Summary
यहाँ, हम की पूरी तरह से स्वचालित रेडियो लेबलिंग के लिए एक प्रोटोकॉल का प्रतिनिधित्व करते हैं [11C]SNAP-7941 और पी-जी पी पर इस पीईटी-ट्रेसर की वास्तविक समय गतिजता का विश्लेषण व्यक्त करने और गैर-एक्सप्रैक्टेड कोशिकाओं.
Abstract
Positron उत्सर्जन टोमोग्राफी (पीईटी) एक आवश्यक आणविक इमेजिंग तकनीक रास्ते में अंतर्दृष्टि प्रदान करने और विवो जांच में के लिए विशिष्ट लक्षित radioligands का उपयोग कर रहा है. इस प्रोटोकॉल के भीतर, एक मजबूत और विश्वसनीय रिमोट-नियंत्रित रेडियोसिंथेसिस [11C]SNAP-7941, मेलेनिन-संकेंद्रित हार्मोन रिसेप्टर 1 के लिए एक विरोधी, वर्णित है. रेडियोसिंथेसिस cyclotron का उत्पादन के साथ शुरू होता है [11C]CO2 जो बाद में आगे एक गैस चरण संक्रमण के माध्यम से प्रतिक्रिया व्यक्त की है [11C]CH3OTf. उसके बाद, इस प्रतिक्रियाशील मध्यवर्ती अग्रदूत समाधान करने के लिए पेश किया है और संबंधित radiotracer रूपों. रासायनिक के रूप में के रूप में अच्छी तरह से रेडियोकेमिकल शुद्धता आरपी-HPLC के माध्यम से निर्धारित कर रहे हैं, नियमित रूप से radiopharmaceutical गुणवत्ता नियंत्रण प्रक्रिया में लागू किया. इसके अतिरिक्त, मोलर गतिविधि की गणना की जाती है क्योंकि यह निम्नलिखित वास्तविक समय गतिज जांच के लिए एक आवश्यकता है। इसके अलावा, सेल संचय पर पी ग्लाइकोप्रोटीन (पी-जीपी) अभिव्यक्ति के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए एमडीसीकेआई-डब्ल्यूटी और एमडीसीकेआई-एचएमडीआर1 कोशिकाओं पर11सीजेडस्नैप-7941 लागू किया जाता है। इस कारण से, पी-जीपी व्यक्त सेल लाइन (MDCKII-hMDR1) या तो बिना या पी-जीपी सब्सट्रेट के माध्यम से प्रयोगों से पहले अवरुद्ध के साथ प्रयोग किया जाता है ($)-verapamil और परिणाम wildtype कोशिकाओं के लिए मनाया लोगों की तुलना में कर रहे हैं। समग्र प्रयोगात्मक दृष्टिकोण एक सटीक समय प्रबंधन के महत्व को दर्शाता है कि हर preclinical और नैदानिक अध्ययन के लिए आवश्यक है पीईटी अनुरेखकों का उपयोग कर इस तरह के कार्बन-11 के रूप में nuclides, (आधा जीवन: 20 मिनट).
Introduction
[11सी] SNAP-7941 पहले positron उत्सर्जन टोमोग्राफी के रूप में विकसित किया गया था (पीईटी)-मेलेनिन केंद्रित हार्मोन रिसेप्टर 1 (MCHR1) को लक्षित - एक रिसेप्टर मुख्य रूप से भूख और भोजन का सेवन1के केंद्रीय विनियमन में शामिल . कार्बन-11 SNAP-7941 की लेबलिंग, एक अच्छी तरह से विशेषता MCHR1विरोधी, प्रामाणिक पीईटी-ट्रेकर 2,3,4,5मिले. हालांकि, पूरी तरह से स्वचालित रेडियोसिंथेसिस समय प्रभावकारिता और अल्पकालिक रेडियोन्यूक्लाइड कार्बन-11 के साथ reproducibility के मामले में अत्यधिक चुनौतीपूर्ण है 20 मिनट6के एक आधा जीवन की पेशकश की. समग्र संश्लेषण समय एक न्यूनतम करने के लिए रखा जाना चाहिए, और अंगूठे के एक नियम के रूप में 2-3 आधा जीवन से अधिक नहीं होना चाहिए (यानी, कार्बन-11 के लिए लगभग 40-60 मिनट)7. विशेष रूप से, कम अभिव्यक्ति घनत्व के साथ रिसेप्टर प्रणालियों को लक्षित करने वाले रेडियोट्रेसर्स के लिए संश्लेषण प्रक्रियाओं को पर्याप्त पैदावार प्राप्त करने के लिए बड़े पैमाने पर अनुकूलित किया जाना चाहिए और इसके परिणामस्वरूप उच्च मोलर गतिविधि8। सिंथेटिक रणनीति अक्सर एक cyclotron के भीतर radionuclide उत्पादन इस प्रकार है और की रिहाई [11C$CO2 सिंथेसाइज़र के लिए. वहाँ, [11C]CO2 पहले [11C]CH4 करने के लिए कम है और बाद में आयडीन के साथ प्रतिक्रिया की उपज के लिए [11C]CH3मैं गैस चरण विधि 9 के माध्यम से 9,10. चांदी triflate पैदावार के साथ आगे उपचार [11C]CH3OTf सीधे ऑन लाइन. बाद में, इस प्रतिक्रियाशील कार्बन-11 लेबल मध्यवर्ती पूर्ववर्ती अणु युक्त एक समाधान में पेश किया है. एक स्वचालित रेडियो संश्लेषण के अतिरिक्त पूर्व नैदानिक और नैदानिक अध्ययन के लिए उपयुक्त उत्पाद के बाद के निर्माण सहित अर्द्ध-पूर्वात्मक आरपी-HPLC के साथ एक शुद्धि प्रक्रिया शामिल है।
रेडियोन्यूक्लाइड के आधे जीवन और रेडियोसिंथेसिस के समय के प्रयास के बावजूद, रेडियोफार्मेस्यूटिक के फार्माकोकाइनेटिक पीईटी-ट्रेसर विकास के दौरान मूल्यांकन किया जाना सबसे महत्वपूर्ण हिस्सा है। न्यूरोइमेजिंग के संदर्भ में, पीईटी-ट्रेसर के मस्तिष्क प्रविष्टि मुख्य शर्त है। हालांकि, रक्त मस्तिष्क बाधा (BBB), मस्तिष्क की एक "सुरक्षा सीमा", अत्यधिक efflux ट्रांसपोर्टरों कि छोटे अणुओं अनलोड कर सकते हैं व्यक्त करता है (उदा., पीईटी-ट्रेसर) और कुशलता से उनकी प्रयोज्यता में बाधा.
पूर्व नैदानिक मूल्यांकन के दौरान एक बड़ी कमी इन efflux ट्रांसपोर्टरों, जो अक्सर इन विट्रो प्रयोगों में अपरिचित हैं और विवो में पीईटी-ट्रेसर की विफलता के लिए अग्रणी की ओर अप्रत्याशित बातचीत कर रहे हैं, के रूप में के लिए मनाया $11C$SNAP-7941. चूहों में पीईटी इमेजिंग कम मस्तिष्क संचय का प्रदर्शन किया, जो नाटकीय रूप से पी-जीपी अवरोधक टैरिकिदार11के प्रशासन के बाद वृद्धि हुई। इन आंकड़ों से पता चलता है कि $11सीजेडस्नैप-7941 इस efflux ट्रांसपोर्टर प्रणाली का एक सब्सट्रेट है जो केंद्रीय MCHR1 के लिए बंधन ligand impeding है। दुर्भाग्य से, वहाँ अभी भी जांचक विकास के एक प्रारंभिक चरण में BBB प्रवेश की भविष्यवाणी को सक्षम करने के इन विट्रो मॉडल में पर्याप्त की कमी है.
