Lentivirale gemedieerde gen-uitschakeling in humaan pseudo-eilandje bereid in lage bevestigings platen
Summary
Een protocol om gengemodificeerde menselijke pseudoislets te maken van verspreide menselijke eilandjes cellen die door lentivirus met korte haarspeld RNA (shRNA) worden weergegeven. Dit protocol maakt gebruik van direct beschikbare enzym-en kweekvaten, kan gemakkelijk worden uitgevoerd en produceert genetisch gemodificeerde humane pseudoislets die geschikt zijn voor functionele en morfologische studies.
Abstract
Er zijn verschillende genetische hulpmiddelen beschikbaar om genen in pancreas eilandjes van knaagdieren te moduleren om de functie van eilandje genen voor diabetesonderzoek te ontleden. De gegevens van knaagdieren zijn echter vaak niet volledig gereproduceerd in of toepasbaar op menselijke eilandjes als gevolg van bekende verschillen in de structuur van het eiland en de functie tussen de soorten. Momenteel zijn technieken die beschikbaar zijn voor het manipuleren van genexpressie van menselijke eilandjes zeer beperkt. De introductie van transgen in intacte eilandjes door adenovirus, plasmide en oligonucleotiden lijdt vaak onder lage efficiëntie en hoge toxiciteit. Laag rendement is vooral problematisch in gendownregulatie studies in intacte eilandjes, die een hoge efficiëntie vereisen. Het is bekend dat enzymatisch verspreide eilandjes cellen reaggregate in cultuurvormende sferoïden genaamd pseudoislets. Maat gecontroleerde reaggregation van menselijke eilandjes cellen creëert pseudoislets die dynamische eerste fase insulineafscheiding na langdurige cultuur te handhaven en bieden een venster om efficiënt te introduceren lentivirale korte haarspeld RNA (shRNA) met lage toxiciteit. Hier wordt een gedetailleerd protocol beschreven voor het maken van menselijke pseudoislets na lentivirale transductie met behulp van twee in de handel verkrijgbare multi well-platen. Het protocol kan gemakkelijk worden uitgevoerd en zorgt voor een efficiënte Downregulatie van genen en de beoordeling van de dynamiek van de insuline secretie met behulp van menselijke eilandje cellen. Zo bieden menselijke pseudoislets met lentivirale gemedieerde genmodulatie een krachtig en veelzijdig model om de genfunctie binnen menselijke eilandjes cellen te beoordelen.
Introduction
Het verlies van functionele bèta celmassa is de centrale pathologie voor zowel type 1 als type 2 diabetes1. Terwijl beta-cellen zijn de producenten van insuline in alvleesklier eilandjes, communicatie tussen bètacellen en niet-bètacellen speelt een cruciale rol in de regulering van insuline secretie2. Bovendien, disregulatie van glucagonsecretie draagt bij aan hyperglycemie bij diabetes3. Er is dus sterke belangstelling om genexpressie van cellen binnen pancreas eilandjes te moduleren om het mechanisme achter de ontwikkeling van een eilandje dysfunctie bij diabetes aan te pakken. Een verscheidenheid aan benaderingen, waaronder transgene muizen, zijn beschikbaar om genexpressie van muis eilandjes te moduleren. Echter, menselijke en muis eilandjes vertonen verschillende innervatie, celverdeling, ratio van bèta aan Alfa cellen, en reactie op secretagogues4. Daarom is directe beoordeling van de genfunctie in menselijke eilandjes uitermate belangrijk voor het begrijpen van de pathofysiologie van de menselijke pancreas eilandjes.
