Nous avons optimisé un protocole pour isoler et purifier les péritéytes cardiaques murines pour la recherche fondamentale et l’étude de leur biologie et de leur potentiel thérapeutique.
Les péricarténties, cellules périvasculaires des microvaisseaux et des capillaires, sont connues pour jouer un rôle dans l’angiogenèse, la stabilisation des navires et l’intégrité de la barrière endothéliale. Cependant, leurs fonctions spécifiques aux tissus dans le cœur ne sont pas bien comprises. De plus, il n’existe actuellement aucun protocole utilisant des matériaux facilement accessibles pour isoler et purifier les péririytes d’origine cardiaque. Notre protocole se concentre sur l’utilisation du modèle très utilisé des mammifères, la souris, comme source de cellules. En utilisant la digestion enzymatique et la dissociation mécanique du tissu cardiaque, nous avons obtenu un mélange brut de cellules qui a été encore purifié par le tri de cellules activant de fluorescence (FACS) par une pléthore de marqueurs. Parce qu’il n’y a pas de marqueur sans équivoque unique pour les péricartés, nous avons fermé pour les cellules qui étaient CD31–CD34–CD45–CD140b–NG2–CD146. Après la purification, ces cellules primaires ont été cultivées et passages plusieurs fois sans aucun changement dans la morphologie et l’expression de marqueur. Avec la capacité d’obtenir régulièrement des péritéytes cardiaques maurines primaires utilisant notre protocole, nous espérons mieux comprendre le rôle des péritéytes dans la physiologie cardiovasculaire et leur potentiel thérapeutique.
Les cellules périvasculaires connues sous le nom de péricartes entourent les microvaisseaux et les capillaires de l’arbre vasculaire1,2. Physiologiquement, ils sont connus pour promouvoir et jouer un rôle dans l’angiogenèse, augmenter l’intégrité de la barrière en raison de leur relation étroite avec les cellules endothéliales ainsi que stabiliser et les vaisseaux matures1,2. En outre, le dysfonctionnement et /ou la perte de ces cellules ont été impliqués dans des maladies telles que la maladie d’Alzheimer2,3 et diverses maladies cardiovasculaires4. Ces cellules se trouvent dans tout le corps, mais les numéros de cellules sont tributaires des tissus. Les péricartes ont notamment été étudiés dans le cerveau en raison de la vascularisation élevée de la barrière hémato-encéphalique1,2. Cependant, dans le cœur, la biologie des péricartes est sous-étudiée.
Récemment, il ya un intérêt accru dans le domaine pour les périytes cardiaques, mais il n’existe actuellement aucun protocole simplifié disponible pour leur isolement de l’un des outils les plus utilisés en biologie – la souris. Il y a des protocoles dans la littérature sur l’isolation des périytes du cerveau5, rétine6, placenta7, et le muscle squelettique8,9; cependant, peu de protocoles sont sur isoler les périytes du cœur. Il y a plusieurs groupes qui ont isolé des péritéytes cardiaques. Nees et coll. ont été en mesure d’isoler une quantité abondante de péritéytes cardiaques de plusieurs espèces, y compris la souris; cependant, leurs méthodes ont employé l’équipement construit interne spécifique qui diminue la reproductibilité10. Avolio et coll.11, Chen et coll.12, et Baily et coll.13 ont également isolé avec succès les périytes cardiaques des tissus cardiaques humains, mais les tissus humains ne sont pas toujours disponibles et difficiles à obtenir pour certains chercheurs. Ici, nous avons développé une méthode d’isolement pour obtenir des péritéytes cardiaques à partir de modèles de souris pour les chercheurs d’étudier davantage leur biologie avec des matériaux facilement disponibles.
Utilisant la digestion enzymatique et le tri activé de cellules de fluorescence (FACS) avec les marqueurs clés connus de périyte14,notre protocole nous permet d’isoler et de purifier une population de péricytes qui sont caractérisés par CD31–CD34–CD45– CD140b–NG2–CD146–. Notre panel de marqueurs contient à la fois des marqueurs d’inclusion et d’exclusion. CD45 est utilisé comme marqueur pour exclure les cellules hématopoïétiques. CD31 est utilisé comme marqueur pour exclure les cellules endothéliales. CD34 est utilisé comme marqueur pour exclure les cellules hématopoïétiques et endothéliales progénitrices. CD146 est un marqueur pour les cellules périvasculaires. Enfin, NG2 et CD140b (également connu sous le nom de bêta récepteur du facteur de croissance dérivé plaquettaire — PDGFRMD) sont tous deux des marqueurs acceptés pour les péritéytes14. La culture primaire obtenue peut être cultivée et adoptée plusieurs fois sans aucun changement dans la morphologie ou l’expression des marqueurs. En outre, ces cellules peuvent être co-cultivées avec des cellules endothéliales pour étudier leurs interactions et se croiser les unes avec les autres. Cette méthode d’isolement cellulaire permettra aux chercheurs d’étudier la biologie et la pathophysiologie des péricytes cardiaques à partir de modèles de souris de type sauvage, de maladie et de variantes génétiques.
