Aspecto técnico da síntese automatizada e avaliação cinética em tempo real de [¹¹C] SNAP-7941

Summary

Aqui, nós representamos um protocolo para o radioolabelling totalmente automatizado de [¹¹C] SNAP-7941 e a análise da cinética em tempo real deste Pet-Tracer em P-GP expressando e não-expressando pilhas.

Abstract

O tomography de emissão de Positron (animal de estimação) é uma técnica molecular essencial da imagem latente que fornece introspecções em caminhos e usando radioligantes alvejados específicos para investigações in vivo. Dentro deste protocolo, um ajudado remoto-controlado robusto e de confiança de [¹¹C] snap-7941, um antagonista ao receptor da hormona da melanina-concentração 1, é descrito. A radiosíntese começa com ciclotron produzido [¹¹c] co₂ que é posteriormente mais reagindo através de uma transição de fase gasosa para [¹¹c] ch₃OTF. Então, este intermediário reactivo é introduzido à solução do precursor e dá forma ao radiotracer respectivo. Química, bem como a pureza radioquímica são determinados por meio de RP-HPLC, rotineiramente implementado no processo de controle de qualidade radiofármacos. Adicionalmente, a atividade molar é calculada, pois é uma necessidade para as seguintes investigações cinéticas em tempo real. Além disso, [¹¹C] SNAP-7941 é aplicado às pilhas de MDCKII-WT e de Mdckii-hMDR1 para avaliar o impacto da expressão da p-glicoproteína (p-GP) na acumulação da pilha. Por esta razão, o p-GP expressando a linha celular (mdckii-hMDR1) é usado sem ou com bloqueio antes dos experimentos por meio do substrato p-GP (±)-Verapamil e os resultados são comparados aos observados para as células do tipo tipo selvagem. A abordagem experimental global demonstra a importância de uma gestão de tempo precisa que é essencial para todos os estudos pré-clínicos e clínicos utilizando traçadores Pet radiomarcados com nuclídeos de curta duração, como o Carbon-11 (meia-vida: 20 min).

Introduction

[¹¹C] SNAP-7941 foi evoluído como o primeiro tomography de emissão do positrão (animal de estimação)-Tracer que Segia o receptor da hormona da melanina-concentração 1 (MCHR1)-um receptor envolvido principalmente na regulação central do apetite e da entrada de alimento¹. A rotulagem de carbono-11 de snap-7941, um antagonista MCHR1 bem caracterizado, rendeu o animal de estimação-Tracer autêntico^2,3,4,5. No entanto, a radiosíntese totalmente automatizada é altamente desafiadora em termos de eficácia de tempo e reprodutibilidade com o radionuclídeos de curta duração Carbon-11 oferecendo uma meia-vida de 20 min⁶. O tempo de síntese geral deve ser mantido ao mínimo, e como regra de ouro não deve exceder 2-3 meia-vida (ou seja, cerca de 40-60 min para Carbon-11)⁷. Especialmente, os procedimentos de síntese para radiofármacos visando sistemas receptores com densidades de baixa expressão devem ser extensivamente otimizados para obter rendimentos suficientes e, consequentemente, alta atividade molar⁸. A estratégia sintética, muitas vezes segue a produção de radionuclídeos dentro de um ciclotron e liberação de [¹¹C] co₂ para o sintetizador. Lá, [¹¹c] co₂ é reduzido primeiramente a [¹¹c] ch₄ e reagido subseqüentemente com o iodo para render [¹¹c] ch₃mim através do método da gás-fase^9,10. Um tratamento mais adicional com rendimentos triflato de prata [¹¹C] ch₃OTF diretamente em linha. Posteriormente, este intermediário com rótulo de carbono-11 reativo é introduzido em uma solução contendo a molécula precursora. Uma radiosíntese automatizada envolve adicionalmente um processo da purificação com o RP-HPLC semipreparative que inclui a formulação subseqüente do produto apropriado para estudos pré-clínicos e clínicos.

Independentemente da semivida do radionuclídeos e do esforço temporal da radiosíntese, a farmacocinética de um Radiofármaco é a parte mais crítica a ser avaliada durante o desenvolvimento do PET-Tracer. Em termos de neuroimagem, a entrada cerebral do PET-Tracer é o principal pré-requisito. No entanto, a barreira hematoencefálica (BBB), uma "borda de segurança" do cérebro, altamente expressa transportadores de efluxo que podem descarregar pequenas moléculas (por exemplo, PET-Tracers) e dificultar eficientemente a sua aplicabilidade.

Uma enorme desvantagem durante a avaliação pré-clínica são interações inesperadas para estes transportadores de efluxo, que muitas vezes não são reconhecidos em experimentos in vitro e levando à falha do PET-Tracer in vivo, como observado para [¹¹C] SNAP-7941. a imagem latente do μPET nos ratos demonstrou a baixa acumulação do cérebro, que aumentou dramàtica após a administração do tariquidar¹¹do inibidor da P-GP. Estes dados sugeriram que [¹¹C] snap-7941 é um substrato deste sistema transportador de efluxo impedindo ligante ligação ao MCHR1. Infelizmente, ainda há falta de modelos in vitro adequados que permitam a predição da penetração do BBB em um estágio inicial de desenvolvimento de traçador.

