Summary

Изоляция, Культура, Характеристика и Дифференциация клеток-прародителей мышц человека от процедуры биопсии скелетных мышц

Published: August 23, 2019
doi:

Summary

Мы представляем методы изоляции, культивирования, характеристики и дифференциации клеток-прародителей мышц человека (HMPCs), полученных из скелетной мышечной биопсии ткани. hMPCs, полученные и характеризуемые с помощью этих методов, могут быть использованы для последующего решения вопросов, связанных с исследованиями, связанными с миогенезом человека и регенерацией скелетных мышц.

Abstract

Использование первичных тканей и клеток человека идеально подходит для исследования биологических и физиологических процессов, таких как регенеративный процесс скелетных мышц. Существуют признанные проблемы для работы с человеческими первичными взрослыми стволовыми клетками, особенно клетками-потомками человеческих мышц (HMPCs), полученными в результате биопсии скелетных мышц, включая низкую урожайность клеток из собранной ткани и большую степень неоднородности донора параметров роста и смертности между культурами. Хотя включение неоднородности в экспериментальную конструкцию требует большего размера выборки для обнаружения значительных эффектов, это также позволяет нам определить механизмы, которые лежат в основе изменчивости потенциала расширения HMPC, и, таким образом, позволяет нам лучше понять неоднородность в регенерации скелетных мышц. Новые механизмы, которые отличают расширение способности культур имеют потенциал, чтобы привести к развитию терапии для улучшения регенерации скелетных мышц.

Introduction

Скелетная мышца является крупнейшей органной системой в организме человека, накоторую приходится 30–40% массы всего тела 1. В дополнение к своей хорошо признанной роли в передвижении, скелетные мышцы поддерживает температуру тела и осанку, и играет центральную роль во всем теле питательных гомеостаза. Исследования с участием человеческих участников, животных и моделей клеточной культуры являются ценными для решения вопросов, касающихся биологии скелетных мышц и регенерации. Изоляция и культура клеток-прародителей мышц человека (HMPCs) обеспечивает надежную модель, которая позволяет использовать методы клеточной культуры и манипуляции в образцах человека. Преимущество использования HMPCs является то, что они сохраняют генетический и метаболический фенотип от каждого донора2,3. Поддержание донорского фенотипа позволяет исследователям исследовать межиндивидуальные различия в миогенном процессе. Например, мы использовали наш метод характеристикhMPC для выявления возрастных и половыхразличий в емкости расширения популяции hMPC 4.

Цель юма этого протокола состоит в том, чтобы подробно методы изолировать, культуры, охарактеризовать и дифференцировать HMPCs от скелетной мышечной биопсии ткани. Опираясь на предыдущую работу, которая описала HMPCs и определилпотенциальных создателей поверхности клеток для изоляции hMPC5,6, этот протокол заполняет критический пробел в знаниях, связывая изоляцию с характеристикой HMPCs. Кроме того, подробные пошаговые инструкции, включенные в этот протокол, делают изоляцию и характеристики hMPC доступными для широкой научной аудитории, в том числе с ограниченным опытом работы с ГМпС. Наш протокол является одним из первых, чтобы описать использование цитометра изображений для отслеживания популяций клеток. Недавно разработанные цитометры визуализации являются самыми современными, высокопроизводительными и микроплитными, что позволяет в течение нескольких минут анализировать живые клетки, подсчет клеток и многоканальный анализ флуоресценции всех клеток в каждой скважине сосуда культуры. Эта система позволяет быстро количественно измерять динамические изменения в пролинизации и жизнеспособности всей популяции клеток с минимальным нарушением культуры. Например, мы можем выполнять объективные показатели слияния в последующие дни в пробирке, чтобы определить кинетику роста каждой культуры, полученной от различных доноров. Многие протоколы в литературе, особенно те, с участием дифференциации ПДК, требуют клетки для достижения определенного уровня слияния до начала дифференциации или лечения7. Наш метод позволяет объективно определить слияние каждой скважины в сосуде культуры, что позволяет исследователям инициировать лечение беспристрастным, несубъективным образом.

