La preparación de nanopartículas poliméricas con capacidad de pH, cargadas de neutralmente, para la entrega de siRNA citosólica
Summary
Se presentan los métodos para preparar y caracterizar las propiedades fisicoquímicas y la bioactividad de las nanopartículas de siRNA con respuesta al pH, que son neutralmente cargadas. Se discuten los criterios para los nanomedicamentos siRNA exitosos, como el tamaño, la morfología, la carga superficial, la carga de siRNA y el silenciamiento del gen.
Abstract
El éxito de siRNA como medicina molecular dirigida depende de su eficiente entrega citosólica a las células dentro del tejido de la patología. Se ha logrado el éxito clínico para el tratamiento de los objetivos de enfermedad hepática previamente ‘ no druggable ‘ con siRNA. Sin embargo, la entrega eficiente de siRNA tumoral requiere consideraciones adicionales de diseño farmacocinético, incluyendo tiempo de circulación prolongado, evasión de órganos de aclaramiento (p. ej., hígado y riñones), y penetración y retención de tumores. Aquí describimos la preparación y la caracterización fisicoquímica/biológica in vitro de nanopartículas poliméricas diseñadas para el parto eficiente de siRNA, particularmente a los tejidos no hepáticos como los tumores. Las nanopartículas de siRNA se preparan mediante la compleción electrostática de siRNA y el copolímero de dibloque poli (etilenglicol-b-[2-(dimetilamino) etil metacrilato-Co-butilo metacrilato]) (PEG-dB) para formar complejos poliónicos ( poliplexos) donde siRNA es secuestrado dentro del núcleo de POLIPLEX y PEG forma una corona hidrófila, con carga neutra. Por otra parte, el bloque DB se convierte en membrana-lítica como vesículas de la vía endolisosomal acidificación (< pH 6,8), desencadenando la fuga endosómica y la entrega citosólica de siRNA. Se describen los métodos para caracterizar las características fisicoquímicas de las nanopartículas de siRNA, como el tamaño, la carga superficial, la morfología de las partículas y la carga de siRNA. La bioactividad de las nanopartículas de siRNA se mide utilizando luciferasa como un gen modelo en un ensayo de silenciamiento del gen rápido y de alto rendimiento. Los diseños que superan estas pruebas iniciales (como los poliplexos basados en PEG-DB) se consideran apropiados para la traducción a estudios en animales preclínicos que evalúan la entrega de siRNA a tumores u otros sitios de patología.
Introduction
Debido a que los siRNAs inhiben la traducción de las proteínas de las secuencias de mRNA, teóricamente pueden ser utilizados para drogas todas las patologías conocidas1,2,3,4,5. Sin embargo, el uso de siRNA en medicina está limitado por el perfil farmacocinético de las moléculas de siRNA6,7. Cuando se inyecta por vía intravenosa, los siRNAs se borran rápidamente a través de los riñones y/o se degradan mediante nucleasas8,9. Debido a su gran tamaño y carga negativa, siRNA no puede entrar en las células o escapar de la vía endolisosomal para acceder al complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC) que reside en el citosol10,11,12, 13. Así, un extenso esfuerzo se ha centrado en el diseño e implementación de las estrategias de entrega de siRNA14. Este esfuerzo se ha centrado en gran medida en el desarrollo de nanopartículas a base de lípidos y polímeros que empaquetan siRNA, la protegen del aclaramiento y la degradación in vivo, e inician la captación celular y el escape endosómico a través de grupos de Amina catiónica ionizable. Se han notificado muchos éxitos preclínicos y, más recientemente, se ha notificado el primer éxito clínico de la entrega de siRNA hepática basada en nanopartículas para tratar la amiloidosis15mediada por transthyretin hereditaria (hattr).
