Lentiviral medierad gen ljuddämpning i humant Pseudoholmen beredd i låga fästplattor
Summary
Ett protokoll för att skapa genmodifierade mänskliga pseudoöar från spridda mänskliga öar celler som är sensorik av lentivirus redovisade kort hårnål RNA (shRNA) presenteras. Detta protokoll utnyttjar lättillgängliga enzym-och kultur fartyg, kan utföras enkelt och producerar genetiskt modifierade pseudoöar som lämpar sig för funktionella och morfologiska studier.
Abstract
Olika genetiska verktyg finns tillgängliga för att modulera gener i bukspottskörteln öar av gnagare att dissekera funktion av Holmen gener för diabetesforskning. De uppgifter som erhållits från gnagare är dock ofta inte helt återgivna i eller tillämpliga på mänskliga öar på grund av välkända skillnader i holme struktur och funktion mellan arterna. För närvarande är tekniker som är tillgängliga för att manipulera genuttryck för mänskliga öar mycket begränsade. Införandet av transgenens i intakt öar av adenovirus, plasmid, och oligonukleotides lider ofta av låg verkningsgrad och hög toxicitet. Låg verkningsgrad är särskilt problematiskt i gen nedreglering studier i intakt öar, som kräver hög verkningsgrad. Det har varit känt att enzymatiskt spridda ö-celler reaggregera i kulturen bildar spheroids kallas pseudoislets. Storlekskontroll reaggregation av mänskliga ö-celler skapar pseudoöar som upprätthåller dynamiska första fasen insulinsekretion efter långvarig kultur och ge ett fönster för att effektivt införa lentiviral kort hårnål RNA (shRNA) med låg toxicitet. Här beskrivs ett detaljerat protokoll för skapandet av mänskliga pseudoöar efter lentiviral signaltransduktion med hjälp av två kommersiellt tillgängliga multispot-plattor. Protokollet kan enkelt utföras och möjliggör effektiv nedreglering av gener och bedömning av dynamiken i insulinsekretionen med hjälp av mänskliga ö-celler. Sålunda, mänskliga pseudoöar med lentiviral medierad gen modulering ger en kraftfull och mångsidig modell för att bedöma genfunktion inom mänskliga ö-celler.
Introduction
Förlusten av funktionell beta cellmassa är den centrala patologi för både typ 1 och typ 2 diabetes1. Medan betaceller är producenter av insulin i bukspottskörteln öar, kommunikation mellan betaceller och icke-betaceller spelar en avgörande roll i regleringen av insulinsekretion2. Dessutom bidrar dysreglering av glukagon sekretion till hyperglykemi i diabetes3. Således, det finns ett starkt intresse att modulera genuttryck av celler i bukspottskörteln öar att ta itu med mekanismen bakom utvecklingen av Holmen dysfunktion i diabetes. En mängd olika metoder, inklusive transgena möss, finns tillgängliga för att modulera genuttryck av mus öar. Men, mänskliga och mus öar visar distinkt innervation, cell distribution, förhållandet mellan beta till alfaceller, och svar på sekretagogues4. Därför är direktbedömning av genfunktion i humana öar oerhört viktigt för att förstå patofysiologin hos mänskliga pankreasöar.
Adenoviral vektor är den mest använda viral vektor för att transduce pankreasöar in vitro på grund av den höga verkningsgraden av transduktion i icke-skiljande celler. Adenovirus tränger dock inte in i kärnan av kobbar effektivt, särskilt i humana öar5, och är cytotoxiskt vid höga doser6. Jämförelsevis, lentiviral vektor är mindre cytotoxiska och levererar exogena gener permanent in i kromosomen av post-mitotiska celler, vilket gör det ett allmänt testat fordon för genterapi7. Emellertid, förmågan hos lentivirus att tränga in i kärnan av intakt mänskliga öar är också begränsad, vilket kräver partiell dispersion av enzymatisk matsmältning för att öka transduktionseffektivitet8. Förbehållet med spridningen av intakt mänskliga öar är avbrottet i cell-cell och cell-matris kommunikation, som äventyrar den dynamiska regleringen av insulinsekretion kritisk för upprätthållandet av glukos homeostas i människor9. Det har således varit en utmaning att bedöma gen moduleringens inverkan på den dynamiska regleringen av Holmen-funktionen i en modell av mänskliga öar.