Adenovirale vector is de meest gebruikte virale vector om pancreas eilandjes in vitro te leiden door de hoge efficiëntie van transductie in niet-scheidings cellen. Echter, adenovirus dringt niet naar de kern van de eilandjes efficiënt, vooral bij menselijke eilandjes5, en is cytotoxisch bij hoge doses6. Relatief is lentivirale vector minder cytotoxisch en levert het exogene genen permanent in het chromosoom van post-mitotische cellen, waardoor het een algemeen getest voertuig is voor gentherapie7. Het vermogen van het lentivirus om de kern van intacte menselijke eilandjes binnen te dringen is echter ook beperkt, waardoor gedeeltelijke dispersie door enzymatische spijsvertering nodig is om de transductie-efficiëntie8te verhogen. Het voorbehoud met de dispersie van intact menselijke eilandjes is de onderbreking van cel-cel en cel-matrix communicatie, die de dynamische regulering van insuline secretie kritisch voor het onderhoud van glucose homeostase bij de mens9compromitteert. Het is dus een uitdaging geweest om de impact van genmodulatie op de dynamische regulering van de eilandje-functie in een model van menselijke eilandjes te beoordelen.
Het is bekend dat verspreide eilandjes cellen van menselijke en knaagdieren autonoom reaggregate in eilandachtige structuren genaamd “pseudoislets”. Pseudoislets tonen bèta-en niet-bèta-celverdeling vergelijkbaar met inheemse eilandjes10,11. Bovendien, na lange termijn cultuur, inheemse eilandjes geleidelijk verliezen robuuste eerste fase insuline secretie5,10,11,12. Toch toonden pseudo-eilandjes een beter behoud van de eerste fase insuline secretie in reactie op glucose in vergelijking met inheemse eilandjes na dezelfde cultuur periode5. Naast het hebben van een beter behoud van insuline secretie, maat gecontroleerde reaggregation van menselijke eilandje cellen in lage bijlage platen11 biedt een venster van de mogelijkheid om lentivirus vectoren voorafgaand aan hun reaggregation in te voeren pseudo-eilandjes. Verschillende studies hebben aangetoond dat het nut van pseudoislets gecombineerd met lentivirale gemedieerde transductie. Caton et al.13 meldde dat de introductie van het groene fluorescerende eiwit (GFP) dat lentivirus uitdrukt, weinig effect had op de insuline secretie, terwijl het een homogene expressie van GFP in rat pseudoislets in vergelijking met niet-geïnfecteerde controle had bereikt. Ze toonden ook het specifieke effect van verschillende connexinen op de insuline secretie door het overdrukken van connexinen 32, 36 en 43 via lentivirus13. Menselijke pseudo-eilandjes bereid met een in de handel verkrijgbare 96-well Ultra-Low-bevestigingsplaat toonden aan dat lentivirale gemedieerde overexpressie van transcriptiefactor SIX3 de insuline secretie verbetert die wordt beoordeeld door een statische incubatie14. Onlangs, menselijke pseudoislets bereid met een 96-goed ultra-lage bevestigingsplaat werden gebruikt om te downreguleren glucokinase via lentivirale korte haarspeld RNA (shRNA) als een bewijs van principe om te laten zien dat glucose-gestimuleerd insuline secretie wordt verlaagd, terwijl KCl-gestimuleerd insuline secretie werd bewaard5. De studie toonde ook aan dat menselijke pseudoislets vergelijkbaar zijn met inheemse eilandjes in genexpressie en secretoire profielen, waardoor het nut van menselijke pseudoislets om de regulering van de eilandje functie5te ontleden, verder wordt ondersteund. Hoewel de perifusie niet werd uitgevoerd, werd een biotechnologische micro well cultuur plaat die recentelijk commercieel beschikbaar werd, ook gerapporteerd als verenigbaar voor linvirale transductie en produceerde menselijke pseudoislets die uitstekende insuline vertoonden uitscheiding in vitro en in vivo na transplantatie11. Collectief, menselijke pseudo-eiland vorming gecombineerd met lentivirale transductie is een eenvoudige en efficiënte benadering om de pathofysiologie van het menselijk eilandje te onderzoeken, wat een waardevol hulpmiddel is om mechanistische studies in menselijke eilandjes uit te voeren.