Hay muchos genes causantes del cáncer que actualmente son “no druggable” por Farmacología convencional (es decir, fármacos de moléculas pequeñas), motivando el diseño de nanopartículas de siRNA poliméricas (si-NPs) para tratar el cáncer16. Sin embargo, hay un conjunto separado de parámetros de diseño que deben tenerse en cuenta para la entrega no hepática de siRNA. El sistema de entrega debe proteger la carga catiónica del Polyplex que causa la aglutinación dentro de la circulación sistémica17,18,19. Para la entrega del tumor, específicamente, la estabilidad del si-NP es esencial para dotar de una larga circulación y así aumentar la acumulación dentro de los tumores a través del efecto de permeabilidad y retención mejorada (EPR)20,21. Además, el control sobre el tamaño del si-NP es esencial ya que sólo las nanopartículas de aproximadamente 20 – 200 nm de diámetro en tamaño aprovechan EPR22, y el si-NPS más pequeño (~ 20 – 50 nm de diámetro) exhiben una mejor penetración tumoral sobre nanopartículas de mayor tamaño y micropartículas23.
Para abordar estas limitaciones adicionales de diseño para la administración de tumores sistémicos de siRNA después de la administracion intravenosa, se han desarrollado los si-NPs con capacidad neutralmente, con pH-sensible (figura 1)24. Estos si-NPs son PEGylated, o más recientemente, Zwitterionated25, para la carga superficial neutral y la resistencia a la adsorción proteica y la opsonización en circulación. Dado que no pueden depender únicamente del carácter catiónico para impulsar el parto intracelular, es imprescindible un escape endosómico extremadamente eficiente para lograr un potente silenciamiento del gen. En consecuencia, el núcleo de estos si-NPs se compone de un núcleo altamente endosomolítico que es inerte al pH extracelular (7,4), pero que se desencadena de una manera de tipo interruptor en las condiciones acidificadas de la vía endolisosomal [pH 6,8 (endosomas tempranos) – 5,0 ( lisosomas)]. Por último, una mezcla de contenido catiónico e hidrófobo dentro del núcleo del si-NPs proporciona fuerzas de estabilización tanto electrostáticas como de van der Waals, mejorando la estabilidad del si-NPs en sangre en comparación con los sistemas meramente catiónicos.
La integración de muchas funciones en un diseño relativamente simple es posible utilizando la polimerización reversible de transferencia de la cadena de fragmentación (RAFT) para producir polímeros con una arquitectura compleja y una composición precisa. Para producir si-NPs con carga superficial neutral, respuesta de pH, y estabilidad NP, balsa se utiliza para sintetizar poli (etilenglicol-b-[2-(dimetilamino) etil metacrilato-Co-butilo de metacrilato]) (PEG-dB; Figura 1A). PEG-DB es completamenteado electrostaticamente con siRNA, formando si-NPs con una corona de PEG y núcleo de DB/siRNA (figura 1B). El PEG forma una capa hidrófila inerte de carga neutra en la corona si-NP. El bloque DB se compone de una relación 50:50 molar de 2-(dimetilamino) etil metacrilato (DMAEMA) y metacrilato de butilo (BMA). Cationic DMAEMA electrostaticamente complejos con carga negativa siRNA. Los autoasociados de BMA dentro del núcleo NP por las interacciones de van der Waals, aumentando la estabilidad NP. Juntos, DMAEMA y BMA imparten un comportamiento lipídico bicapa-lítico dependiente del pH al bloque de polímero DB. En el pH extracelular, el bloque DB está secuestrado en el núcleo si-NP y es inerte a las bicapas lipídicas. En condiciones ácidas, como las que están dentro de la vía endolisosomal, el DMAEMA ionizables dentro del bloque DB facilita el efecto de la esponja de protones, donde el tampón endosómico conduce a la hinchazón osmótica y la ruptura26. Adicionalmente, las mitades hidrófobas del BMA dentro del bloque DB se integran activamente en las bicapas lipídicas y Lyse, resultando en una potente endosomolisis. Por lo tanto, siRNA es complejado con PEG-dB para formar si-NPS que son neutralmente cargados y altamente estables a pH extracelular pero que interrumpen bicapas lipídicas a pH ácido, asegurando la entrega citosólica de la carga útil siRNA.