Aqui, descrevemos a síntese automatizada de [¹¹C] SNAP-7941 usando um sintetizador para metilações de carbono-11. A ênfase deste trabalho é dar uma visão geral sobre como organizar uma abordagem experimental consecutiva, incluindo a síntese automatizada, controle de qualidade, bem como a avaliação in vitro sucessiva com o nuclide de curta duração de carbono-11.

Primeiramente, as etapas chaves para uma radiosíntese bem sucedida com despesa de tempo mínima e rendimento máximo são descritas. Em seguida, é criado um procedimento de controlo de qualidade fiável que disponibilize o radiotraçador para estudos clínicos potenciais e que se encontra com os critérios da Farmacopeia Europeia¹². A quantificação da concentração molar e o cálculo da respectiva atividade molar são um requisito essencial para as sucessivas medições cinéticas.

Por fim, apresenta-se um método in vitro novo e direto avaliando as interações do snap-7941com [¹¹C] para o transportador de efluxo, P-GP (hMDR1). O modelo cinético proposto utiliza um dispositivo fácil de manusear que permite uma interpretação imediata dos dados e requer esforço mínimo de cultura celular¹³.

Protocol

CAUTION: no seguinte protocolo são as etapas múltiplas envolvidas que exigem a manipulação e a manipulação da radioactividade. É importante que cada passo esteja de acordo com o departamento de segurança radiológica do Instituto e o respectivo legislador nacional. É obrigatório minimizar a exposição a radiações ionizantes para os operadores envolvidos na sequência do princípio ALARA ("tão baixo quanto razoavelmente alcançável").

1. gerenciamento de tempo e planejamento do experimento

Nota: a meia-vida curta do Carbon-11 requer um gerenciamento de tempo preciso para minimizar a perda de radioatividade (Figura 1). É importante que qualquer pessoa envolvida conheça a sua área de responsabilidade e o ponto temporal da respectiva acção. Para a set up de uma experiência cinética em tempo real de [¹¹C] SNAP-7941, cerca de quatro pessoas são necessárias para um processo suave.

1. Organize um produtor para [¹¹C] SNAP-7941.
2. Informar o operador de controle de qualidade realizando a avaliação da especificação, cálculo da concentração de massa e atividade molar do tempo de início da síntese.
3. Segure o experimentador cinético em tempo real pronto para o cálculo da diluição e realizando o experimento.
4. Instrua o corredor para transferir a radioatividade para o respectivo local no respectivo ponto de tempo.