यहाँ, हम कार्बन-11 मिथाइलेशन के लिए एक सिंथेसाइज़र का उपयोग करके [11C]SNAP-7941 के स्वचालित संश्लेषण का वर्णन करते हैं। इस काम का जोर कैसे स्वचालित संश्लेषण सहित एक लगातार प्रयोगात्मक दृष्टिकोण को व्यवस्थित करने के लिए पर एक सिंहावलोकन देने के लिए है, गुणवत्ता नियंत्रण के रूप में के रूप में अच्छी तरह से लगातार इन विट्रो मूल्यांकन में बहुत कम रहते nuclide कार्बन-11 के साथ.
सबसे पहले, कम से कम समय व्यय और अधिकतम उपज के साथ एक सफल रेडियो संश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण कदम का वर्णन कर रहे हैं. फिर, एक विश्वसनीय गुणवत्ता नियंत्रण प्रक्रिया की स्थापना की है रेडियोट्रैकर संभावित नैदानिक अध्ययन के लिए उपलब्ध बनाने और यूरोपीय फार्माकोपोइया12के मानदंडों को पूरा. मोलर सांद्रता का परिमाणीकरण और संबंधित मोलर क्रियाकलाप की गणना क्रमिक गतिज मापन के लिए एक अनिवार्य आवश्यकता है।
अंत में, इनविट्रो विधि का मूल्यांकन करने में एक नया और सीधा[11C]SNAP-7941 efflux ट्रांसपोर्टर, पी-जीपी (hMDR1) की ओर बातचीत प्रस्तुत की है। प्रस्तावित गतिज मॉडल एक आसान करने के लिए संभाल डिवाइस है कि एक तत्काल डेटा व्याख्या की अनुमति देता है और कम से कम सेल संस्कृति प्रयास13की आवश्यकता का उपयोग करता है.
Protocol
चेतावनी: निम्न प्रोटोकॉल में हैंडलिंग और रेडियोधर्मिता के हेरफेर की आवश्यकता होती है शामिल एक से अधिक चरण हैं। यह महत्वपूर्ण है कि हर कदम संस्थान के विकिरण सुरक्षा विभाग और संबंधित राष्ट्रीय विधायिका के साथ समझौते में है. ALARA ("के रूप में कम के रूप में उचित प्राप्य") सिद्धांत का पालन शामिल ऑपरेटरों के लिए ionizing विकिरण के लिए जोखिम को कम करने के लिए अनिवार्य है।
1. समय प्रबंधन और प्रयोग की योजना बना
नोट: कार्बन-11 के छोटे आधे जीवन रेडियोधर्मिता की हानि को कम करने के लिए एक सटीक समय प्रबंधन की आवश्यकता है (चित्र 1)। यह महत्वपूर्ण है कि इसमें शामिल कोई भी व्यक्ति अपने जिम्मेदारी के क्षेत्र और संबंधित कार्रवाई के समय बिंदु को जानता है। [11C]SNAP-7941 के वास्तविक समय गतिज प्रयोग की स्थापना के लिए, एक चिकनी प्रक्रिया के लिए लगभग चार व्यक्तियों के लिए आवश्यक हैं।
- के लिए एक निर्माता व्यवस्थित करें[11C]SNAP-7941.
- विनिर्देश मूल्यांकन, बड़े पैमाने पर एकाग्रता की गणना और संश्लेषण शुरू समय के मोलर गतिविधि प्रदर्शन गुणवत्ता नियंत्रण ऑपरेटर को सूचित करें।
- रीयल-टाइम गतिज प्रयोगकर्ता को कमजोर पड़ने की गणना और प्रयोग करने के लिए तैयार रखें।
- संबंधित समय बिंदु पर संबंधित स्थान पर रेडियोधर्मिता स्थानांतरित करने के लिए धावक निर्देश.
2. पूर्व नैदानिक उपयोग के लिए $11सीजेडस्नैप-7941 का स्वचालित संश्लेषण
- सिंथेसाइज़र की तैयारी (चित्र 2)।
- सिंथेसाइज़र, आवश्यक तकनीकी गैसों (हीलियम और हाइड्रोजन) और सिंथेसाइज़र नियंत्रण सॉफ्टवेयर ट्रेसरलैबचालू करें। संबंधित संश्लेषण अनुक्रम तस्वीरका चयन करें।
- V1-V3 पानी के साथ एक बार धो और रिएक्टर और HPLC वाल्व के माध्यम से एसीटोन के साथ दो बार लोड पर या पाश अपशिष्ट बोतल में स्थिति सुई.
- V18 के माध्यम से सक्रिय एक सतत हीलम प्रवाह के साथ इंजेक्शन वाल्व के माध्यम से रिएक्टर में और बाहर सभी संबद्ध लाइनों सूखी.
- गर्मी [11C]CH3मैं जाल के रूप में के रूप में अच्छी तरह से [11C]CH3OTf जाल 100 एमएल -1 की एक हीलियम धारा के तहत V24, V25, V29, V25, V29, V15, V9, V17 और V32/V33 के माध्यम से अलग रिएक्टर के साथ 200 डिग्री सेल्सियस तक.
- लीकेज के लिए एक ही रास्ते की जाँच करें (संलग्न रिएक्टरके साथ) 100 एमएल -1 के एक हीलियम प्रवाह के साथ. जब प्रवाह 4 एमएल -1 से नीचेगिर जाता है तो जकड़न की गारंटी दी जाती है।
- एचपीएलसी पंप (5-10 एमएलजेडमिन-1) को चालू करें और एचपीएलसी लाइनों और इंजेक्शन वाल्व को एसीटोनिट्रिल/पानी (50/50, वी/वी) के साथ-साथ एचपीएलसी लाइनों को वी 14 के माध्यम से बल्ब में धो लें।
- V11 और V12 के माध्यम से बल्ब V19 के माध्यम से एक हीलियम धारा के साथ अपशिष्ट बोतल में खाली. V6 से पानी के साथ संबंधित लाइनों को V11 और V12 के माध्यम से V18 के माध्यम से एक हीलियम धारा के साथ फिर से धो लें।
- उत्पाद संग्रह शीशी (PCV) V18 के माध्यम से एक हीलियम धारा का उपयोग कर में V11 और V12 के माध्यम से पानी के साथ इथेनॉल और V4 के साथ V5 धो लें, तो V13 के माध्यम से V13 के माध्यम से V20 के माध्यम से एक हीलियम धारा के साथ अपशिष्ट बोतल में पीसीवी खाली.
- HPLC पंप बंद करें, संश्लेषण के लिए विलायक के लिए स्विच (एक्वेस अमोनियम एसीटेट (2.5 ग्राम] L-1)/ऐसीटिक एसिड 97.5/2.5 v/v; pH 3.5)/acetonitrile 75/25 v/v), अर्द्ध-पूर्वार्धHPLC कॉलम संलग्न करें और स्तंभ को बराबर कर दें (5 एमएल $min-1का प्रवाह )।
- संश्लेषण और शुद्धि के लिए अभिकर्मकों में भरें: 1.5 एमएल पानी (V2), 0.9% NaCl के 4.5 एमएल (V4), 96% इथेनॉल के 0.5 एमएल (V5), पानी के 10 एमएल (V6), और पानी के 90 एमएल (bulb).
- एक नया पाश अपशिष्ट शीशी संलग्न; एक उत्पाद शीशी (लेबल और एक वातन सुई के साथ सुसज्जित) V13 और तरल नाइट्रोजन के लिए.
- पूर्व शर्त एक एसपीई (ठोस चरण निष्कर्षण) 96% इथेनॉल और पानी के 20 एमएल के 10 एमएल के साथ कारतूस और यह V11 और V12 के बीच देते हैं.