Aquí se describen los procedimientos experimentales para producir si-NPs de PEG-DB. Se presentan y discuten los métodos para caracterizar los parámetros fisicoquímicos y la bioactividad del si-NPs. Con el fin de evaluar rápidamente la bioactividad de si-NP, luciferasa se utiliza como un gen modelo para los estudios de Knock-down. Luciferasa luciérnaga es la proteína responsable del “resplandor” de las luciérnagas27. En consecuencia, las células de mamíferos transfectadas con el gen luciferasa Firefly producen un «resplandor» bioluminiscente que puede capturarse utilizando un luminómetro para cuantificar los niveles de expresión de luciferasa. Aquí, utilizamos luciferase para evaluar la bioactividad del si-NPs entregando siRNA contra luciferasa y cuantificando la correspondiente reducción en la bioluminiscencia en las células que expresan luciferasa en comparación con las células que reciben un siRNA revueltos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los si-NPs descritos aquí están formados por la Asociación electrostática de siRNA aniónica y polímeros catiónicos en complejos poliónicos (poliplexos). El complejado electrostático de siRNA y el bloque catiónico DB de los polímeros PEG-DB se facilitan mezclando a bajo pH (4,0). A pH 4,0, DMAEMA está altamente protonated, y consecuentemente el bloque DB está altamente cargado. Esto asegura que los polímeros se disuelvan como unimers en solución en lugar de formar micelas y que los complejos DB eficientemen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores están agradecidos a los doctores Craig Duvall y Rebecca Cook por el acceso a los datos y recursos de laboratorio para llevar a cabo esta investigación. Los autores están agradecidos al Instituto Vanderbilt de Ciencia e ingeniería de Nanoscale (VINSE) para el acceso a los instrumentos DLS y TEM (NSF EPS 1004083). Los autores están agradecidos a la Fundación Nacional de Ciencias por apoyar el programa de becas de posgrado (NSF # 1445197). Los autores están agradecidos a los institutos nacionales de salud para el apoyo financiero (NIH r01 EB019409). Los autores están agradecidos al programa de investigación médica dirigida por el Congreso del Departamento de defensa para apoyo financiero (DOD CDMRP OR130302).
Materials
| 0.45 mm pore-size syringe filters | Thermo Fisher Scientific | F25133 | 17 mm diameter, PTFE membrane |
| 0-14 pH test strips | Millipore Sigma | P4786 | |
| 10x TAE buffer | Thermo Fisher Scientific/Invitrogen | AM9869 | |
| 6-7.7 pH test strips | Millipore Sigma | P3536 | |
| 96-well black walled plates | Corning | 3603 | Tissue-culture treated |
| Agarose Powder | Thermo Fisher Scientific/Invitrogen | 16500 | |
| Citric acid monohydrate | Millipore Sigma | C1909 | |
| dibasic sodium phosphate dihydrate | Millipore Sigma | 71643 | |
| D-luciferin | Thermo Fisher Scientific | 88294 | Monopotassium Salt |
| DMEM | Gibco | 11995065 | High glucose and pyruvate |
| Ethanol | Millipore Sigma | 459836 | |
| ethidium bromide | Thermo Fisher Scientific/Invitrogen | 15585011 | |
| FBS | Gibco | 26140079 | |
| loading dye | Thermo Fisher Scientific/Invitrogen | R0611 | |
| Luciferase siRNA | IDT | N/A | Antisense Strand Sequense: GAGGAGUUCAUUAUCAGUGCAAUUGUU Sense Strand Sequense: CAAUUGCACUGAUAAUGAACUCCT*C* *DNA bases |
| MDA-MB-231 / Luciferase (Bsd) stable cells | GenTarget Inc | SC059-Bsd | Luciferase-expressing cells sued to assess si-NP bioactivity |
| monobasic sodium phosphate monohydrate | Millipore Sigma | S9638 | |
| Scarmbled siRNA | IDT | N/A | Antisense Strand Sequense: AUACGCGUAUUAUACGCGAUUAACGAC Sense Strand Sequense: CGUUAAUCGCGUAUAAUACGCGUA*T* *DNA bases |
| square polystyrene cuvettes | Fisher Scientific | 14-955-129 | 4.5 mL capacity |
| TEM grids | Ted Pella, Inc. | 1GC50 | PELCO Center-Marked Grids, 50 mesh, 3.0mm O.D., Copper |
| Trisodium citrate dihydrate | Millipore Sigma | S1804 | |
| uranyl acetate | Polysciences, Inc. | 21447-25 |
References
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
- Elbashir, S. M., et al. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature. 411 (6836), 494-498 (2001).