2. síntese automatizada de [¹¹C] SNAP-7941 para uso pré-clínico

1. Preparação do sintetizador (Figura 2).
   1. Ligue o sintetizador, os gases técnicos necessários (hélio e hidrogênio) e o software de controle de sintetizador Tracerlab. Selecione a respectiva sequência de síntese snap.
   2. Lave v1-v3 uma vez com água e duas vezes com acetona através do reator e da válvula da HPLC ou na carga ou injete a posição no frasco waste do laço.
   3. Seque todas as linhas associadas dentro e fora do reator através da válvula da injeção com um fluxo contínuo do hélio ativado através de v18.
   4. Aqueça o [¹¹c] ch₃I armadilha, bem como o [¹¹c] ch₃OTF Trap um fluxo de hélio de 100 ml · min^-1 até 200 ° c através de v24, v25, v29, v15, V9, v17 e V32/5/10 com reator destacado.
   5. Verifique o mesmo caminho para vazamentos (com reator anexado) com um fluxo de hélio de 100 mL · min^-1. A tensão é garantida quando o fluxo cai abaixo de 4 mL · min^-1.
   6. Gire sobre a bomba da HPLC (5-10 mL · min^-1) e lave as linhas da HPLC e a válvula da injeção com acetonitrila/água (50/50, v/v) assim como as linhas da HPLC com o solvente da HPLC através de v14 no bulbo.
   7. Esvazie o bulbo via v11 e V12 no frasco de resíduos com um fluxo de hélio via v19. Lave as respectivas linhas com água de V6 novamente via v11 e V12 com um fluxo de hélio via v18.
   8. Lave V5 com etanol e V4 com água via v11 e V12 no frasco de coleta de produto (PCV) usando um fluxo de hélio via v18, em seguida, esvazie o PCV via v13 para o frasco de resíduos com um fluxo de hélio via V20.
   9. Desligue a bomba HPLC, mude para o solvente para a síntese ((acetato de amónio aquoso (2,5 g · L^-1)/ácido acético 97,5/2.5 v/v; pH 3.5)/acetonitrila 75/25 v/v), fixe a coluna semipreparativa da HPLC e equililoque a coluna (fluxo de 5 mL · min^-1).
   10. Preencha os reagentes para a síntese e purificação: 1,5 mL de água (v2), 4,5 mL de 0,9% NaCl (v4), 0,5 mL de 96% de etanol (V5), 10 mL de água (V6) e 90 mL de água (bulbo).
   11. Anexar um novo frasco de resíduos de loop; um frasco para injetáveis do produto (rotulado e equipado com uma agulha de aeração) para v13 e o azoto líquido.
   12. Pré-condicionar um cartucho de SPE (extração em fase sólida) com 10 mL de etanol a 96% e 20 mL de água e anexá-lo entre v11 e V12.
   13. Inicie a sequência de pré-funcionamento 20 min antes de iniciar a síntese, consistindo em aquecer a armadilha [¹¹C] co₂ para 400 ° c e nivelar a armadilha com um fluxo de hélio de 50 ml · min^-1via V27 (2 min). Em seguida, pré-lave o [¹¹C] co₂ Trap por 3 min com gás hidrogênio (120 ml · min^-1) e, finalmente, arrefecer abaixo de 40 ° c.
   14. Dissolver 1 mg de precursor em 400 μL de acetonitrila (para síntese de ADN, < 10 H₂o), transferir a solução para a reacção e adicionar 5,5 ΜL de tbah (264 mg · ml^-1 em metanol). Prenda o reator à sua respectiva posição.
   15. Feche a célula quente e ligue a pressão a célula quente.
   16. Confirme o início do processo de arrefecimento da armadilha CH₄ com nitrogênio líquido a-75 ° c.
   17. Liberte a radioactividade quando a temperatura for atingida.
2. Produção de ciclotron de [¹¹C] co₂
   Nota: as etapas 2.2.1-2.2.4 são conduzidas simultaneamente à preparação do módulo da radiosíntese (Veja também Figura 1).
   1. Ligue o ímã do ciclotron.
   2. Selecione o alvo ¹¹C-Co₂ e inicie o feixe 65 μA.
   3. Confirme o início da irradiação empurrando o botão iniciar a irradiação
   4. Pare o feixe e confirme a liberação da radioatividade no sintetizador empurrando o botão de entrega, após a quantidade desejada de radioatividade é atingido (aprox. 120 GBq após 30 min).
3. Execução da radiosíntese totalmente automatizada
   1. Confirme se o sistema está pronto para receber a radioatividade e iniciar o processo automatizado
   2. Monitorando o seguinte processo automatizado.
      1. Verifique se o [¹¹c] co₂ é automaticamente transferido do ciclotron para a unidade de síntese através de V26 (aprox. 4 min) e que o [¹¹c] co₂ está preso na peneira molecular impregnada com níquel como um catalisador ([ ¹¹ anos de C] CO₂ armadilha) à temperatura ambiente.
      2. Acompanhe se o [¹¹C] co₂ Trap é automaticamente liberado primeiro com hélio (50 ml · min^-1) e, em seguida, com gás hidrogênio (120 ml · min^-1). Em seguida, observe que V27 e v25 estão fechados e os presos [¹¹c] co₂ , incluindo o gás hidrogênio é aquecido a 400 ° c e que o formado [¹¹c] ch₄ é mais transportado para o pré-arrefecido [¹¹c] ch₄ armadilha e presa lá.
      3. Monitor que V10 é fechado, V9 aberto (para a coluna de iodo) e [¹¹c] ch₄ é liberado outra vez aquecendo a armadilha de [¹¹c] ch₄ lentamente a 80 ° c e transportado na unidade da circulação com um córrego do hélio através V10 (saída de escape). E verifique se [¹¹c] ch₄ é convertido para [¹¹c] ch₃i dentro da unidade de circulação, que duram cerca de 3 min e o formado [¹¹c] ch₃I é continuamente preso no [¹¹c] CH₃I armadilha.
      4. Certifique-se de que a válvula de escape v16 está aberta e a armadilha [¹¹C] ch₃I é aquecida a 90 ° c com um fluxo de hélio (20 ml · min^-1) via v24. Por este meio, os subprodutos possíveis são removidos e, em seguida, v16 é fechado.
   3. Confirme que o [¹¹C] ch₃I está pronto para ser liberado no reator.
   4. Monitore o seguinte processo automatizado: Verifique se o [¹¹c] ch₃i armadilha é aquecida a 190 ° c e o formado [¹¹c] ch₃i é liberado para o reator através do [¹¹c] ch₃OTF Trap (V32 e, ainda, em 200 ° C), v7 e V8 um fluxo contínuo de hélio (10-25 mL · min^-1, v24). Durante este processo, v21 e v23 (saída de escape) tem que ser aberto.
   5. Confirme que a radioatividade chegou ao reator, uma vez que a quantidade de radioatividade no reator não está aumentando mais.
   6. Acompanhamento do processo automatizado a seguir e preparação para intervenção manual, se necessário
      1. Verifique se v23, v21 e V8 são automaticamente fechados e a mistura de reação é aquecida a 75 ° c. Após 3 min, observe se o reator é resfriado com nitrogênio líquido até que a temperatura esteja abaixo de 35 ° c. Posteriormente, certifique-se de que a mistura de reacção é extinto com 1,5 mL de água via v2. Durante este processo, v21 e v23 (saída de escape) tem que ser aberto.
      2. Acompanhe se v21 e v23 estão fechados e a mistura de reação é transferida para a válvula de injeção de HPLC, passando através de um detector de fluido para o loop HPLC (5 mL). Acompanhe se a mistura de reação é injetada automaticamente na coluna HPLC.
   7. Observe o cromatograma e corte manualmente o pico do produto através do início do picodo botão. Pressione a extremidade Peak quando o sinal de pico do produto cai abaixo de aproximadamente 400 CPS após um tempo de retenção de cerca de 8-10 min (fluxo: 5 ml · min^-1, Figura 3).
   8. Ligue um fluxo de hélio adicional para acelerar o esvaziamento do bulbo.
   9. Monitore se o bulbo está esvaziando e observe o frasco waste: verific se o bulbo está esvaziado através de v11, o cartucho de SPE e V12 no desperdício com um córrego do hélio através de v19 e uma linha adicional do hélio e se o produto retém no cartucho de SPE.
   10. Confirme que a lâmpada está completamente vazia.
   11. Monitoramento do processo automatizado de purificação de SPE e transferência de produtos
       1. Verifique se o cartucho SPE é lavado com 10 mL de água via V6, v11 e V12 nos resíduos e se o etanol eluta o produto para o PCV via V5, v11 e V12. Finalmente, observe se 0,9% NaCl é adicionado ao PCV via v4, v11 e V12 para diluir o produto.
       2. Certifique-se de que a solução do produto é transferida via v13 e um filtro estéril para o frasco do produto final com um fluxo de hélio via V20.
   12. Confirme que o produto foi completamente transferido.