- संश्लेषण शुरू करने से पहले 20 मिनट पूर्व रन अनुक्रम शुरू करें, जिसमें $11C$CO2 ट्रैप को 400 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करना और वी 27 (2 मिनट) केमाध्यम से 50 एमएल-मिन-1की हीलियम धारा के साथ जाल को फ्लश करना शामिल है। इसके बाद, हाइड्रोजनगैस (120 एमएल$मिन-1) के साथ 3 मिनट के लिए 11 ब्ब्सीओ2 ट्रैप को पूर्व-प्रवाह ित करके 40 डिग्री सेल्सियस से नीचे ठंडा कर दिया।
- एसीटोनिट्रिल (डीएनए संश्लेषण के लिए, और 10 एच2ओ के लिए) के 400 डिग्री एल में अग्रदूत की 1 मिलीग्राम भंग, प्रतिक्रिया के लिए समाधान को स्थानांतरित करें और टीबाह के 5.5 डिग्री एल (264 मिलीग्राम-एमएल-1 मेथनॉल में) जोड़ें। रिएक्टर को अपनी स्थिति से जोड़ दें।
- हॉट सेल को बंद करें और गर्म सेल के दबाव में चालू करें।
- -75 डिग्री सेल्सियस तरल नाइट्रोजन के साथ CH4 ट्रैप की शीतलन प्रक्रिया के प्रारंभ की पुष्टि करें।
- तापमान तक पहुँच जाता है जब रेडियोधर्मिता रिलीज.
- [11C]CO2 का Cyclotron उत्पादन
Note: चरण 2-2-2.4 रेडियोसंश्लेषण मॉड्यूल की तैयारी के लिए एक साथ आयोजित किए जाते हैं (चित्र 1देखें)।- साइक्लोट्रॉन का चुंबक चालू कीजिए।
- लक्ष्य 11सी-सीओ2 का चयन करें और बीम 65 डिग्री एशुरू करें।
- बटन को दबाने से विकिरण की शुरुआत की पुष्टि करें विकिरण प्रारंभ करें
- बीम बंद करो और बटन डिलिवरीधक्का द्वारा सिंथेसाइज़र में रेडियोधर्मिता की रिहाई की पुष्टि, रेडियोधर्मिता की वांछित राशि तक पहुँच जाता है के बाद (लगभग 120 जीबीक्यू 30 मिनट के बाद).
- पूरी तरह से स्वचालित रेडियो संश्लेषण का निष्पादन
- पुष्टि करें कि सिस्टम रेडियोधर्मिता प्राप्त करने और स्वचालित प्रक्रिया प्रारंभ करने के लिए तैयार है
- निम्नलिखित स्वचालित प्रक्रिया की निगरानी.
- जाँच करें कि क्या [11C]CO2 स्वचालित रूप से Cyclotron से संश्लेषण इकाई में V26 के माध्यम से स्थानांतरित कर दिया है (लगभग 4 मिनट) और कि [11C]CO2 आणविक छलनी पर फंस गया है एक उत्प्रेरक के रूप में निकल के साथ गर्भवती (] 11 कमरे के तापमान पर C$CO2 जाल)।
- ट्रैक अगर [11C]CO2 जाल स्वचालित रूप से हीलियम के साथ पहले निकाल दिया जाता है (50 एमएल $min-1) और फिर हाइड्रोजन गैस के साथ (120 एमएल $min-1) . फिर, यह प्रेक्षित कीजिए कि ट27 तथा ट25 बंद हो जाते हैं तथा हाइड्रोजन गैस सहित11ब्ब् ब्22 को 400 डिग्री सेल्सियस तक गर्म किया जाता है तथा यह कि 11 ब्]च4 को पूर्व-कूलित [11ब्]ब् 4 में ले जाया जाता है। जाल और वहाँ फंस गया.
- मॉनिटर कि V10 बंद कर दिया है, V9 खोला (आयोडीन स्तंभ की ओर) और [11C]CH4 फिर से गर्म द्वारा जारी है [11C]CH4 जाल धीरे से 80 डिग्री सेल्सियस के लिए और एक हीलियम धारा के साथ परिसंचरण इकाई में ले जाया के माध्यम से V10 (बाहर निकलें). और आगे की जाँच करें कि क्या [11C]CH4 परिसंचरण इकाई के भीतर 11 C$CH3I में परिवर्तित हो जाता है, जो लगभग 3 मिनट तक रहता है और गठन [11C]CH3मैं लगातार [11 C] पर फंस जाता है CH3मैं जाल.
- सुनिश्चित करें कि निकास वाल्व V16 खोला जाता है और V24 के माध्यम से [11C]CH3मैं जाल हीलियम (20 एमएल $min-1) की एक धारा के साथ 90 डिग्री सेल्सियस के लिए गर्म किया जाता है। इसके द्वारा, संभव byproducts हटा रहे हैं और फिर V16 बंद कर दिया है.
- पुष्टि करें कि [11C]CH3मैं रिएक्टर में जारी करने के लिए तैयार है.
- निम्नलिखित स्वचालित प्रक्रिया की निगरानी करें: जाँच करें कि क्या [11C]CH3मैं जाल को 190 डिग्री सेल्सियस तक गर्म किया जाता है और गठित [11C]CH3मैं के माध्यम से रिएक्टर में जारी किया जाता है [11C]CH3OTf जाल (V32 और V33, अभी भी 200 डिग्री पर सी), V7, और V8 एक सतत हीलियम धारा के तहत (10-25 एमएल $min-1, V24). इस प्रक्रिया के दौरान, V21 और V23 (exhaust निकास) खुला होना है।
- पुष्टि करें कि रेडियोधर्मिता रिएक्टर में पहुंचे, एक बार रिएक्टर में रेडियोधर्मिता की राशि अब और नहीं उठा रहा है.
- निम्नलिखित स्वचालित प्रक्रिया की निगरानी और मैनुअल हस्तक्षेप के लिए तैयारी, यदि आवश्यक हो तो
- जाँच करें कि क्या ट23, ट21 तथा ट8 स्वचालित रूप से बंद हो जाते हैं और अभिक्रिया मिश्रण को 75 डिग्री सेल्सियस तक गर्म किया जाता है। 3 मिनट के बाद, यदि रिएक्टर तरल नाइट्रोजन के साथ ठंडा किया जाता है जब तक तापमान 35 डिग्री सेल्सियस से नीचे है निरीक्षण करें। बाद में, सुनिश्चित करें कि अभिक्रिया मिश्रण को ट2 के माध्यम से 1.5 एमएल जल से बुझाया जाता है। इस प्रक्रिया के दौरान, V21 और V23 (exhaust निकास) खुला होना है।
- ट्रैक अगर V21 और V23 बंद कर रहे हैं और प्रतिक्रिया मिश्रण HPLC पाश (5 एमएल) में एक तरल पदार्थ डिटेक्टर के माध्यम से गुजर द्वारा HPLC इंजेक्शन वाल्व को स्थानांतरित कर दिया है. ट्रैक अगर प्रतिक्रिया मिश्रण स्वचालित रूप से HPLC स्तंभ पर इंजेक्शन है.
- क्रोमैटोग्राम का निरीक्षण करें और बटन पीक स्टार्ट के माध्यम से उत्पाद पीक को मैन्युअल रूप से काटें। प्रेस पीक अंत जब उत्पाद शिखर संकेत लगभग 400 सीपीएस से नीचे गिर जाता है लगभग 8-10 मिनट के एक प्रतिधारण समय के बाद (प्रवाह: 5 एमएल $min-1, चित्रा 3) .