Comme les études sur les péritéytes cardiaques sont relativement nouvelles, le rôle des péritéytes dans la physiologie cardiovasculaire et la physiopathologie n’a pas encore été défini. Dans d’autres organes, il a été démontré qu’ils jouent un rôle clé dans l’homéostasie des vaisseaux et la perfusion1,2. Comparé à la littérature des péritéytes d’autres organes tels que le cerveau, il y a sensiblement moins de publications sur des périytes cardiaques. L’isolement des péritéytes cardiaques est essentiel à la compréhension de leurs caractéristiques fonctionnelles et des mécanismes de signalisation. Par conséquent, ce protocole fournira aux chercheurs un moyen plus facile d’accéder aux péritéytes cardiaques à partir d’une source de tissus plus facilement disponible et de promouvoir des études sur leur biologie. Il aidera à répondre aux questions sur la façon dont les péritéytes cardiaques contribuent à l’homéostasie cardiaque et la pathophysiologie ainsi que d’étudier leur potentiel thérapeutique.
La population de péritéytes isolée du cœur murine et caractérisée par CD31–CD34–CD45–CD140b–NG2–CD146– a été passée plusieurs fois (jusqu’à P12 et allait toujours fort), qui ne fonctionne pas la viabilité et se propage rapidement (figure supplémentaire 2). Les cellules ont également été cryocongelées et récupérées avec au moins 95% de viabilité. Cependant, nous préférons utiliser des cellules P7 ou plus jeunes pour nos expériences. En comparant les images de nos péricytes avec les péricytes du cerveau humain, les deux lignées cellulaires ont une morphologie cellulaire comparable (Figure 4A) alors qu’elles diffèrent en morphologie des cellules musculaires lisses (Figure 4A). Nos cellules P7 ont été caractérisées par l’immunocytochimie pour les marqueurs de péricyyte, certains de notre panneau FACS (NG2 et CD140b), et quelques-uns pas dans le panneau (vimentin, desmin, SMA) et nous avons constaté que les cellules ont exprimé des marqueurs de périyte homogène (Figure 4B). En outre, nos cellules P7 ont été analysées par cytométrie de flux à nouveau avec le même panneau de marqueur pour évaluer les changements dans l’expression des marqueurs en raison de la passaging et nous avons constaté qu’il n’y avait aucun changement (Figure 4C). Par conséquent, à la fois phénotypique et morphologique, nos cellules sont périrites.
Les études de Nees et coll.10, Avolio et coll.11, Chen et coll.12, et Baily et coll.13 ont montré des isolements péritéytes cardiaques réussis. Cependant, l’utilisation d’un équipement construit sur mesure à l’interne pour détacher les péritéytes des micronavires par Nees et coll.10 impliquait deux chambres avec des pompes qui perfusaient la solution de protéase d’avant en arrière à travers une pile de filets à mailles, ce qui était difficile à reproduire lorsqu’ils n’a pas fourni de schéma et/ou d’image de l’appareil et de la façon dont il a été construit. Bien que Nees et coll.10 aient réussi à isoler les péritéytes cardiaques de nombreuses espèces, nous n’avons jamais été en mesure de reproduire leur méthode. Notre étape de détachement de périyte dans notre protocole utilise simplement un shaker orbital (pour dissocier toutes les cellules) qui est disponible dans la plupart, sinon tous les laboratoires, avec le tissu et la solution d’enzyme dans un tube conique suivi d’une étape de dissociation mécanique. Il n’y a pas d’appareil personnalisé requis. Deuxièmement, les protocoles restants impliquent l’utilisation de tissus humains et donc l’achat de tissus humains se limite aux chercheurs. Notre protocole est une modification et l’optimisation des protocoles actuels9,12 en utilisant des modèles de souris (type sauvage, génétiquement modifié, malade) et des matériaux qui sont facilement disponibles pour tous les chercheurs.