In het huidige rapport wordt een protocol opgesteld om menselijke pseudoislets te vormen, met lentivirus met behulp van twee in de handel verkrijgbare platformen, een 96-well Ultra-Low-bevestigingsplaat en een micro well-kweek plaat. Beide bereiken een efficiënte modulatie van genexpressie en creëren menselijke pseudoislets die verenigbaar zijn voor downstreambeoordelingen, waaronder statische incubatie en perifusie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier, een gedetailleerd protocol voor het genereren van menselijke pseudoislets die door lentivirus worden getransduceerd met behulp van een 96-goed ultra-lage bevestigingsplaat of een micro well cultuur plaat wordt gepresenteerd. Pseudoislets zijn gemeld om morfologie en secretoire functies te demonstreren die vergelijkbaar zijn met inheemse menselijke eilandjes en kunnen worden gekweekt voor langere tijd in vitro5,11,18. In te…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd financieel gesteund door National Institutes of Health to Y.I. (R01-DK090490) en American Diabetes Association Y.I. (1-17-IBS-132). J.A. en Y.I. worden ondersteund door de broederlijke orde van het Eagles Diabetes Research Center. A.B. wordt gesteund door een National Institutes of Health Training Grant (T32NS45549). Auteurs gebruikten menselijke pancreas eilandjes geboden door het door NIDDK gefinancierde geïntegreerde Islet-distributieprogramma (IIDP) in City of Hope (2UC4DK098085).
Materials
| Anti-adherence rinsing solution | Stemcell technologies | 7919 | |
| Biological safety cabinet | Thermo Scientific | 1300 Series Type A2 | |
| cell strainer, 40 micrometer | Corning | 431750 | |
| CMRL-1066 | ThermoFisher | 11530037 | |
| CO2 incubator | Thermo Scientific | Heracell VIOS 160i | |
| conical centrifuge tube, 15 mL | VWR | 89039-666 | |
| conical centrifuge tube, 50 mL | VWR | 89039-658 | |
| fetal bovine serum | ThermoFisher | 26140079 | |
| guanidinium thiocyanate RNA extraction reagent | ThermoFisher | 15596026 | Trizol |
| glutamine | ThermoFisher | 25030164 | |
| Hemocytometer | Marien Feld | Neubauer-Improved Bright line | |
| Human serum albumin | Sigma | A1653 | |
| inverted microscope | Fisher brand | 11-350-119 | |
| microcentrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 20 | |
| microcentrifuge tube, 1.5 mL | USA Scientific | 1615-5500 | |
| microwell culture plate | Stemcell technologies | 34411 | Aggrewell 400, 24 well |
| motor-driven pestle | GAMUT | #399X644 | |
| non-tissue culture treated dish, 10 cm | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| PBS | ThermoFisher | 14190250 | |
| Penicillin-streptomycin | ThermoFisher | 10378016 | |
| Petri dish, 35 mm | Celltreat | 229638 | |
| pipette, 5 mL | DOT Scientific, | 667205B | |
| pipette, 8-channel | VWR | #613-5253 | |
| pipette, 10 mL | VWR | 667210B | |
| pipette, P10 | Denville | UEZ-P-10 | |
| pipette, P200 | Denville | UEZ-P-200 | |
| pipette, P1000 | Denville | UEZ-P-1000 | |
| proteolytic and collagenolytic enzyme mixture | Sigma | A6965 | Accutase |
| reagent reservoir, 50 mL | VWR | 89094-680 | |
| reversible strainer, 37 micrometer | Stemcell technologies | 27251 | |
| swing bucket plate centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-14R | |
| swing bucket rotor | Beckman Coulter | SX4750A | |
| tuberculin syringe, 1 mL | BD | 309659 | |
| ultra low attachment microplate, 96 well | Corning | 4515 |
References
- Chen, C., Cohrs, C. M., Stertmann, J., Bozsak, R., Speier, S. Human beta cell mass and function in diabetes: Recent advances in knowledge and technologies to understand disease pathogenesis. Molecular Metabolism. 6 (9), 943-957 (2017).
- Hong, H., Jo, J., Sin, S. J. Stable and flexible system for glucose homeostasis. Physiological Review E covering statistical, nonlinear, biological, and soft matter physic. 88 (3), 032711 (2013).