- बल्ब खाली करने में तेजी लाने के लिए एक अतिरिक्त हीलियम धारा चालू करें।
- मॉनिटर कि क्या बल्ब खाली है और अपशिष्ट बोतल का निरीक्षण: अगर बल्ब V11 के माध्यम से खाली कर दिया जाता है की जाँच करें, एसपीई कारतूस और V12 V19 और एक अतिरिक्त हीलियम लाइन के माध्यम से एक हीलियम धारा के साथ कचरे में और अगर उत्पाद एसपीई कारतूस पर बरकरार रखती है.
- पुष्टि करें कि बल्ब पूरी तरह से खाली है.
- SPE शुद्धि और उत्पाद हस्तांतरण की स्वचालित प्रक्रिया की निगरानी
- जांच करें कि एसपीई कारतूस V6, V11, और V12 के माध्यम से पानी के 10 एमएल के साथ अपशिष्ट में धोया जाता है और अगर इथेनॉल V5, V11, और V12 के माध्यम से PCV में उत्पाद elutes. अंत में, निरीक्षण अगर 0.9% NaCl उत्पाद को पतला करने के लिए V4, V11 और V12 के माध्यम से PCV में जोड़ा जाता है।
- सुनिश्चित करें कि उत्पाद समाधान V13 और V20 के माध्यम से एक हीलियम धारा के साथ अंतिम उत्पाद शीशी में एक बाँझ फिल्टर के माध्यम से स्थानांतरित किया गया है.
- पुष्टि करें कि उत्पाद पूरी तरह से स्थानांतरित किया गया है।
3. गुणवत्ता नियंत्रण (क्यूसी)
नोट: radiopharmaceuticals की गुणवत्ता नियंत्रण निम्नलिखित मानकों को मापने भी शामिल है:
- रेडियोकेमिकल शुद्धता और मोलर गतिविधि (आरपी-एचपीसीएलसी)
- अवशिष्ट सॉल्वैंट्स (गैस क्रोमैटोग्राफी, जीसी)
- Osmolality (वाष्प दाब ऑसमोमीटर)
- पीएच (पीएच-मीटर)
- [ स्पेक्ट्रम/रेडियोन्यूक्लाइड शुद्धता (जेड-स्पेक्ट्रोमीटर)
- आधा जीवन / रेडियोन्यूक्लाइड शुद्धता (डोज कैलिब्रेटर)
सभी भौतिक रासायनिक पैरामीटर उत्पाद की रिहाई से पहले निर्धारित कर रहे हैं और मूल्यों को परिभाषित गुणवत्ता पैरामीटर रेंज में होना चाहिए.
- गुणवत्ता नियंत्रण उपकरण की तैयारी
- संश्लेषण के अंत से पहले 30 मिनट की तैयारी शुरू करें।
- एक नेतृत्व परिरक्षित कंटेनर में एक शंकु शीशी तैयार करें और एक संलग्न सुई के साथ एक परिरक्षित 1 एमएल सिरिंज।
- एचपीएलसी के लिए पानी में SNAP-7941 (10 g]mL-1) का संदर्भ मानक समाधान तैयार करें।
- पीएच मीटर, गैस क्रोमैटोग्राफ और इस्तेमाल की गई गैसों, ऑस्मोमीटर और एचपीएलसी के सभी घटकों को चालू करें।
- HPLC नियंत्रण सॉफ्टवेयर को चालू करें और समर्पित स्तंभ और संबंधित विधि का चयन करें के लिए [11C]SNAP-7941 (मोबाइल चरण: (पानी/ एसिटिक एसिड 97.5/ 2.5 v/v; 2.5 g.L-1 अमोनियम एसीटेट; पीएच 3.5) / -1) और दो माप (मानक और उत्पाद) के साथ एक नमूना सूची लिखें. स्तंभ की कंडीशनिंग के लिए विधि प्रारंभ करें.
- 10 मिनट कंडीशनिंग के बाद एक हैमिल्टन सिरिंज के साथ SNAP-7941 संदर्भ समाधान के 20 $L इंजेक्शन और विश्लेषण रन शुरू करते हैं।
- इंजेक्शन के बाद एसीटोनिट्रिल और पानी से हैमिल्टन सिरिंज को दो बार धोएं।
- GC नियंत्रण सॉफ़्टवेयर प्रारंभ करें और नमूना सूची लिखें।
- गुणवत्ता नियंत्रण प्रदर्शन
- संश्लेषण के अंत के बाद उत्पाद की पूर्ण रेडियोधर्मी उपज को मापने और गुणवत्ता नियंत्रण के लिए तैयार नेतृत्व-परिरक्षित सिरिंज के साथ एक प्रतिक्रिया शीशी में उत्पाद के 100 डिग्री सेल्सियस हस्तांतरण।
नोट: गुणवत्ता नियंत्रण से प्राप्त सभी डेटा को राष्ट्रीय नियमों के अनुसार प्रलेखित किया जाना चाहिए। - विश्लेषणात्मक HPLC: रेडियोकेमिकल शुद्धता और रासायनिक शुद्धता को मापने और तुरंत परिणामों के सेल संस्कृति प्रयोगों के लिए प्रभारी व्यक्ति को सूचित।
- क्यूसी-नमूना के 40 डिग्री एल ड्रा और HPLC के लिए सुई. इंजेक्शन वाल्व के हाथ को लोड से इंजेक्शन वाल्व को इंजेक्शन के लिए ले जाकर प्रारंभ करें (चित्र 3)।
नोट: रन के दौरान (8 मिनट), प्रोटोकॉल के अन्य माप के रूप में संभव के रूप में ज्यादा क्षय से बचने के लिए किया जा सकता है. - क्रोमैटोग्राम खोलें और रेडियोधर्मिता चैनल में सभी चोटियों को एकीकृत करें। संदर्भ मानक के अवधारण समय के साथ उत्पाद (5.0-7.0 मिनट) के अवधारण समय की तुलना करें. सभी एकीकृत चोटियों के प्रतिशत में वक्र के अंतर्गत क्षेत्र की तुलना करें। उत्पाद शिखर कुल एकीकृत क्षेत्रों (रेडियो चैनल) के 95% (रेडियोकेमिकल शुद्धता) से अधिक होना चाहिए।
- रासायनिक शुद्धता का निर्धारण करने के लिए यूवी चैनल में संकेत एकीकृत। मुख्य अशुद्धता आमतौर पर 2.8-3.5 मिनट पर अग्रदूत SNAP एसिड है. की एकाग्रता[natC]SNAP-7941 एकीकरण के बाद अंशांकन वक्र से गणना की जाती है. [mol]mL-1 में SNAP-7941 की सांद्रता की गणना करें और निम्नलिखित समीकरण के माध्यम से मोलर गतिविधि का निर्धारण करें:
- क्यूसी-नमूना के 40 डिग्री एल ड्रा और HPLC के लिए सुई. इंजेक्शन वाल्व के हाथ को लोड से इंजेक्शन वाल्व को इंजेक्शन के लिए ले जाकर प्रारंभ करें (चित्र 3)।
- गैस क्रोमैटोग्राफी के लिए, एक समर्पित ग्लास शीशी में गुणवत्ता नियंत्रण नमूने के 20 डिग्री सेल्सियस हस्तांतरण। इसे ऑटोप्रतिदर्शी में रखें और माप शुरू करें। माप समाप्त होने के बाद, क्रोमैटोग्राम खोलें और स्वचालित रूप से एकीकृत चोटियों की संख्या लिखें। नमूने में 410 पीपीएम एसीटोनिट्रिल और 10% इथेनॉल से अधिक नहीं होना चाहिए।
- Osmolality: समर्पित खोखले पर एक कागज नमूना डिस्क रखो और नमूना के 10 डिग्री सेल्सियस लागू होते हैं. ऑस्मोलिटी को मापने के लिए बंद करें बटन दबाएँ। 3 मिनट के बाद, डिवाइस osmolality है कि 190-500 mosm-kg -1की एक सीमा में होना चाहिए प्रदर्शित करता है.