В прошлом основным ограничением использования первичных ГМпС были низкие урожаи, ограничивающие количество клеток, доступных для экспериментов. Мы и другие показали, что выход ПДК из ткани биопсии скелетных мышц составляет 1–15 ПДК на миллиграмм ткани(рисунок 1)8. Поскольку наш протокол позволяет четыре прохода клеток до очистки с флуоресценцией активированной сортировки клеток (FACS), наши криоконсервированные урожаи hMPC, полученные из небольших количеств биопсии ткани (50-100 мг), достаточно для решения исследовательских целей, где требуется несколько экспериментов. Наш протокол FACS производит 80% чистой (Pax7 положительный) MPC населения, таким образом, наш протокол оптимизирован как для урожайности и чистоты.

Protocol

Этот протокол был одобрен Институциональным наблюдательным советом Корнельского университета. Все участники были проверены на основные состояния здоровья и дали информированное согласие. 1. Получение мышечной ткани человека через биопсию скелетных мышц Определи…

Representative Results

Представитель потока цитометрии результаты hMPC изоляции от мышечной ткани человека можно рассматривать на рисунке 1. hMPCs могут быть определены путем первого gating событий, основанных на боковой рассеяния и вперед рассеяния для устранения мертвых клеток ?…

Discussion

Первичные HMPCs являются важной исследовательской моделью, используемой для понимания биологии скелетных мышц и регенеративного процесса. Кроме того, HMPCs имеют потенциал для использования для терапии. Тем не менее, Есть признанные проблемы в использовании первичных HMPCs для исследований …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы благодарят Корнельский университет, биотехнологический ресурсный центр Imaging Facility за помощь в флуоресценции активированной сортировки клеток. Мы также благодарим Молли Геллер за помощь в наборе участников и Эрику Бендер за проведение биопсии скелетных мышц. Наконец, мы благодарим участников за их время и участие в исследовании. Эта работа была поддержана Национальным институтом по проблемам старения Национальных институтов здравоохранения под премией Номер R01AG058630 (до B.D.C. и A.E.T.), Фондом Гленн для медицинских исследований и Американской федерацией старения научно-исследовательского гранта для младших факультетов (до B . округ Колумбия), а также Президентским советом по корнелльским женщинам (в А.Э.Т.).

Materials

0.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA Corning 25-053-Cl Trypsin used for removing adherent hMPCs from cell culture vessels
10 cm cell culture plate VWR 664160 Plates used for culturing hMPCs
15 mL Falcon tube Falcon 352196 15 mL conical tubes used throughout the hMPC isolation and culturing protocols
24 well cell culture plate Grenier Bio-One 662 160 Plates used for culturing hMPCs
7-AAD Viability Staining Solution eBioscience 00-6993-50 Viability stain for identifying living cells during FACS sorting
Alexa Fluor 488 anti-human CD29, Clone: TS2/16 BioLegend 303016 Conjugated antibody for FACS 
Black 96-well cell culture plate Grenier Bio-One 655079 96-well cell culture plate ideal for fluorescent imaging using the Celigo S
Celigo S Nexcelcom Bioscience Imaging cytometer used to track hMPC cultures
Cell Strainer VWR 352350 Cell strainer to eliminate large pieces of debris during muscle biopsy processing
Collagen Type I (Rat Tail) Corning 354236 Collagen for coating cell culture plates 
Collagenase D Roche 11 088 882 001 Used for degradation of collagen and other connective tissue in the skeletal muscle biopsy tissue
Dimethyl Sulfoxide VWR WN182 Used for cryopreservation of hMPCs
Dispase II Sigma Life Sciences D4693 A protease used for enzymatic digestion of skeletal muscle biopsy tissue
Dulbecco's Modified Eagle Medium Low Glucose powder Gibco 31600-034 Low glucose DMEM for muscle biopsy processing
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Gibco 21600-010 PBS for muscle biopsy processing
EDTA Disodium Salt Dihydrate J.T. Baker 4040-01  Required for FACS buffer
Fetal Bovine Serum VWR 89510-186  Fetal bovine serum used for hMPC growth media
Ham's F12 Gibco 21700-026 Base media for hMPCs
Heat Inactivated Equine Serum Gibco 26-050-070 Horse serum used to make hMPC differentiation media
Hemocytometer iNCyto DHC-N0105 Used to count cells
Hibernate A Gibco A1247501 Media for preserving skeletal muscle biopsy tissue
Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate Life Technologies H21492 DNA stain for identifying all cells using the Celigo S
Isopropanol Fisher Scientific A416P-4 Used for controlled rate freezing of hMPCs
Moxi buffer Orflo MXA006 Buffer for automated cell counter
Moxi Cassettes Orflo MXC002 Cassesttes for automated cell counter
Moxi z Mini Automated Cell Counter Orflo Automated cell counter
Mr. Frosty Freezing Container Thermo Fisher Scientific 5100-0001 Commerically available controlled rate cell freezing container
Normal Goat Serum (10%) Thermo Fisher Scientific 50062Z Goat serum used in FACS buffer
PE-Cy7 Mouse Anti-human CD56 , Clone: B159 BD Pharmingen 557747 Conjugated antibody for FACS 
Penicillin/Streptomycin 100X Solution Corning 30-002-CI Antibiotics added to culture media
Propidium iodide Thermo Fisher Scientific P3566 DNA stain for identifying dead cells using the Celigo S
Recombinant Human basic fibroblast growth factor Promega G5071 Supplement in hMPC growth media to prevent spontaneous differentiation
Recovery Cell Culture Freezing Medium  Gibco 12648-010 Media used to cryoperseve muscle biopsy slurries
Sodium Bicarbonate Fisher Scientific S233-3 Added to Ham's F12
Sterile Round Bottom 5 mL tubes VWR 60818-565 Tubes used for FACS
UltraComp eBeads eBioscience 01-2222-42 Compensation beads fort calibrating flow FACS settings