3. controle de qualidade (QC)

Nota: o controlo de qualidade dos radiofármacos inclui a medição dos seguintes parâmetros:

• Pureza radioquímica e atividade molar (RP-HPLC)
• Solventes residuais (cromatografia gasosa, GC)
• Osmolaridade (Osmómetro de pressão de vapor)
• pH (medidor de pH)
• γ Spectrum/radionuclide pureza (γ-espectrômetro)
• Pureza de meia-vida/radionuclídeos (Calibrador de dose)

Todos os parâmetros físico-químicos são determinados antes da liberação do produto e os valores devem estar na faixa de parâmetros de qualidade definida.

1. Preparação do equipamento de controlo de qualidade
   1. Comece a preparação 30 min antes do final da síntese.
   2. Prepare um frasco cônico em um recipiente blindado de chumbo e uma seringa blindada de 1 mL com uma agulha acoplada.
   3. Prepare uma solução padrão de referência de SNAP-7941 (10 μg · mL^-1) em água para HPLC.
   4. Gire sobre o medidor de pH, o cromatografo do gás e os gáses usados, o osmômetro e todos os componentes do HPLC.
   5. Ative o software de controle de HPLC e selecione a coluna dedicada e o respectivo método para [¹¹C] SNAP-7941 (fase móvel: (água/ácido acético 97,5/2,5 v/v; 2,5 g. L^{-1 acetato de} amônio; pH 3,5)/acetonitrila 70/30 v/v; vazão: 1 ml · min ^-1) e escreva uma lista de amostras com duas medições (padrão e produto). Inicie o método de condicionamento da coluna.
   6. Injete 20 μL da solução de referência SNAP-7941 com uma seringa de Hamilton após 10 min de condicionamento e inicie a análise.
   7. Lave a seringa de Hamilton duas vezes com acetonitrila e água após a injeção.
   8. Inicie o software de controle GC e escreva a lista de exemplo.
2. Realizando controle de qualidade
   1. Meça o rendimento radioactivo absoluto do produto após o fim da síntese e transfira 100 μL do produto para um frasco de reacção com a seringa preparada com blindagem de chumbo para controlo de qualidade.
      Nota: todos os dados obtidos a partir do controlo de qualidade devem ser documentados de acordo com os regulamentos nacionais.
   2. HPLC analítica: Meça a pureza radioquímica e a pureza química e informe a pessoa responsável para as experiências da cultura da pilha imediatamente dos resultados.
      1. Extrair 40 μL da amostra de CQ e injetar na HPLC. Iniciar a corrida movendo o braço da válvula de injeção da carga para injetar (Figura 3).
         Nota: durante a corrida (8 min), outras medições do protocolo podem ser executadas para evitar o máximo de deterioração possível.
      2. Abra o cromatograma e integre todos os picos no canal de radioatividade. Compare o tempo de retenção do produto (5,0-7,0 min) com o tempo de retenção do padrão de referência. Compare a área a curva em percentagem de todos os picos integrados. O pico do produto deve ser superior a 95% (pureza radioquímica) das áreas integradas totais (canal de rádio).
      3. Integre o sinal no canal UV para determinar a pureza química. A impureza principal é geralmente o ácido SNAP do precursor em 2.8-3.5 min. A concentração de [^NATC] SNAP-7941 é calculada a partir da curva de calibração após a integração. Calcule a concentração de SNAP-7941 em μmol · mL^-1 e determine a atividade molar por meio da seguinte equação:
         
   3. Para cromatografia gasosa, transfira 20 μL da amostra de controlo de qualidade num frasco para injetáveis de vidro dedicado. Coloque-o no amostrador automático e inicie a medição. Depois que a medida é terminada, abra o cromatograma e anote os números de picos automaticamente integrados. A amostra não deve conter mais de 410 ppm de acetonitrila e 10% de etanol.
   4. Osmolaridade: Coloque um disco de amostra de papel na cavidade dedicada e aplique 10 μL da amostra. Pressione o botão fechar para medir a osmolaridade. Após 3 min, o dispositivo exibe a osmolaridade que deve estar em uma faixa de 190-500 mOsm · kg^-1.
   5. pH: Lave o eletrodo com água. Meça o pH colocando o eletrodo na amostra. O pH tem que estar em uma escala de 5.0-8.5. Lave o eletrodo novamente após a medição e coloque o eletrodo na solução de pH de referência.
   6. γ-Spectrum: põr a amostra do QC no γ-espectrómetro, abra o software de controlo e comece a medida. Pare a medida e anote a energia medida que tem que ser 511 keV (escala 420-520 keV). Abra o menu arquivo e seguro o arquivo com o respectivo número de lote. Lembre-se do espectro salvo no software dedicado e imprima o espectro.
   7. Meia-vida: medir a atividade da amostra QC duas vezes usando o calibrador de dose. Anote os respectivos tempos e calcule a meia-vida do exponencial.
3. Lançamento
   1. Depois de todos os parâmetros terem sido testados e os resultados estarem de acordo com as directrizes das autoridades austríacas, liberte o radiotracer. O operador tem de assinar a exatidão dos dados.