- पीएच: इलेक्ट्रोड को पानी से धो लें। नमूने में इलेक्ट्रोड डाल कर पीएच उपाय. पीएच 5.0-8.5 की एक सीमा में होना चाहिए. माप के बाद इलेक्ट्रोड को फिर से धो लें और इलेक्ट्रोड को संदर्भ पीएच समाधान में रखें।
- जेड स्पेक्ट्रम: जेड-स्पेक्ट्रोमीटर में QC नमूना रखो, नियंत्रण सॉफ्टवेयर खोलने के लिए और माप शुरू करते हैं. माप बंद करो और नीचे मापा ऊर्जा है कि 511 केवी (रेंज 420-520 केवी) हो गया है लिखें. फ़ाइल मेनू खोलें और संबंधित बैच संख्या के साथ फ़ाइल को सुरक्षित करें। समर्पित सॉफ्टवेयर में बचाया स्पेक्ट्रम याद करते हैं और स्पेक्ट्रम प्रिंट.
- आधा जीवन: खुराक कैलिब्रेटर का उपयोग करके दो बार QC नमूने की गतिविधि को मापने. संबंधित समय लिखो और घातीय के आधे जीवन की गणना.
- संश्लेषण के अंत के बाद उत्पाद की पूर्ण रेडियोधर्मी उपज को मापने और गुणवत्ता नियंत्रण के लिए तैयार नेतृत्व-परिरक्षित सिरिंज के साथ एक प्रतिक्रिया शीशी में उत्पाद के 100 डिग्री सेल्सियस हस्तांतरण।
- निर्गमन
- के बाद सभी मापदंडों का परीक्षण किया गया है और परिणाम ऑस्ट्रिया के अधिकारियों के दिशा निर्देशों के अनुसार कर रहे हैं, radiotracer जारी. ऑपरेटर को डेटा की शुद्धता पर हस्ताक्षर करने होते हैं।
4. पी-जी पी ट्रांसपोर्टर के प्रति बातचीत का मूल्यांकन
- सेल संस्कृति
- workbench के laminar हवा प्रवाह (LAF) शुरू करने और काम करने के लिए शुरू करने से पहले कम से कम 15 मिनट बेंच साफ.
- एक स्वचालित पाइपिंग सहायता का उपयोग कर एक बाँझ volumetric pipette के साथ FCS (50 एमएल) के 10% और एंटीबायोटिक दवाओं (2.5 एमएल) के 0.5% के साथ एलएएफ में बाँझ शर्तों के तहत सेल संस्कृति माध्यम मिक्स।
- Thaw MDCKII-hMDR1 और MDCKII-WT कोशिकाओं और एक T75 या T175 सेल संस्कृति फ्लास्क में खेती 10-14 दिनों aseptic शर्तों (LAF) के तहत प्रयोगों के अग्रिम में.
- अगले दिन माध्यम बदलें सभी नहीं अनुलग्न और apoptotic कोशिकाओं को दूर करने के लिए.
- हर तीन दिनों के माध्यम को ताजा एक (T75 के लिए 12 एमएल और T175 सेल संस्कृति फ्लास्क के लिए 23 एमएल) के साथ बदलें।
- ताजा फ्लास्क के लिए प्रयोगों की समय अनुसूची के अनुसार कोशिकाओं को विभाजित या 80% के एक संगम पर सेल संस्कृति व्यंजन के लिए bilayer बढ़ ने बचने के लिए.
- प्रयोगों के लिए सेल तैयारी
- प्रयोगों और बीज से दो दिन पहले कोशिकाओं को सेल कल्चर डिश के एक तिर्यक् तल में 2 लाख प्रति 2 लाख प्रति 2 कोशिकाओं की सांद्रता में विभाजित करें (चित्र4)। कोशिकाओं की गणना करने और उपयुक्त विभाजन अनुपात की गणना करने के लिए स्वचालित कक्ष काउंटर डिवाइस या Neubuer गणना कक्ष का उपयोग करें.
- प्रयोगों से एक दिन पहले माध्यम निकालें, डीबीएस के 4 एमएल के साथ संस्कृति पकवान पर कोशिकाओं को धोने और सेल संस्कृति मध्यम के ताजा 5 एमएल जोड़ें। डिश को इनक्यूबेटर में क्षैतिज रूप से रखें।
- प्रयोगों से पहले कम से कम 0.5 h DPBS के साथ कोशिकाओं को धो लें और FBS मुक्त माध्यम के 2 एमएल के साथ बदलें। एक माइक्रोस्कोप के साथ संगम और कोशिका आकारिकी की जांच.
- तीन अलग अलग setups में प्रयोगों प्रदर्शन.
- 4.2.3 में वर्णित प्रयोगों के लिए पेट्री डिश का उपयोग करें।
- 10 $M (जेड)-verapamil हाइड्रोक्लोराइड के साथ प्रयोगों से पहले 0.5 एच के लिए कोशिकाओं का इलाज करें।
- DMSO में वेरापामिल स्टॉक समाधान (20.4 एम एम (जेड)-वेरापैमिल हाइड्रोक्लोराइड का 0.98 डिग्री सेल्सियस जोड़ें। अंतिम DMSO सामग्री उपचार के दौरान $0.05% है.
- वाहन नियंत्रण (DMSO) के साथ 0.5 एच के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें। दवा के उपचार के लिए इस्तेमाल के रूप में एक ही मात्रा का उपयोग करें।
- वास्तविक समय परख के प्रयोग (सभी तीन setups के लिए)
- डिवाइस को चालू करें, कंप्यूटर और सुनिश्चित करें कि वे सही रूप से कनेक्ट हैं, तब नियंत्रण सॉफ़्टवेयर खोलें।
- एक लक्ष्य विकल्प चुनें, टेम्पलेट अनलॉक करें और निम्न सेटिंग समायोजित करें:
पदों की संख्या: 2 (दो)
पता लगाने का समय (सेक): 3 (तीन)
पता लगाना विलंब समय (s): 2 (दो)
पहले चरण का नाम: आधार रेखा - डिवाइस के इच्छुक समर्थन में सेल संस्कृति पकवान डालें, सुनिश्चित करें कि सेल पोल नीचे की ओर है और सेल संस्कृति माध्यम के साथ कवर किया.
- प्रारंभ बटन के माध्यम से चलाएँ प्रारंभ करें. सिस्टम फ़ाइल सहेजने के लिए कह रहा है. कोई फ़ाइल नाम और सहेजने का पथ चुनें. नियंत्रण केंद्र चबूतरे और आधारभूत माप शुरू होता है (सेल संस्कृति पकवान समर्थन बारी बारी से शुरू होता है).
- अन्य विकल्पोंके अंतर्गत चयन करें:
समय स्केल: मिनट
न्यूक्लाइड सुधार: कार्बन-11 - ग्राफ (पृष्ठभूमि (लाल), लक्ष्य (नीले) और लक्ष्य शून्य पृष्ठभूमि (काला) में घटता के तहत सभी बक्से की जाँच करें।
- गुणवत्ता नियंत्रण पैरामीटर प्राप्त करें: मोलर गतिविधि [GBQ.]mol-1] और गतिविधि एकाग्रता [MBq.mL-1] संश्लेषण के अंत में.