Det har varit känt att spridda ö-celler från mänskliga och gnagare öar självständigt reaggregera till Holmen-liknande strukturer som kallas “pseudoislets”. Pseudoislets Visa beta och icke-beta cell distribution liknar inhemska öar10,11. Dessutom, efter långsiktig kultur, inhemska holmar förlorar successivt robust första fasen insulinsekretion5,10,11,12. Ändå visade pseudoöar bättre bevarande av första fasen insulinsekretion som svar på glukos jämfört med inhemska öar efter samma kultur period5. Förutom att ha bättre bevarande av insulinsekretion, storleks-kontrollerad reaggregation av mänskliga ö-celler i låga tillbehör tallrikar11 ger ett fönster av möjlighet att införa lentivirus vektorer innan deras reaggregation i pseudoislets. Flera studier har visat nyttan av pseudoislets kombinerat med lentiviral medierad transduktion. Caton et al.13 rapporterade att införandet av den gröna fluorescerande protein (GFP) uttrycker lentivirus hade liten effekt på insulinsekretion samtidigt uppnå homogena uttryck av GFP i råtta pseudoöar jämfört med icke-infekterad kontroll. De visade också den specifika effekten av olika connexins på insulinsekretion genom att överuttrycka connexins 32, 36, och 43 via lentivirus13. Mänskliga pseudoöar beredd med en kommersiellt tillgänglig 96-väl ultra-låg fästplatta visade att lentiviral-medierad överuttryck av transkriptionsfaktorn SIX3 förbättrar insulinsekretion bedömas genom statisk inkubation14. Nyligen, mänskliga pseudoislets utarbetats med en 96-väl ultra-låg fästplatta användes för att downreglera glukokinas via lentiviral kort hårnål RNA (shRNA) som ett bevis på princip för att visa att glukossänkande insulinsekretion reduceras, medan KCl-stimulerad insulinsekretion bevarades5. Studien visade också att mänskliga pseudoöar liknar inhemska öar i genuttryck och sekretoriska profiler, ytterligare stödja nyttan av mänskliga pseudoöar att dissekera regleringen av Islet funktion5. Även om perifusion inte utfördes, en bioengineered mikrobrunn kultur tallrik som nyligen blev kommersiellt tillgängliga, rapporterades också vara förenligt för lentiviral transduktion och producerade mänskliga pseudoöar som uppvisade utmärkt insulin sekretion in vitro och in vivo efter transplantation11. Kollektivt, mänskliga pseudoholmen formation kombinerat med lentiviral transduktion är en enkel och effektiv metod för att undersöka mänsklig holme patofysiologi, vilket ger ett värdefullt verktyg för att utföra mekanistiska studier i mänskliga öar.
I den aktuella rapporten, ett protokoll för att bilda mänskliga pseudoislets sensorik med lentivirus med två kommersiellt tillgängliga plattformar, en 96-väl ultra-låg fästplatta och en mikrobrunn kultur tallrik presenteras. Både uppnå effektiv modulering av genuttryck och skapa mänskliga pseudoöar som är kompatibla för nedströms bedömningar inklusive statisk inkubation och perifusion.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här, ett detaljerat protokoll för att generera mänskliga pseudoöar som är sensorik av lentivirus med hjälp av en 96-väl ultra-låg fästplatta eller en mikrobrunn kultur tallrik presenteras. Pseudoöar har rapporterats Visa morfologi och sekretoriska funktioner som liknar infödda mänskliga öar och kan odlas för långvarig tid in vitro-5,11,18. Till skillnad från infödda mänskliga öar som uppvisar en stor variation…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes ekonomiskt av National Institutes of Health till Y.I. (R01-DK090490) och American Diabetes Association till Y.I. (1-17-IBS-132). J.A. och Y.I. stöds av den broderliga Order of Eagles diabetes Research Center. A.B. stöds av ett nationellt institut för hälsoutbildning Grant (T32NS45549). Författarna utnyttjas mänskliga pankreasöar som tillhandahålls av NIDDK-finansierade integrerade Holmen distribution program (IIDP) vid City of Hope (2UC4DK098085).
Materials
| Anti-adherence rinsing solution | Stemcell technologies | 7919 | |
| Biological safety cabinet | Thermo Scientific | 1300 Series Type A2 | |
| cell strainer, 40 micrometer | Corning | 431750 | |
| CMRL-1066 | ThermoFisher | 11530037 | |
| CO2 incubator | Thermo Scientific | Heracell VIOS 160i | |
| conical centrifuge tube, 15 mL | VWR | 89039-666 | |
| conical centrifuge tube, 50 mL | VWR | 89039-658 | |
| fetal bovine serum | ThermoFisher | 26140079 | |
| guanidinium thiocyanate RNA extraction reagent | ThermoFisher | 15596026 | Trizol |
| glutamine | ThermoFisher | 25030164 | |
| Hemocytometer | Marien Feld | Neubauer-Improved Bright line | |
| Human serum albumin | Sigma | A1653 | |
| inverted microscope | Fisher brand | 11-350-119 | |
| microcentrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 20 | |
| microcentrifuge tube, 1.5 mL | USA Scientific | 1615-5500 | |
| microwell culture plate | Stemcell technologies | 34411 | Aggrewell 400, 24 well |
| motor-driven pestle | GAMUT | #399X644 | |
| non-tissue culture treated dish, 10 cm | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| PBS | ThermoFisher | 14190250 | |
| Penicillin-streptomycin | ThermoFisher | 10378016 | |
| Petri dish, 35 mm | Celltreat | 229638 | |
| pipette, 5 mL | DOT Scientific, | 667205B | |
| pipette, 8-channel | VWR | #613-5253 | |
| pipette, 10 mL | VWR | 667210B | |
| pipette, P10 | Denville | UEZ-P-10 | |
| pipette, P200 | Denville | UEZ-P-200 | |
| pipette, P1000 | Denville | UEZ-P-1000 | |
| proteolytic and collagenolytic enzyme mixture | Sigma | A6965 | Accutase |
| reagent reservoir, 50 mL | VWR | 89094-680 | |
| reversible strainer, 37 micrometer | Stemcell technologies | 27251 | |
| swing bucket plate centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-14R | |
| swing bucket rotor | Beckman Coulter | SX4750A | |
| tuberculin syringe, 1 mL | BD | 309659 | |
| ultra low attachment microplate, 96 well | Corning | 4515 |
References
- Chen, C., Cohrs, C. M., Stertmann, J., Bozsak, R., Speier, S. Human beta cell mass and function in diabetes: Recent advances in knowledge and technologies to understand disease pathogenesis. Molecular Metabolism. 6 (9), 943-957 (2017).