4. avaliação das interações para o transportador da GP-P

1. Cultura de células
   1. Inicie o fluxo de ar laminar (LAF) da bancada e limpe o banco pelo menos 15 min antes de começar a trabalhar.
   2. Misture o meio de cultura celular em condições estéreis no LAF com 10% de FCS (50 mL) e 0,5% de antibióticos (2,5 mL) com uma pipeta volumétrica estéril usando um auxílio de pipetagem automatizado.
   3. Thaw MDCKII-hMDR1 e MDCKII-WT células e cultivar em um T75 ou T175 cultura celular balão 10-14 dias antes de experimentos condições assépticas (LAF).
   4. Mude o meio no dia seguinte para remover todas as células não aderentes e apoptóticas.
   5. Substitua a cada três dias o meio com um fresco (12 mL para o T75 e 23 mL para o balão da cultura da pilha T175, respectivamente).
   6. Divida as células de acordo com o cronograma de experimentos para frascos frescos ou para pratos de cultura de células em cima de uma confluência de 80% para evitar o crescimento de BICAMADA.
2. Preparação de células para experimentos
   1. Dividir as células dois dias antes de experimentos e sementes em uma concentração de 2,5 x 10⁵ células por 2 ml em um plano oblíquo de um prato de cultura celular (Figura 4). Use um dispositivo de contador automático da pilha ou uma câmara de contagem de Neubauer para contar as pilhas e para calcular a relação de rachadura apropriada.
   2. Remova o meio um dia antes das experiências, lave as pilhas no prato da cultura com 4 mL de DPBS e adicione 5 mL frescos do meio de cultura da pilha. Coloque o prato horizontalmente na incubadora.
   3. Lave as células com DPBS pelo menos 0,5 h antes dos experimentos e substitua por 2 mL de meio livre de FBS. Examine a confluência e a morfologia celular com um microscópio.
3. Realizando os experimentos em três configurações diferentes.
   1. Use a placa de Petri para os experimentos, conforme descrito em 4.2.3.
   2. Trate as células para 0,5 h antes de experimentos com 10 μM (±)-cloridrato de Verapamil.
   3. Adicionar 0,98 μL de solução de Verapamil (20,4 mM (±)-cloridrato de Verapamil em DMSO). O conteúdo final do DMSO é ≤ 0, 5% durante o tratamento.
   4. Incubar as células para 0,5 h com o controle do veículo (DMSO). Use o mesmo volume utilizado para o tratamento medicamentoso.
4. Experimentos do ensaio em tempo real (para todas as três configurações)
   1. Ligue o dispositivo, o computador e certifique-se de que estão correctamente ligados e, em seguida, abra o software de controlo.
   2. Escolha uma opção de destino , desbloqueie o modelo e ajuste a seguinte configuração:
      Número de posições: 2 (dois)
      Tempo de detecção (seg): 3 (três)
      Tempo (s) de atraso de detecção: 2 (dois)
      Nome da primeira fase: linha de base
   3. Introduza o prato da cultura da pilha no apoio inclinado do dispositivo, certificando-se de que o pólo da pilha está no lado inferior e coberto com o meio de cultura da pilha.
   4. Inicie a execução através do botão Iniciar . O sistema está pedindo para salvar o arquivo. Escolha um nome de arquivo e um caminho de salvamento. O centro de controle aparece e a medição de linha de base começa (o suporte de prato de cultura de célula começa a girar).
   5. Selecione em outras opções:
      Escala de tempo: minutos
      Correção de nuclide: Carbon-11
   6. Verifique todas as caixas curvas no gráfico (fundo (vermelho), alvo (azul) e alvo menos fundo (preto)).
   7. Obter parâmetros de controle de qualidade: atividade molar [GBq. μmol^-1] e concentração de atividade [MBQ.ml^-1] no final da síntese.
   8. Calcule o respectivo volume de traçador para 15 nM de [^NATC] SNAP-7941 no volume de ensaio de 2 ml.
      
      
   9. Prepare a pipeta para o respectivo volume e uma alíquota do produto snap-7941 [¹¹C] numa blindagem de chumbo.
   10. Clique em Pausar executar na janela do centro de controle. Aguarde até que a rotação do prato pare e a barra lateral com o título pausado e a próxima fase ocorra.
   11. Abra a tampa do dispositivo cinético em tempo real. Gire o suporte de prato de cultura 90 ° para a esquerda. Adicione o volume calculado do traçador e volte para a posição inicial. Em seguida, feche a tampa do dispositivo. Pressione imediatamente o botão continuar para iniciar o experimento.
   12. Termine o experimento após 20 min selecionando pausar e, subsequentemente, termine a execução (pressione end Run na barra lateral).
5. Análise e processamento de dados utilizando um software estatístico
   1. Abra o software de controle em tempo real. Clique em abrir arquivos para recordar a cinética necessária. A cinética é ilustrada na janela do centro de controle.
   2. Escolha com o botão direito do mouse diretamente nas curvas de exportaçãocinética. Guarde o ficheiro de texto que contém os dados brutos. Abra o programa de estatísticas e cole o arquivo de dados brutos de experimentos em tempo real.
   3. Comece com o tempo (eixo x) na adição de radiotraçador (exclua a medida do fundo) e normalizar ao sinal de porcentagem do CPS máximo (contagens por o segundo).
   4. Carregue todos os dados normalizados em um novo arquivo do GraphPad Prism.
   5. Calcule os valores médios e o desvio padrão.
   6. Ilustrar os dados obtidos como gráfico mostrando o desvio (taxa de aumento) de captação de traçador de todos os três set-ups.