- 2 उ.प्र. के परख आयतन में 15 नउ के लिए संबंधित अनुरेखक आयतन की गणना कीजिए।
- संबंधित मात्रा के लिए पिपेट तैयार करें और एक लीड परिरक्षण में $11सीजेडSNAP-7941 उत्पाद का एक एलिकोट।
- नियंत्रण केंद्र विंडो में चलाएँ क्लिक करें. प्रतीक्षा करें जब तक डिश रोटेशन बंद हो जाता है और शीर्षक के साथ साइड बार रोका और अगले चरण हो .
- रीयल-टाइम गतिज डिवाइस का ढक्कन खोलें। संस्कृति पकवान समर्थन 90 डिग्री बाईं ओर मुड़ें. अनुरेखक की परिकलित मात्रा जोड़ें और प्रारंभिक स्थिति में वापस बारी. उसके बाद, डिवाइस का लिड बंद करें। प्रयोग शुरू करने के लिए तुरंत जारी रखें बटन दबाएं.
- ठहराव का चयन करके 20 मिनट के बाद प्रयोग समाप्त करें और बाद में रन समाप्त (साइड बार में एंड रन दबाएँ).
- डेटा विश्लेषण और एक सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर का उपयोग कर प्रसंस्करण
- वास्तविक समय नियंत्रण सॉफ्टवेयर खोलें. आवश्यक गतिज को याद करने के लिए फ़ाइलें खोलें पर क्लिक करें. गतिकी नियंत्रण केंद्र विंडो में सचित्र है।
- गतिकी निर्यात वक्रोंपर सीधे राइट-क्लिक करके चुनें। अपरिष्कृत डेटा वाली पाठ फ़ाइल सहेजें. सांख्यिकी कार्यक्रम खोलें और रीयल-टाइम प्रयोगों की कच्ची डेटा फ़ाइल चिपकाएँ.
- रेडियोट्रैकर (पृष्ठभूमि माप को छोड़कर) के अतिरिक्त समय (x-अक्ष) के साथ प्रारंभ करें और अधिकतम सीपीएस (प्रति सेकंड गणना) के प्रतिशत सिग्नल को सामान्यीकृत करें.
- एक नया GraphPad Prism फ़ाइल के लिए सभी सामान्यीकृत डेटा लोड करें.
- माध्य मान और मानक विचलन की गणना करें.
- प्राप्त आंकड़ों को ग्राफ के रूप में चित्रित की जा रही है, जिसमें तीनों सेटअपों के अनुरेखक ों का विचलन (वृद्धि की दर) दर्शाए गए हैं।
Representative Results
की पूरी तरह सेस्वचालित विकिरण संश्लेषण 5.7 $ 2.5 जीबीक्यू (4.6 ] 2.0% ईओबी में, 14.9 ] 5.9% पर आधारित [11C]CH3OTf; n ] 10) तैयार उत्पाद की. समग्र संश्लेषण लगभग 40 मिनट तक चला, जहां 15 मिनट की तैयारी के लिए आवश्यक थे [11C]CH3OTf गैस चरण विधि के माध्यम से, एक और 5 मिनट अग्रदूत के रेडियोलेबलिंग के लिए आवश्यक थे, अर्द्ध तैयारी के 10 मिनट के बाद आरपी-HPLC शुद्धि और C18 कारतूस ठोस चरण निष्कर्षण और निर्माण के लिए 10 मिनट. फिर, एक छोटा सा एलिकोट (लगभग 100-200 $L) गुणवत्ता नियंत्रण के लिए जिम्मेदार व्यक्ति को दिया गया था, जबकि तैयार-से-उपयोग ट्रेसर युक्त मूल उत्पाद शीशी वास्तविक समय गतिज विश्लेषण के प्रयोगकर्ता को दिया गया था।
गुणवत्ता नियंत्रण संश्लेषण के अंत के बाद 10 मिनट के भीतर पूरा किया गया था। मोलर सक्रियता 72 की श्रेणी में थी - 41 जीबीक्यू/जेडओएल (द र् 10) और रेडियोकेमिकल शुद्धता हमेशा 95% थी। अन्य सभी मापदंडों (पीएच, असमता, अवशिष्ट सॉल्वैंट्स) रिलीज मानदंडों को पूरा किया। वास्तविक समय गतिज परख के लिए, तीन अलग प्रयोगात्मक setups चुना गया: (ए) इलाज और गैर इलाज (वाहन) MDCKII-WT कोशिकाओं, (बी) गैर इलाज या वाहन MDCKII-hMDR1 कोशिकाओं के साथ इलाज किया और (सी) पूर्व वास्तविक समय अवरुद्ध के साथ बाद सेल लाइन ट्रांसपोर्टर की गतिज परख (जेड)-वेरापामिल का उपयोग कर। लागू करने के लिए [11C$SNAP-7941 wildtype सेल लाइन MDCKII-WT (पी-जी पी गैर-एक्सप्रिंग) और MDCKII-hMDR1 (पी-जी एक्स्कारिंग) एक अलग गतिज व्यवहार से पता चलता है, के रूप में वहाँ एक तेजी से संचय है wildtype सेल लाइन, जबकि कोई संचय मनाया गया था MDCKII-hMDR1 कोशिकाओं के लिए. हालांकि, MDCKII-hMDR1 कोशिकाओं के साथ (जेड)-verapamil के साथ पी-जीपी efflux ट्रांसपोर्टर अवरुद्ध एक तुलनीय वास्तविक समय गतिज के रूप में पहले से ही wildtype सेल लाइन के लिए देखा के लिए नेतृत्व किया (चित्र 5).
चित्र 1: कार्य-प्रवाह का अवलोकन. रेडियोसिंथेसिस, गुणवत्ता नियंत्रण, और के वास्तविक समय गतिज माप के कार्य प्रवाह [11C]SNAP-7941. काले तीर रेडियोधर्मिता के परिवहन के तरीके को इंगित करते हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 2: स्वचालित सिंथेसाइज़र की रेडियोसिंथेटिक योजना। स्वचालित सिंथेसाइज़र के सर्किट स्विचिंग, के लिए परिसंचरण इकाई के साथशुरू [11C]CH3मैं / ठोस चरण निष्कर्षण; PCV - उत्पाद संग्रह शीशी). कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 3: की पूरी तरह से स्वचालित रेडियो सिंथेसिस के प्रतिनिधि क्रोमैटgrams [11C]SNAP-7841. अर्द्ध-पूर्वार्ध आरपी-एचपीसी क्रोमैटोग्राम शीर्ष पर सचित्र है और तल पर शुद्धि के बाद विश्लेषणात्मक एक। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 4: वास्तविक समय प्रयोगों के लिए सेल संस्कृति पकवान तैयारी. चरण 1 सेल प्रकार और उनकी वृद्धि दर के आधार पर 2.5 x 105 अप करने के लिए 1 x 106 के बोने भी शामिल है। बाद में, संस्कृति पकवान एक तिरछी विमान में रखा गया है (लगभग 30-45 डिग्री).। इसलिए, आपूर्ति धातु उपकरण या एक सेल संस्कृति पकवान के ढक्कन इनक्यूबेटर में इस्तेमाल किया जा सकता है पकवान के slanting स्थिति को स्थिर करने के लिए. दिन के बाद (24 ज) पकवान क्षैतिज समायोजित किया जाता है, और ताजा सेल संस्कृति मध्यम पूरी तरह से सेल सतह को कवर करने के लिए जोड़ा जाता है. प्रयोग के दिन, सेल व्यवहार्यता और संगम की जांच की जाती है। प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल के अनुसार, कोशिकाओं DPBS के साथ धोया जाता है, माध्यम सीरम मुक्त माध्यम (2 एमएल) द्वारा प्रतिस्थापित किया जाता है, और संस्कृति पकवान प्रयोगों के शुरू होने तक एक तिरछी स्थिति में repositioned है. इसके बाद, कोशिकाओं अवरोधक या वाहन के साथ इलाज किया जा सकता है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 5: वास्तविक समय गतिज माप के [11C]SNAP-7941. के प्रतिनिधि वास्तविक समय गतिज [11C]SNAP-7941 तीन अलग अलग सेट अप में दिखाए जाते हैं: MDCKII-WT कोशिकाओं का उपयोग कर; MDCKII-hMDR1 कोशिकाओं के साथ पूर्व अवरुद्ध (जेड)-verapamil के रूप में पी-जीपी अवरोधक और MDCKII-hMDR1 कोशिकाओं रुकावट के बिना। y-अक्ष अनुपचारित या वाहन द्वारा उपचारित MDCKII-MDR1 कक्षों के परिणामों की तुलना में पूर्व-अवरोधित MDCKII-hMDR1 और WT कक्षों की वृद्धि की दर को दर्शाता है, क्रमशः (कोई तेज नहीं, 0%)। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