Puisque les cellules périvasculaires en général sont sensibles, la viabilité des cellules est critique pour obtenir un bon rendement. Pendant l’acquisition du tissu cardiaque et la coloration des cellules, les tissus/cellules doivent être maintenus froids de glace. Deuxièmement, la digestion enzymatique du tissu peut nécessiter une optimisation individuelle. Selon les unités d’activité sur ses flacons d’enzymes, la concentration et le temps de digestion peuvent devoir être optimisés. Assurez-vous que la solution enzymatique est préparée fraîche à chaque fois que le rendement diminuera. Troisièmement, le mélange brut contient beaucoup de cellules, certaines mortes et / ou mourantes, il est préférable de réduire la concentration de FBS dans le tampon de coloration de 5% à 2%. Si vous rencontrez des problèmes avec les cellules obstruant la buse pendant la tri, enrichissez les cellules d’abord en utilisant un kit de retrait des cellules mortes. Vous pouvez également ajouter edTA/HEPES tampon ou traitement DNase à la cellule pré-tri pour empêcher l’agglutination cellulaire. Enfin, parce que notre panel d’anticorps est assez grand et utilise de nombreux fluorophores, assurez-vous que vos contrôles FMO et les contrôles de compensation sont effectués correctement.
Une limitation à cette méthode est la quantité de périytes cardiaques qui peuvent être obtenus par cœur. Dans notre cas, seulement 1,1% de notre mélange brut d’un coeur de souris étaient des péricartéytes qui est comparable au pour cent dans les isolements de coeur humain, mais le nombre de cellules est sensiblement moins due à la quantité de tissu cardiaque qu’une souris fournit. Parce que le nombre de cellules de départ est si faible après FACS, il serait préférable d’isoler de plusieurs cœurs à la fois. Cependant, le problème avec cela est le nombre de cellules que vous devez trier en une seule journée. Si vous avez plus de 30 millions de cellules, il sera difficile de passer à travers le tri sans affecter la viabilité des cellules. Si l’enquêteur avait plusieurs trieurs cellulaires, isoler de plusieurs cœurs dans une journée serait faisable. Une autre limitation est que parce que nous ne savons pas s’il ya des sous-populations de péritytes dans le cœur comme il ya le muscle squelettique15,16, nous ne savons pas si nous éliminons un sous-type dans notre stratégie de gating. Nous sommes en train de caractériser nos péritéytes cardiaques et jusqu’à présent dans nos données non publiées, ils sont fonctionnellement comme d’autres péricartes dans la littérature.
Notre protocole permettra aux chercheurs de répondre à des questions sur les propriétés, les caractéristiques, les fonctionnalités et d’autres aspects du péricartisme cardiaque qui aideront à définir leur contribution à l’homéostasie cardiaque et à l’hémodynamique. Ces cellules pourraient avoir un potentiel thérapeutique pour les maladies cardiovasculaires une fois que leur biologie est mieux comprise.
The authors have nothing to disclose.
Les auteurs tiens à remercier le noyau de cytométrie amgen Flow pour leur aide avec la conception de panneaux de fluorophore, le dépannage et le tri cellulaire.