Representative Results

A radiosíntese totalmente automatizada de [¹¹c] SNAP-7941 rendeu 5,7 ± 2,5 GBq (4,6 ± 2,0% no EOB, 14,9 ± 5,9% com base em [¹¹c] ch₃OTF; n = 10) do produto formulado. A síntese global durou cerca de 40 min, onde 15 min foram necessários para a preparação de [¹¹C] ch₃OTF através do método de fase de gás, mais 5 min foram necessários para a radiomarcação do precursor, seguido por 10 min de semi-preparative Purificação de RP-HPLC e 10 min para extração e formulação de fase sólida do cartucho C18. Em seguida, uma pequena alíquota (aprox. 100-200 μL) foi entregue à pessoa responsável pelo controle de qualidade, enquanto o frasco de produto original contendo o rastreador pronto para uso foi passado para o experimentador da análise cinética em tempo real.

O controle da qualidade foi terminado dentro de 10 minutos após o fim da síntese. A atividade molar foi em uma faixa de 72 ± 41 GBq/μmol (n = 10) e a pureza radioquímica foi sempre > 95%. Todos os outros parâmetros (pH, osmolaridade, solventes residuais) preencheram os critérios de liberação. Para o ensaio cinético em tempo real, foram escolhidas três diferentes configurações experimentais: (A) células MDCKII-WT tratadas e não tratadas (veículo), (B) não tratadas ou tratadas com células MDCKII-hMDR1 do veículo e (C) a última linha celular com bloqueio prévio do tempo real ensaio cinético do transportador utilizando (±)-Verapamil. Aplicando [¹¹C] snap-7941 à linha celular do tipo selvagem mdckii-WT (p-GP não-expressando) e mdckii-hMDR1 (p-GP expressando) mostra um comportamento cinética diferente, porque há uma acumulação rápida à linha de pilha do tipo selvagem, visto que nenhum acúmulo foi observado para as células MDCKII-hMDR1. Entretanto, o bloqueio das células do transportador de efluxo P-GP inmdckii-hMDR1 com (±)-Verapamil levou a uma cinética de tempo real comparável como já observada para a linha celular do tipo tipo selvagem (Figura 5).

Figura 1: visão geral do fluxo de trabalho. Fluxo de trabalho da radiosíntese, controle de qualidade e desempenho da medida cinética em tempo real de [¹¹C] SNAP-7941. As setas pretas indicam a forma de transporte da radioatividade. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: esquema Radiosintético do sintetizador automatizado. Circuito de comutação do sintetizador automatizado, começando pela unidade de circulação de [¹¹c] ch₃I/[¹¹c] ch₃OTF Production, reator para introdução da atividade na solução precursora e purificação de SPE (SPE = extração em fase sólida; PCV = frasco de recolha de produtos). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: cromatogramas representativos da radiosíntese totalmente automatizada de [¹¹C] snap-7841. O cromatograma semi-preparative da RP-HPLC é ilustrado na parte superior e no analítico após a purificação na parte inferior. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: preparação do prato de cultura celular para experimentos em tempo real. A etapa 1 inclui a semeadura de 2,5 x 10⁵ até 1 x 10⁶ , dependendo do tipo de célula e sua taxa de crescimento. Subseqüentemente, o prato da cultura é coloc em um plano oblíquo (aproximadamente 30-45 °). Conseqüentemente, o instrumento fornecido do metal ou a tampa de um prato da cultura da pilha podem ser usados na incubadora para estabilizar a posição inclinada do prato. O dia após (24 h) o prato é ajustado horizontalmente, e o meio de cultura fresco da pilha é adicionado para cobrir completamente a superfície da pilha. No dia da experimentação, a viabilidade e a confluência da pilha são examinadas. De acordo com o protocolo experimental, as células são lavadas com DPBS, o meio é substituído por meio livre de soro (2 mL), e o prato de cultura é reposicionado para uma posição oblíqua até o início dos experimentos. Doravante, as células podem ser tratadas com o inibidor ou veículo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: medições cinéticas em tempo real de [¹¹C] SNAP-7941. A cinética em tempo real representativa de [¹¹C] snap-7941 é mostrada em três diferentes set-ups: usando células mdckii-WT; Células MDCKII-hMDR1 pré-bloqueadas com (±)-Verapamil como inibidor da P-GP e células MDCKII-hMDR1 sem bloqueio. O eixo y ilustra a taxa de aumento das células MDCKII-hMDR1 e WT pré-bloqueadas em comparação com os resultados das células MDCKII-MDR1 tratadas ou com tratamento de veículos, respectivamente (sem captação, 0%). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