- Soutschek, J., et al. Therapeutic silencing of an endogenous gene by systemic administration of modified siRNAs. Nature. 432 (7014), 173-178 (2004).
- Hannon, G. J. RNA interference. Nature. 418, 244 (2002).
- Dykxhoorn, D. M., Palliser, D., Lieberman, J. The silent treatment: siRNAs as small molecule drugs. Gene Therapy. 13 (6), 541-552 (2006).
- Wittrup, A., Lieberman, J. Knocking down disease: a progress report on siRNA therapeutics. Nature Reviews Genetics. 16 (9), 543 (2015).
- Li, H. E., Nelson, C. C., Evans, B., Duvall, C. Delivery of Intracellular-Acting Biologics in Pro-Apoptotic Therapies. Current Pharmaceutical Design. 17 (3), 293-319 (2011).
- Bartlett, D. W., Davis, M. E. Effect of siRNA nuclease stability on the in vitro and in vivo kinetics of siRNA-mediated gene silencing. Biotechnology and Bioengineering. 97 (4), 909-921 (2007).
- Zuckerman, J. E., Choi, C. H., Han, H., Davis, M. E. Polycation-siRNA nanoparticles can disassemble at the kidney glomerular basement membrane. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 109 (8), 3137-3142 (2012).
- Dominska, M., Dykxhoorn, D. M. Breaking down the barriers: siRNA delivery and endosome escape. Journal of Cell Science. 123 (Pt 8), 1183-1189 (2010).
- Gilleron, J., et al. Image-based analysis of lipid nanoparticle–mediated siRNA delivery, intracellular trafficking and endosomal escape. Nature Biotechnology. 31 (7), 638 (2013).
- Sahay, G., et al. Efficiency of siRNA delivery by lipid nanoparticles is limited by endocytic recycling. Nature Biotechnology. 31 (7), 653-658 (2013).
- Wittrup, A., et al. Visualizing lipid-formulated siRNA release from endosomes and target gene knockdown. Nature Biotechnology. 33 (8), 870-876 (2015).
- Kanasty, R., Dorkin, J. R., Vegas, A., Anderson, D. Delivery materials for siRNA therapeutics. Nature Materials. 12 (11), 967-977 (2013).
- Adams, D., et al. Patisiran, an RNAi Therapeutic, for Hereditary Transthyretin Amyloidosis. New England Journal of Medicine. 379 (1), 11-21 (2018).
- Dang, C. V., Reddy, E. P., Shokat, K. M., Soucek, L. Drugging the ‘undruggable’ cancer targets. Nature Reviews Cancer. 17 (8), 502 (2017).
- Alexis, F., Pridgen, E., Molnar, L. K., Farokhzad, O. C. Factors affecting the clearance and biodistribution of polymeric nanoparticles. Molecular Pharmaceutics. 5 (4), 505-515 (2008).
- Verbaan, F. J., et al. The fate of poly(2-dimethyl amino ethyl)methacrylate-based polyplexes after intravenous administration. International Journal of Pharmaceutics. 214 (1-2), 99-101 (2001).
- Lv, H., Zhang, S., Wang, B., Cui, S., Yan, J. Toxicity of cationic lipids and cationic polymers in gene delivery. Journal of Controlled Release. 114 (1), 100-109 (2006).
- Shi, J., Kantoff, P. W., Wooster, R., Farokhzad, O. C. Cancer nanomedicine: progress, challenges and opportunities. Nature Reviews Cancer. 17 (1), 20 (2016).