- Hong, H., Jo, J., Sin, S. J. Stable and flexible system for glucose homeostasis. Physiological Review E covering statistical, nonlinear, biological, and soft matter physic. 88 (3), 032711 (2013).
- Cryer, P. E. Minireview: Glucagon in the pathogenesis of hypoglycemia and hyperglycemia in diabetes. Endocrinology. 153 (3), 1039-1048 (2012).
- Arrojo e Drigo, R., et al. New insights into the architecture of the islet of Langerhans: a focused cross-species assessment. Diabetologia. 58 (10), 2218-2228 (2015).
- Harata, M., et al. Delivery of shRNA via lentivirus in human pseudoislets provides a model to test dynamic regulation of insulin secretion and gene function in human islets. Physiological Reports. 6 (20), e13907 (2018).
- Barbu, A. R., Akusjarvi, G., Welsh, N. Adenoviral-mediated transduction of human pancreatic islets: importance of adenoviral genome for cell viability and association with a deficient antiviral response. Endocrinology. 146 (5), 2406-2414 (2005).
- Hughes, A., et al. Gene therapy to improve pancreatic islet transplantation for Type 1 diabetes mellitus. Current Diabetes Reviews. 6 (5), 274-284 (2010).
- Jimenez-Moreno, C. M., et al. A Simple High Efficiency Intra-Islet Transduction Protocol Using Lentiviral Vectors. Current Gene Therapy. 15 (4), 436-446 (2015).
- Bonora, E., et al. Prevalence and correlates of post-prandial hyperglycaemia in a large sample of patients with type 2 diabetes mellitus. Diabetologia. 49 (5), 846-854 (2006).
- Halban, P. A., Powers, S. L., George, K. L., Bonner-Weir, S. Spontaneous reassociation of dispersed adult rat pancreatic islet cells into aggregates with three-dimensional architecture typical of native islets. Diabetes. 36 (7), 783-790 (1987).
- Yu, Y., et al. Bioengineered human pseudoislets form efficiently from donated tissue, compare favourably with native islets in vitro and restore normoglycaemia in mice. Diabetologia. 61 (9), 2016-2029 (2018).
- Zuellig, R. A., et al. Improved physiological properties of gravity-enforced reassembled rat and human pancreatic pseudo-islets. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11 (1), 109-120 (2017).
- Caton, D., et al. Lentivirus-mediated transduction of connexin cDNAs shows level- and isoform-specific alterations in insulin secretion of primary pancreatic beta-cells. Journal of Cell Science. 116 (Pt 11), 2285-2294 (2003).
- Arda, H. E., et al. Age-Dependent Pancreatic Gene Regulation Reveals Mechanisms Governing Human beta Cell Function. Cell Metabolism. 23 (5), 909-920 (2016).
- Peiris, H., et al. Discovering human diabetes-risk gene function with genetics and physiological assays. Nature Communications. 9 (1), 3855 (2018).
- Schlimgen, R., et al. Risks Associated With Lentiviral Vector Exposures and Prevention Strategies. Journal of Occupational and Environmental Medicine. 58 (12), 1159-1166 (2016).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Li, N., et al. Engineering islet for improved performance by optimized reaggregation in alginate gel beads. Biotechnology and Applied Biochemistry. 64 (3), 400-405 (2017).
- Ramachandran, K., Peng, X., Bokvist, K., Stehno-Bittel, L. Assessment of re-aggregated human pancreatic islets for secondary drug screening. British Journal of Pharmacology. 171 (12), 3010-3022 (2014).
- Hilderink, J., et al. Controlled aggregation of primary human pancreatic islet cells leads to glucose-responsive pseudoislets comparable to native islets. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 19 (8), 1836-1846 (2015).
- Saunders, D. C., et al. Ectonucleoside Triphosphate Diphosphohydrolase-3 Antibody Targets Adult Human Pancreatic beta Cells for In Vitro and In Vivo Analysis. Cell Metabolism. (18), (2018).
- Reissaus, C. A., Piston, D. W. Reestablishment of Glucose Inhibition of Glucagon Secretion in Small Pseudoislets. Diabetes. 66 (4), 960-969 (2017).