A radiosíntese de [¹¹C] SNAP-7941 foi estabelecida em um módulo de síntese comercial. Devido à possibilidade de automatizar totalmente o procedimento de preparação, a radiosíntese impermeabilizada para ser confiável, e melhorias em relação à proteção contra radiação do operador foram alcançadas. A preparação do sintetizador tem um enorme impacto na qualidade do radiotracer, especialmente em termos de atividade molar. Assim, é essencial trabalhar constantemente condições inertes (por exemplo, a atmosfera de hélio), e para liberar todas as linhas localizadas antes do vaso de reação (linha alvo, [¹¹C] ch₃I ciclo de produção e reator (ver Figura 2)). Além disso, o aquecimento das respectivas armadilhas e fornos antes do início da síntese para remover a umidade e o carbono atmosférico aumenta a atividade molar vantajosamente. Especialmente a coluna de agotf, impregnado com o carbono de grafite, é extremamente sensível à umidade. Mesmo pequenas quantidades de qualquer fonte de umidade perturbar a conversão de [¹¹c] ch₃I para [¹¹c] ch₃OTF. Antes de iniciar a síntese, a armadilha [¹¹c] co₂ e a armadilha de [¹¹c] ch₃I têm de ser arrefecido para baixo à temperatura ambiente novamente, a fim de permitir a captura subsequente. Além disso, recomenda-se dissolver o precursor pouco antes de iniciar a síntese e adicionar a base diretamente na solução precursora.

O controle de qualidade para radiofármacos Carbon-11 tem que ser racionalmente projetado para um fluxo de trabalho contínuo e rápido. No entanto, os parâmetros mais importantes para estudos de cultura celular são a pureza radioquímica e a atividade molar para obter resultados válidos. A avaliação correta da atividade molar exige um método analítico robusto da HPLC e a curva da calibração tem que cobrir a escala de concentração do produto final. A parte desafiadora para os radiofármacos é conseguir uma concentração acima do limite de quantificação (LOQ) devido às pequenas quantidades, que são produzidas durante a radiosíntese. Assim, a arte é encontrar o equilíbrio entre as atividades de alto molar para evitar a saturação do receptor e concentrações elevadas o suficiente para ainda ser capaz de quantificar o sinal não radioativo.

[¹¹C] O SNAP-7941 foi confirmado para ser um substrato potente do transportador de P-GP humano, pois não foi observada acumulação nas células MDCKII-hMDR1 tratadas ou com o veículo, devido ao rápido efluxo. Em contrapartida, ambos os set-ups experimentais (MDCKII-WT ou células MDCKII-hMDR1 pré-bloqueadas) forneceram resultados semelhantes (acumulação de [¹¹C] SNAP-7941), apoiando a versatilidade deste ensaio in vitro. As pilhas de MDCKII-hMDR1 são altamente apropriadas para experimentos de LigandTracer devido a seu transfection estável, crescimento rápido e persistente de encontro ao stress de cisalhamento causado pelo prato de giro da cultura da pilha. A falta da captação snap-7941 de [¹¹C] no cérebro do rato e dos ratos pôde conseqüentemente ocorrer causada pelo efluxo através do transportador da P-GP. Devido ao transfection de pilhas de rim caninas com a proteína humana 1 da resistência da droga multi (hmdr-1, P-GP), o valor preditivo deste método para a ligação do transportador do efluxo nos seres humanos é elevado, que é favorável nos termos de uma aplicação clínica futura. No entanto, até o momento, a seletividade contra outro transportador de efluxo não foi verificada. Portanto, outras linhas celulares podem ser usadas, expressando diferentes transportadores de efluxo proeminentes como a proteína de resistência ao câncer de mama (BCRP) ou a proteína-1 de resistência múltipla (MRP-1), para estudar interações com esses transportadores. O método é em comparação com a acumulação clássica ou ensaios de transporte muito simples e dá resultados imediatamente qualitativos. Além disso, a maior vantagem é que essa tecnologia possibilita a avaliação da interação direta do traçador PET e do alvo em tempo real, em contraste com o experimento convencional utilizando quantificação indireta (principalmente deslocamento). Adicionalmente, o software do proteica do tempo real fornece a flexibilidade experimental (por exemplo, correção da deterioração do nuclide, tempo e posições de medição, etc.) e conseqüentemente, liberdade elevada para usuários. Do outro lado, as limitações do método incluem uma baixa taxa de transferência da amostra, porque somente um prato da pilha pode ser medido em um momento. Além disso, algumas outras questões técnicas e operacionais devem ser tidas em conta: a tecnologia descrita é muito sensível à radiação de fundo; assim, as fontes de radiação devem ser mantidas à distância e a ênfase deve ser colocada na medida de fundo antes do experimento. Outra questão relativa a experimentos em temperaturas mais elevadas do que a temperatura ambiente, é o aquecimento do suporte inclinado: a evaporação do meio de cultura celular pode afetar o detector. Em vez do aquecimento, o dispositivo inteiro é coloc preferivelmente na incubadora. Além disso, o método é limitado às linhas celulares aderentes. Através da rotação do prato de cultura celular, as células sensíveis à tensão de cisalhamento podem separar-se do prato, o que pode levar a resultados inválidos.