- Torchilin, V. Tumor delivery of macromolecular drugs based on the EPR effect. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (3), 131-135 (2011).
- Duncan, R. The dawning era of polymer therapeutics. Nature Reviews Drug Discovery. 2 (5), 347 (2003).
- Tang, L., et al. Investigating the optimal size of anticancer nanomedicine. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 111 (43), 15344-15349 (2014).
- Nelson, C. E., et al. Balancing Cationic and Hydrophobic Content of PEGylated siRNA Polyplexes Enhances Endosome Escape, Stability, Blood Circulation Time, and Bioactivity in vivo. ACS Nano. 7 (10), 8870-8880 (2013).
- Jackson, M. A., et al. Zwitterionic Nanocarrier Surface Chemistry Improves siRNA Tumor Delivery and Silencing Activity Relative to Polyethylene Glycol. ACS Nano. , (2017).
- Akinc, A., Thomas, M., Klibanov, A. M., Langer, R. Exploring polyethylenimine-mediated DNA transfection and the proton sponge hypothesis. The Journal of Gene Medicine. 7 (5), 657-663 (2005).
- de Wet, J. R., Wood, K. V., DeLuca, M., Helinski, D. R., Subramani, S. Firefly luciferase gene: structure and expression in mammalian cells. Molecular and Cellular Biology. 7 (2), 725-737 (1987).
- Aggarwal, P., Hall, J. B., McLeland, C. B., Dobrovolskaia, M. A., McNeil, S. E. Nanoparticle interaction with plasma proteins as it relates to particle biodistribution, biocompatibility and therapeutic efficacy. Advanced Drug Delivery Reviews. 61 (6), 428-437 (2009).
- Geng, Y., et al. Shape effects of filaments versus spherical particles in flow and drug delivery. Nature Nanotechnology. 2 (4), 249 (2007).
- Chauhan, V. P., et al. Fluorescent nanorods and nanospheres for real-time in vivo probing of nanoparticle shape-dependent tumor penetration. Angewandte Chemie International Edition. 50 (48), 11417-11420 (2011).
- Chu, K. S., et al. Plasma, tumor and tissue pharmacokinetics of Docetaxel delivered via nanoparticles of different sizes and shapes in mice bearing SKOV-3 human ovarian carcinoma xenograft. Nanomedicine. 9 (5), 686-693 (2013).
- Werfel, T. A., et al. Selective mTORC2 Inhibitor Therapeutically Blocks Breast Cancer Cell Growth and Survival. Cancer Research. 78 (7), 1845-1858 (2018).
- Sarett, S. M., et al. Lipophilic siRNA targets albumin in situ and promotes bioavailability, tumor penetration, and carrier-free gene silencing. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114 (32), E6490-E6497 (2017).
- Williams, M. M., et al. Intrinsic apoptotic pathway activation increases response to anti-estrogens in luminal breast cancers. Cell Death and Disease. 9 (2), 21 (2018).
- Evans, B. C., et al. Ex Vivo Red Blood Cell Hemolysis Assay for the Evaluation of pH-responsive Endosomolytic Agents for Cytosolic Delivery of Biomacromolecular Drugs. Journal of Visualized Experiments. (73), e50166 (2013).
- Werfel, T., et al. Combinatorial Optimization of PEG Architecture and Hydrophobic Content Improves siRNA Polyplex Stability, Pharmacokinetics, and Potency In vivo. Journal of Controlled Release. , (2017).
- Kilchrist, K. V., Evans, B. C., Brophy, C. M., Duvall, C. L. Mechanism of Enhanced Cellular Uptake and Cytosolic Retention of MK2 Inhibitory Peptide Nano-polyplexes. Cellular and Molecular Bioengineering. 9 (3), 368-381 (2016).
- Kilchrist, K. V., et al. Gal8 Visualization of Endosome Disruption Predicts Carrier-Mediated Biologic Drug Intracellular Bioavailability. ACS Nano. , (2019).