- Cryer, P. E. Minireview: Glucagon in the pathogenesis of hypoglycemia and hyperglycemia in diabetes. Endocrinology. 153 (3), 1039-1048 (2012).
- Arrojo e Drigo, R., et al. New insights into the architecture of the islet of Langerhans: a focused cross-species assessment. Diabetologia. 58 (10), 2218-2228 (2015).
- Harata, M., et al. Delivery of shRNA via lentivirus in human pseudoislets provides a model to test dynamic regulation of insulin secretion and gene function in human islets. Physiological Reports. 6 (20), e13907 (2018).
- Barbu, A. R., Akusjarvi, G., Welsh, N. Adenoviral-mediated transduction of human pancreatic islets: importance of adenoviral genome for cell viability and association with a deficient antiviral response. Endocrinology. 146 (5), 2406-2414 (2005).
- Hughes, A., et al. Gene therapy to improve pancreatic islet transplantation for Type 1 diabetes mellitus. Current Diabetes Reviews. 6 (5), 274-284 (2010).
- Jimenez-Moreno, C. M., et al. A Simple High Efficiency Intra-Islet Transduction Protocol Using Lentiviral Vectors. Current Gene Therapy. 15 (4), 436-446 (2015).
- Bonora, E., et al. Prevalence and correlates of post-prandial hyperglycaemia in a large sample of patients with type 2 diabetes mellitus. Diabetologia. 49 (5), 846-854 (2006).
- Halban, P. A., Powers, S. L., George, K. L., Bonner-Weir, S. Spontaneous reassociation of dispersed adult rat pancreatic islet cells into aggregates with three-dimensional architecture typical of native islets. Diabetes. 36 (7), 783-790 (1987).
- Yu, Y., et al. Bioengineered human pseudoislets form efficiently from donated tissue, compare favourably with native islets in vitro and restore normoglycaemia in mice. Diabetologia. 61 (9), 2016-2029 (2018).
- Zuellig, R. A., et al. Improved physiological properties of gravity-enforced reassembled rat and human pancreatic pseudo-islets. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11 (1), 109-120 (2017).
- Caton, D., et al. Lentivirus-mediated transduction of connexin cDNAs shows level- and isoform-specific alterations in insulin secretion of primary pancreatic beta-cells. Journal of Cell Science. 116 (Pt 11), 2285-2294 (2003).
- Arda, H. E., et al. Age-Dependent Pancreatic Gene Regulation Reveals Mechanisms Governing Human beta Cell Function. Cell Metabolism. 23 (5), 909-920 (2016).
- Peiris, H., et al. Discovering human diabetes-risk gene function with genetics and physiological assays. Nature Communications. 9 (1), 3855 (2018).
- Schlimgen, R., et al. Risks Associated With Lentiviral Vector Exposures and Prevention Strategies. Journal of Occupational and Environmental Medicine. 58 (12), 1159-1166 (2016).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Li, N., et al. Engineering islet for improved performance by optimized reaggregation in alginate gel beads. Biotechnology and Applied Biochemistry. 64 (3), 400-405 (2017).
- Ramachandran, K., Peng, X., Bokvist, K., Stehno-Bittel, L. Assessment of re-aggregated human pancreatic islets for secondary drug screening. British Journal of Pharmacology. 171 (12), 3010-3022 (2014).
- Hilderink, J., et al. Controlled aggregation of primary human pancreatic islet cells leads to glucose-responsive pseudoislets comparable to native islets. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 19 (8), 1836-1846 (2015).
- Saunders, D. C., et al. Ectonucleoside Triphosphate Diphosphohydrolase-3 Antibody Targets Adult Human Pancreatic beta Cells for In Vitro and In Vivo Analysis. Cell Metabolism. (18), (2018).
- Reissaus, C. A., Piston, D. W. Reestablishment of Glucose Inhibition of Glucagon Secretion in Small Pseudoislets. Diabetes. 66 (4), 960-969 (2017).