Discussion
एक वाणिज्यिक संश्लेषण मॉड्यूल पर की रेडियो संश्लेषण [11C]SNAP-7941 स्थापित किया गया था। पूरी तरह से तैयारी की प्रक्रिया को स्वचालित करने की संभावना के कारण, रेडियोसंश्लेषण विश्वसनीय होने के लिए सबूत, और ऑपरेटर के विकिरण संरक्षण के बारे में सुधार हासिल किए गए थे। सिंथेसाइज़र की तैयारी विशेष रूप से मोलर गतिविधि के मामले में, रेडियोट्रैकर की गुणवत्ता पर एक भारी प्रभाव पड़ता है। इस प्रकार, यह लगातार अक्रिय परिस्थितियों (उदा., हीलियम वातावरण) के तहत काम करने के लिए आवश्यक है, और प्रतिक्रिया पोत से पहले स्थित सभी लाइनों फ्लश करने के लिए (लक्ष्य रेखा, [11C]CH3I उत्पादन चक्र और रिएक्टर (चित्र 2) देखें)। इसके अलावा, नमी और वायुमंडलीय कार्बन को दूर करने के लिए संश्लेषण के शुरू होने से पहले संबंधित जाल और ओवन हीटिंग मोलर गतिविधि लाभप्रद बढ़ जाती है। विशेष रूप से AgOTf स्तंभ, graphitized कार्बन के साथ गर्भवती, आर्द्रता के लिए बेहद संवेदनशील है. नमी के किसी भी स्रोत की भी मामूली मात्रा में [11C]CH3I से $11C]CH3OTf के रूपांतरण को परेशान करते हैं। संश्लेषण शुरू करने से पहले, [11C]CO2 जाल और [11C]CH3मैं जाल कमरे के तापमान को फिर से ठंडा किया जा करने के लिए बाद में फँसाने सक्षम करने के लिए. इसके अलावा, यह संश्लेषण शुरू करने से पहले शीघ्र ही अग्रदूत भंग करने के लिए और सीधे अग्रदूत समाधान में आधार जोड़ने के लिए सिफारिश की है.
कार्बन-11 रेडियोट्रेसर के लिए गुणवत्ता नियंत्रण को एक सतत और तेजी से कार्यप्रवाह के लिए तर्कसंगत रूप से डिजाइन किया जाना चाहिए। हालांकि, सेल संस्कृति के अध्ययन के लिए सबसे महत्वपूर्ण पैरामीटर रेडियोकेमिकल शुद्धता और मोलर गतिविधि मान्य परिणाम प्राप्त करने के लिए कर रहे हैं। मोलर गतिविधि का सही मूल्यांकन एक मजबूत विश्लेषणात्मक HPLC विधि की आवश्यकता है और अंशांकन वक्र अंतिम उत्पाद की एकाग्रता रेंज को कवर किया है. रेडियोट्रेसर्स के लिए चुनौतीपूर्ण हिस्सा विकिरण संश्लेषण के दौरान उत्पादित कर रहे हैं, जो छोटी मात्रा के कारण परिमाणीकरण (LOQ) की सीमा से ऊपर एक एकाग्रता को प्राप्त करने के लिए है. इसलिए, कला रिसेप्टर संतृप्ति और उच्च पर्याप्त सांद्रता से बचने के लिए उच्च मोलर गतिविधियों के बीच संतुलन अभी भी गैर-रेडियोएक्टिव संकेत मात्रा निर्धारित करने में सक्षम होने के लिए है।
[11सी] SNAP-7941 मानव पी-जी पी ट्रांसपोर्टर का एक शक्तिशाली सब्सट्रेट होने की पुष्टि की गई थी, क्योंकि तेजी से efflux के कारण अनुपचारित या वाहन द्वारा उपचारित MDCKII-hMDR1 कोशिकाओं में कोई संचय नहीं देखा गया था। इसके विपरीत, दोनों प्रयोगात्मक सेट अप (MDCKII-WT या पूर्व अवरुद्ध MDCKII-hMDR1 कोशिकाओं) इसी तरह के परिणाम प्रदान की (की संचय [11C]SNAP-7941), इन विट्रो परख में इस की बहुमुखी प्रतिभा का समर्थन. MDCKII-hMDR1 कोशिकाओं उनके स्थिर transfection, तेजी से विकास और घूर्णन सेल संस्कृति पकवान की वजह से कतरनी तनाव के खिलाफ लगातार के कारण LigandTracer प्रयोगों के लिए अत्यधिक उपयुक्त हैं। चूहे और चूहों के मस्तिष्क में11सीजेडSNAP-7941 तेज की कमी इसलिए पी-जी पी ट्रांसपोर्टर के माध्यम से efflux के कारण हो सकता है. मानव बहु दवा प्रतिरोध प्रोटीन 1 (hMDR-1, पी-जी.पी) के साथ कुत्ते गुर्दे की कोशिकाओं के transfection के कारण, मनुष्यों में efflux ट्रांसपोर्टर बाध्यकारी के लिए इस विधि का भविष्य कहनेवाला मूल्य उच्च है, जो एक भविष्य नैदानिक आवेदन के मामले में अनुकूल है. हालांकि, अभी तक, अन्य efflux ट्रांसपोर्टर के खिलाफ चयनात्मकता सत्यापित नहीं किया गया था. इसलिए, अन्य सेल लाइनों का इस्तेमाल किया जा सकता है, स्तन कैंसर प्रतिरोध प्रोटीन (BCRP) या एकाधिक प्रतिरोध प्रोटीन-1 (MRP-1) के रूप में विभिन्न प्रमुख efflux ट्रांसपोर्टरों व्यक्त, इन ट्रांसपोर्टरों के प्रति बातचीत का अध्ययन करने के लिए. विधि शास्त्रीय संचय या परिवहन परख बहुत सरल की तुलना में है और तुरंत गुणात्मक परिणाम देता है. इसके अलावा, सबसे बड़ा लाभ यह है कि इस तकनीक पीईटी अनुरेखक और वास्तविक समय में लक्ष्य के प्रत्यक्ष संपर्क के मूल्यांकन में सक्षम बनाता है, अप्रत्यक्ष परिमाणीकरण का उपयोग पारंपरिक प्रयोग के विपरीत (ज्यादातर विस्थापन). इसके अतिरिक्त, वास्तविक समय radioassay सॉफ्टवेयर प्रयोगात्मक लचीलापन प्रदान करता है (जैसे, न्यूक्लाइड क्षय सुधार, समय और पदों को मापने, आदि) और इसलिए, उपयोगकर्ताओं के लिए उच्च स्वतंत्रता. दूसरी ओर, विधि की सीमाओं में एक कम नमूना थ्रूपुट शामिल है, क्योंकि एक समय में केवल एक सेल डिश को मापा जा सकता है। इसके अलावा, कुछ अन्य तकनीकी और परिचालन मुद्दों को ध्यान में रखा जाना चाहिए: वर्णित प्रौद्योगिकी पृष्ठभूमि विकिरण के प्रति बहुत संवेदनशील है; इस प्रकार, विकिरण स्रोतों दूरी पर रखा जाना चाहिए और जोर प्रयोग करने से पहले पृष्ठभूमि माप पर रखा जाना चाहिए. कमरे के तापमान से उच्च तापमान पर प्रयोगों के विषय में एक और मुद्दा, झुका समर्थन के हीटिंग है: सेल संस्कृति माध्यम के वाष्पीकरण डिटेक्टर को प्रभावित कर सकता है. हीटिंग के बजाय, पूरे डिवाइस को अधिमानतः इनक्यूबेटर में रखा जाता है। इसके अलावा, विधि अनुयायी सेल लाइनों तक सीमित है. सेल संस्कृति पकवान के रोटेशन के माध्यम से, कतरनी तनाव संवेदनशील कोशिकाओं पकवान है, जो अमान्य परिणाम के लिए नेतृत्व कर सकते हैं से अलग हो सकता है.
