerer i polyion komplekser (polyplexes). Elektrostatisk kompleks av siRNA og kationiske DB blokk av PEG-DB polymerer er tilrettelagt ved å blande ved lav pH (4,0). Ved pH 4,0, er DMAEMA svært protonerte, og følgelig DB blokken er svært ladet. Dette sikrer at polymerer oppløses som unimers i løsning i motsetning til forming miceller og at DB komplekser effektivt med siRNA. Deretter justeres pH-verdien til nøytral (p…

Materials

0.45 mm pore-size syringe filters	Thermo Fisher Scientific	F25133	17 mm diameter, PTFE membrane
0-14 pH test strips	Millipore Sigma	P4786
10x TAE buffer	Thermo Fisher Scientific/Invitrogen	AM9869
6-7.7 pH test strips	Millipore Sigma	P3536
96-well black walled plates	Corning	3603	Tissue-culture treated
Agarose Powder	Thermo Fisher Scientific/Invitrogen	16500
Citric acid monohydrate	Millipore Sigma	C1909
dibasic sodium phosphate dihydrate	Millipore Sigma	71643
D-luciferin	Thermo Fisher Scientific	88294	Monopotassium Salt
DMEM	Gibco	11995065	High glucose and pyruvate
Ethanol	Millipore Sigma	459836
ethidium bromide	Thermo Fisher Scientific/Invitrogen	15585011
FBS	Gibco	26140079
loading dye	Thermo Fisher Scientific/Invitrogen	R0611
Luciferase siRNA	IDT	N/A	Antisense Strand Sequense: GAGGAGUUCAUUAUCAGUGCAAUUGUU Sense Strand Sequense: CAAUUGCACUGAUAAUGAACUCCT*C* *DNA bases
MDA-MB-231 / Luciferase (Bsd) stable cells	GenTarget Inc	SC059-Bsd	Luciferase-expressing cells sued to assess si-NP bioactivity
monobasic sodium phosphate monohydrate	Millipore Sigma	S9638
Scarmbled siRNA	IDT	N/A	Antisense Strand Sequense: AUACGCGUAUUAUACGCGAUUAACGAC Sense Strand Sequense: CGUUAAUCGCGUAUAAUACGCGUA*T* *DNA bases
square polystyrene cuvettes	Fisher Scientific	14-955-129	4.5 mL capacity
TEM grids	Ted Pella, Inc.	1GC50	PELCO Center-Marked Grids, 50 mesh, 3.0mm O.D., Copper
Trisodium citrate dihydrate	Millipore Sigma	S1804
uranyl acetate	Polysciences, Inc.	21447-25