No entanto, se o experimentador presta atenção a esses inconvenientes menores, o método oferece resultados rápidos e confiáveis para a análise do comportamento cinético de PET-Tracers pré-clínicos.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Table 1: List of materials and instrumentation of the fully automated radiosynthesis of [11C]SNAP-7941
Ni catalyst	Shimadzu, Kyoto, Japan		Shimalilte Ni reduced, 80/100 mesh
Iodine	Merck, Darmstadt, Germany		1.04761.0100
Acetonitrile	Merck, Darmstadt, Germany		for DNA synthesis, < 10 ppm H2O
Acetonitrile	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA		HPLC grade
Ammonium acetate	Merck, Darmstadt, Germany
Acetic acid	Merck, Darmstadt, Germany		glacial
Ethanol	Merck, Darmstadt, Germany		96%
NaCl	B. Braun, Melsungen, Germany		0.9%
Tetrabutylammonium hydroxide	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA
Methanol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA		HPLC grade
SPE cartridge	Waters, Milford, MA, USA		SepPak C18plus
Semi-preparative RP-HPLC column	Merck, Darmstadt, Germany		Chromolith SemiPrep RP-18e, 100-10 mm
Precolumn	Merck, Darmstadt, Germany		Chromolith Guard RP-18e, 5-4.6 mm
Precursor	University of Vienna, Austria		SNAP-acid
Reference compound	University of Vienna, Austria		SNAP-7941
Silver trifluoromethanesulfonate	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA
Graphpa GC	Alltech, Deerfield, IL, USA		80/100 mesh
PET trace 860 cyclotron	GE Healthcare, Uppsala, Sweden
[11C]CO2 high pressure target	Air Liquide, Vienna, Austria
TRACERlabFX2 C	GE Healthcare, Uppsala, Sweden
N2 + 1% O2	Air Liquide, Vienna, Austria		Target gas
Name	Company	Catalog Number	Comments
Table 2: List of materials and instrumentation of the quality control of [11C]SNAP-7941.
Merck Hitachi LaChrom, L-7100	Hitachi Vantara Austria GmbH (Vienna, Austria)		HPLC pump
Merck Hitachi, L7400	Hitachi Vantara Austria GmbH (Tokyo, Japan)		UV-detector
NaI-radiodetector	Raytest (Straubenhardt, Germany)		NaI-radiodetector
Chromolith Performance RP-18e, 100-4.6 mm	Merck (Darmstadt, Germany)		HPLC column
430-GC	Bruker (Bremen, Germany)		Gas chromatograph
Capillary column ID-BP20; 12 mx0.22 mmx0.25 mm	SGE Ananlytical Science Pty. Ltd. (Victoria, Australia)		Gas capillary
Wesco, osmometer Vapro 5600	Sanoya Medical Systems (Vienna, Austria)		Osmometer
g-spectrometer			g-spectrometer
Gas chromatography controlling software	VARIAN (Palo Alto, California, U.S.A)		Galaxie Version 1.9.302.952
Gamma spectrometer controlling software	ORTEC (Oak Ridge, Tenessee, U.S.A.)		Maestro for windows Version 6.06
Gamma spectrum recalling software	ORTEC (Oak Ridge, Tenessee, U.S.A.)		Winplots version 3.21
HPLC controlling software	Raytest (Straubenhardt, Germany)		Gina Star Version 5.9
inolab 740	WTW (Weilheim, Germany)		pH meter
Name	Company	Catalog Number	Comments
Table 3: List of materials and instrumentation for the evaluation of the real-time kinetic behaviour of [11C]SNAP-7941.
Madin-Darby Canine Kidney cell line (MDCKII-hMDR1)	Netherlands Cancer Institute (NKI, Amsterdam, Netherlands)		Expressing the human P-glycoprotein (hMDR1)
Madin-Darby Canine Kidney cell line (MDCKII-WT)	Netherlands Cancer Institute (NKI, Amsterdam, Netherlands)		Wildtype (WT)
DMEM GlutaMAX	VWR International GmbH, Vienna, Austria		Gibco 61965-026
Fetal Calf Serum (FCS)	VWR International GmbH, Vienna, Austria		Gibco 10270-106
Penicillin/Streptomycin	VWR International GmbH, Vienna, Austria		Gibco 15140
Cell culture dish	Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany		Cellstar 100 mm x 20 mm, Mfr.No. 664160
In vitro experiments
DMEM GlutaMAX	VWR International GmbH, Vienna, Austria		Gibco 61965-026
(±)-Verapamil hydrochloride	Sigma Aldrich (St. Louis, Missouri, USA)
DMSO	Sigma Aldrich (St. Louis, Missouri, USA)		276855-100 mL
Cell culture dish	Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany		Cellstar 100 mm x 20 mm, Mfr.No. 664160
Sterile disposable plastic pipettes	VWR International GmbH, Vienna, Austria		Sterilin, 5 mL – 25 mL
Sterile pipette tips	VWR International GmbH, Vienna, Austria		Eppendorf epT.I.P.S. Biopur 20 µL – 200 µL
Cell culture flasks	Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany		Cellstar 250 mL, 75 cm2 red filter screw cap, Mfr.No.658175
LigandTracer control Version 2.2.2	Ridgeview Instruments AB, Uppsala, Sweden.
LigandTracer Yellow	Ridgeview Instruments AB, Uppsala, Sweden.
LigandTracer White	Ridgeview Instruments AB, Uppsala, Sweden.
GraphPad Prism 6.0	GraphPad Software, Inc.
Handheld automated Cell Counter	Millipore Corporation Billerica MA01821		Scepter (Cat.No. PHC00000)
Cell Counter Sensors	Millipore Corporation Billerica MA01821		Scepter Sensor 60 µm (Cat.No. PHCC60050)