References

  1. Janssen, I., Heymsfield, S. B., Wang, Z., Ross, R. Skeletal muscle mass and distribution in 468 men and women aged 18-88 yr. Journal of Applied Physiology. 89 (1), 81-88 (2000).
  2. D’Souza, D. M., et al. Decreased satellite cell number and function in humans and mice with type 1 diabetes is the result of altered notch signaling. Diabetes. 65 (10), 3053-3061 (2016).
  3. Scheele, C., et al. Satellite cells derived from Obese humans with type 2 diabetes and differentiated into Myocytes in vitro exhibit abnormal response to IL-6. PLoS One. 7 (6), e39657 (2012).
  4. Riddle, E. S., Bender, E. L., Thalacker-Mercer, A. E. Expansion capacity of human muscle progenitor cells differs by age, sex, and metabolic fuel preference. American Journal of Physiology: Cell Physiology. 315 (5), C643-C652 (2018).
  5. Charville, G. W., et al. Ex vivo expansion and in vivo self-renewal of human muscle stem cells. Stem Cell Reports. 5 (4), 621-632 (2015).
  6. Alexander, M. S., et al. CD82 Is a Marker for Prospective Isolation of Human Muscle Satellite Cells and Is Linked to Muscular Dystrophies. Cell Stem Cell. 19 (6), 800-807 (2016).
  7. Thalacker-Mercer, A., et al. Cluster analysis reveals differential transcript profiles associated with resistance training-induced human skeletal muscle hypertrophy. Physiological Genomics. 45 (12), 499-507 (2013).
  8. Garcia, S. M., et al. High-Yield Purification, Preservation, and Serial Transplantation of Human Satellite Cells. Stem Cell Reports. 10 (3), 1160-1174 (2018).
  9. Yokoyama, W. M., Thompson, M. L., Ehrhardt, R. O. Cryopreservation and thawing of cells. Current Protocols in Immunology. , (2012).
  10. Bareja, A., Billin, A. N. Satellite cell therapy – from mice to men. Skeletal Muscle. 3 (1), 2 (2013).
  11. Riddle, E. S., Bender, E. L., Thalacker-Mercer, A. Transcript profile distinguishes variability in human myogenic progenitor cell expansion capacity. Physiological Genomics. 50 (10), 817-827 (2018).
  12. Xu, X., et al. Human Satellite Cell Transplantation and Regeneration from Diverse Skeletal Muscles. Stem Cell Reports. 5 (3), 419-434 (2015).

Play Video

Cite This Article
Gheller, B. J., Blum, J., Soueid-Baumgarten, S., Bender, E., Cosgrove, B. D., Thalacker-Mercer, A. Isolation, Culture, Characterization, and Differentiation of Human Muscle Progenitor Cells from the Skeletal Muscle Biopsy Procedure. J. Vis. Exp. (150), e59580, doi:10.3791/59580 (2019).

View Video