फिर भी, यदि प्रयोगकर्ता इन मामूली कमियों पर ध्यान देता है तो विधि पूर्व नैदानिक पीईटी-ट्रेसर्स के गतिज व्यवहार के विश्लेषण के लिए तेजी से और विश्वसनीय परिणाम देती है।
Disclosures
हमारे पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
यह काम ऑस्ट्रिया ईज़र्ड फंड (FWF P26502-B24, M. Mitterhauser) द्वारा समर्थित किया गया था। हम टी जेन्ज़ और ए. Krcal के तकनीकी समर्थन के लिए आभारी हैं. इसके अलावा, हम AgOTf और एच Spreitzer के अग्रदूत के वितरण के लिए तैयार करने के लिए के Pallitsch धन्यवाद.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Table 1: List of materials and instrumentation of the fully automated radiosynthesis of [11C]SNAP-7941 | |||
Ni catalyst | Shimadzu, Kyoto, Japan | Shimalilte Ni reduced, 80/100 mesh | |
Iodine | Merck, Darmstadt, Germany | 1.04761.0100 | |
Acetonitrile | Merck, Darmstadt, Germany | for DNA synthesis, < 10 ppm H2O | |
Acetonitrile | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | HPLC grade | |
Ammonium acetate | Merck, Darmstadt, Germany | ||
Acetic acid | Merck, Darmstadt, Germany | glacial | |
Ethanol | Merck, Darmstadt, Germany | 96% | |
NaCl | B. Braun, Melsungen, Germany | 0.9% | |
Tetrabutylammonium hydroxide | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | ||
Methanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | HPLC grade | |
SPE cartridge | Waters, Milford, MA, USA | SepPak C18plus | |
Semi-preparative RP-HPLC column | Merck, Darmstadt, Germany | Chromolith SemiPrep RP-18e, 100-10 mm | |
Precolumn | Merck, Darmstadt, Germany | Chromolith Guard RP-18e, 5-4.6 mm | |
Precursor | University of Vienna, Austria | SNAP-acid | |
Reference compound | University of Vienna, Austria | SNAP-7941 | |
Silver trifluoromethanesulfonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | ||
Graphpa GC | Alltech, Deerfield, IL, USA | 80/100 mesh | |
PET trace 860 cyclotron | GE Healthcare, Uppsala, Sweden | ||
[11C]CO2 high pressure target | Air Liquide, Vienna, Austria | ||
TRACERlabFX2 C | GE Healthcare, Uppsala, Sweden | ||
N2 + 1% O2 | Air Liquide, Vienna, Austria | Target gas | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Table 2: List of materials and instrumentation of the quality control of [11C]SNAP-7941. | |||
Merck Hitachi LaChrom, L-7100 | Hitachi Vantara Austria GmbH (Vienna, Austria) | HPLC pump | |
Merck Hitachi, L7400 | Hitachi Vantara Austria GmbH (Tokyo, Japan) | UV-detector | |
NaI-radiodetector | Raytest (Straubenhardt, Germany) | NaI-radiodetector | |
Chromolith Performance RP-18e, 100-4.6 mm | Merck (Darmstadt, Germany) | HPLC column | |
430-GC | Bruker (Bremen, Germany) | Gas chromatograph | |
Capillary column ID-BP20; 12 mx0.22 mmx0.25 mm | SGE Ananlytical Science Pty. Ltd. (Victoria, Australia) | Gas capillary | |
Wesco, osmometer Vapro 5600 | Sanoya Medical Systems (Vienna, Austria) | Osmometer | |
g-spectrometer | g-spectrometer | ||
Gas chromatography controlling software | VARIAN (Palo Alto, California, U.S.A) | Galaxie Version 1.9.302.952 | |
Gamma spectrometer controlling software | ORTEC (Oak Ridge, Tenessee, U.S.A.) | Maestro for windows Version 6.06 | |
Gamma spectrum recalling software | ORTEC (Oak Ridge, Tenessee, U.S.A.) | Winplots version 3.21 | |
HPLC controlling software | Raytest (Straubenhardt, Germany) | Gina Star Version 5.9 | |
inolab 740 | WTW (Weilheim, Germany) | pH meter | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Table 3: List of materials and instrumentation for the evaluation of the real-time kinetic behaviour of [11C]SNAP-7941. | |||
Madin-Darby Canine Kidney cell line (MDCKII-hMDR1) | Netherlands Cancer Institute (NKI, Amsterdam, Netherlands) | Expressing the human P-glycoprotein (hMDR1) | |
Madin-Darby Canine Kidney cell line (MDCKII-WT) | Netherlands Cancer Institute (NKI, Amsterdam, Netherlands) | Wildtype (WT) | |
DMEM GlutaMAX | VWR International GmbH, Vienna, Austria | Gibco 61965-026 | |
Fetal Calf Serum (FCS) | VWR International GmbH, Vienna, Austria | Gibco 10270-106 | |
Penicillin/Streptomycin | VWR International GmbH, Vienna, Austria | Gibco 15140 | |
Cell culture dish | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | Cellstar 100 mm x 20 mm, Mfr.No. 664160 | |
In vitro experiments | |||
DMEM GlutaMAX | VWR International GmbH, Vienna, Austria | Gibco 61965-026 | |
(±)-Verapamil hydrochloride | Sigma Aldrich (St. Louis, Missouri, USA) | ||
DMSO | Sigma Aldrich (St. Louis, Missouri, USA) | 276855-100 mL | |
Cell culture dish | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | Cellstar 100 mm x 20 mm, Mfr.No. 664160 | |
Sterile disposable plastic pipettes | VWR International GmbH, Vienna, Austria | Sterilin, 5 mL – 25 mL | |
Sterile pipette tips | VWR International GmbH, Vienna, Austria | Eppendorf epT.I.P.S. Biopur 20 µL – 200 µL | |
Cell culture flasks | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | Cellstar 250 mL, 75 cm2 red filter screw cap, Mfr.No.658175 | |
LigandTracer control Version 2.2.2 | Ridgeview Instruments AB, Uppsala, Sweden. | ||
LigandTracer Yellow | Ridgeview Instruments AB, Uppsala, Sweden. | ||
LigandTracer White | Ridgeview Instruments AB, Uppsala, Sweden. | ||
GraphPad Prism 6.0 | GraphPad Software, Inc. | ||
Handheld automated Cell Counter | Millipore Corporation Billerica MA01821 | Scepter (Cat.No. PHC00000) | |
Cell Counter Sensors | Millipore Corporation Billerica MA01821 | Scepter Sensor 60 µm (Cat.No. PHCC60050) |
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