0.25% Trypsin-EDTA | Corning | 25-053-Cl | dilute with 1x DPBS to get 0.1% |
100 μM Cell strainer | FisherSci | 22363549 | |
15 mL Falcon conical tubes | BD | 352096 | |
24-well plate | Corning | CLS3527 | |
25 gauge butterfly needle | FisherSci | 22-253-146 | |
31 gauge needle syringe | FisherSci | B328446 | |
50 mL Falcon conical tubes | BD | 352098 | |
6-well plate | Corning | CLS3516 | |
anti-alpha smooth muscle actin rabbit mAb | abcam | ab32575 | Antibody used in ICC 1:100 dilution |
anti-CD140b rabbit mAb | Cell Signaling | 28E1 | Antibody used in ICC 1:100 dilution |
anti-CD31 rabbit pAb | abcam | ab28364 | Antibody used in ICC 1:100 dilution |
anti-desmin rabbit pAb | abcam | ab8592 | Antibody used in ICC 1:100 dilution |
anti-NG2 conjugated to AF488 | Millipore | MAB5384A4 | Antibody used in ICC 1:100 dilution |
anti-vimentin rabbit mAb | abcam | ab92547 | Antibody used in ICC 1:100 dilution |
ArC Amine Reactive Compensation bead kit | Invitrogen | A10346 | compensation beads for Live/Dead Near IR dye |
Brightfield Microscope | camera attached | ||
CD140b-PE (clone APB5) | eBioscience | 12-1402-81 | Antibody used in FACS 1:100 dilution |
CD146-BV605 (clone ME-9F1) | BD | 740434 | Antibody used in FACS 1:100 dilution |
CD31-APC (clone MEC 13.3) | BD | 551262 | Antibody used in FACS 1:100 dilution |
CD34-BV421 (clone RAM 34) | BD | 56268 | Antibody used in FACS 1:100 dilution |
CD45-PE-Cy7 (clone 30-F11) | BD | 552848 | Antibody used in FACS 1:100 dilution |
Centrifuge | eppendorf | ||
Collagenase B | Roche | 11088815001 | 0.226 U/mg lyo. |
Confocal Microscope | |||
DAPI | ThermoFisher | D1306 | nuclear stain |
DMEM with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate | Corning | 10-013-CV | 500 mL |
Dowell scissors | FST | 15040-11 | |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Corning | 21-030-CV | 500 mL |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline without Ca and Mg (CMF-DPBS) | Corning | 21-031-CV | 500 mL |
Dumont #5 Fine Forceps | FST | 11254-20 | |
FACSAria cell sorter | BD | Lasers: 405 nm 50 mW, 488 nm 100 mW, 561 nm 50mW, 633 nm 11 mW | |
FACSAria software | BD | ||
Falcon tube round-bottom polypropylene, 5 mL | BD | 38057 | |
Falcon tube with cell strainer cap, 5 mL | BD | 08-771-23 | |
Fetal Bovine Serum | Corning | 35-015-CV | 500 mL |
Fine scissors | FST | 14060-09 | |
FlowJo software | FlowJo LLC | ||
Fortessa LSR flow cytometer | BD | Lasers: 405 nm 50 mW, 488 nm 100 mW, 561 nm 50mW, 633 nm 11 mW | |
Gelatin-based coating | Cell Biologics | 6950 | |
Goat anti-rabbit IgG (H+L) Cross-Absorbed Secondary antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11008 | Antibody used in ICC 1:1000 dilution |
Graefe Forceps | FST | 11049-10 | |
Heparin sodium solution | Hospira | NDC 0409-2720-02 | 10,000 USP units/10 mL; from porcine intestines |
Incubator | set at 37 °C, 5% CO2, 95% O2 | ||
Live/Dead-Near IR | Life Technologies | L10119 | |
Microscope slides | FisherSci | 12-550-343 | |
NG2-FITC | Millipore | AB5320A4 | Antibody used in FACS 1:100 dilution |
Oribital shaker | VWR | Inside 37 °C incubator or room | |
Paraformaldehyde | FisherSci | 50-980-487 | dilute with 1x DPBS to get 4% |
Penicillin-Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
Petri dish | FisherSci | FB0875714 | |
Pipette and tips | |||
ProLong Diamond | ThermoFisher | P36965 | mounting media |
Propidum Iodide | ThermoFisher | cell viability dye for supplemental figure 2 | |
Rabbit IgG FITC | eBiosciences | 11-4614-80 | Isotype control antibody – FITC |
Rat IgG2a APC | Biolegend | 400512 | Isotype control antibody – APC |
Rat IgG2a BV421 | Biolegend | 400536 | Isotype control antibody – BV421 |
Rat IgG2a BV605 | BD | 563144 | Isotype control antibody – BV605 |
Rat IgG2a PE | Biolegend | 400308 | Isotype control antibody – PE |
Rat IgG2b PE-Cy7 | Biolegend | 400617 | Isotype control antibody – PE-Cy7 |
SuperBlock | ThermoFisher | 37515 | blocking buffer |
T75 | ThermoFisher | 156499 | |
Triton X-100 | Sigma | X100 | detergent, dilute with x DPBS to get 0.1% |
UltraComp beads | Invitrogen | 01-2222-42 | compensation beads |
Variable-Flow Peristaltic Pump | FisherSci | 13-876-1 | |
ViCell Cell counter | Beckman | ||
Wash buffer | 1:10 dilution of Superblock in 1x DPBS |