इस प्रोटोकॉल एक खंड पाचन दृष्टिकोण का उपयोग वयस्क माउस दिल से एकल atrial cardiomycytes को अलग करने के लिए प्रयोग किया जाता है. इस दृष्टिकोण सही को अलग करने के लिए प्रयोग किया जाता है या छोड़ दिया atrial मायोसाइट्स कि पैच-क्लंप अध्ययन में एट्रियल मायोसाइट इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी की विशेषता के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
एट्रियल मायोसाइट्स के इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल गुण महत्वपूर्ण रूप से समग्र हृदय समारोह को प्रभावित करते हैं। कार्रवाई की क्षमता के लिए जिम्मेदार अंतर्निहित आयनिक धाराओं में परिवर्तन समर्थक-एरिथिक substrates कि underlie arrhythmias, इस तरह के एट्रियल फाइब्रिलेशन के रूप में पैदा कर सकता है, जो कई स्थितियों और रोग राज्यों में अत्यधिक प्रचलित हैं. पैच-क्लैम्प प्रयोगों में उपयोग के लिए वयस्क माउस एट्रियल कार्डियोमायोसाइट्स को अलग करने से स्वस्थ एट्रियल मायोकार्डियम में और एट्रियल पैथोफिजियोलॉजी की सेटिंग में हमारे ज्ञान और सेलुलर इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी की समझ को बहुत उन्नत किया गया है। इसके अलावा, आनुवंशिक माउस मॉडल का उपयोग कर अध्ययन atrial electrophysiology को विनियमित करने में प्रोटीन की एक विशाल सरणी की भूमिका स्पष्ट है. यहाँ हम एंजाइमी पाचन और इन ऊतकों के यांत्रिक वियोजन का उपयोग कर वयस्क चूहों के atrial उपांगों से cardiomycytes के अलगाव के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं. यह दृष्टिकोण लगातार और मज़बूती से अलग atrial cardiomycytes है कि तो कार्रवाई क्षमता और प्रयोगात्मक की एक संख्या के तहत पैच-क्लैम्प प्रयोगों में आय धाराओं को मापने के द्वारा सेलुलर इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी की विशेषता के लिए इस्तेमाल किया जा सकता पैदावार शर्तों.
एट्रिया, जो दिल की पतली दीवारों, कम दबाव कक्षों कि बेहतर और अवर वेना cavae के रूप में के रूप में अच्छी तरह से फुफ्फुसीय नसों से रक्त प्राप्त कर रहे हैं, सामान्य हृदय शरीर क्रिया विज्ञान में अभिन्न हैं. दिल के अन्य क्षेत्रों की तरह, atria cell प्रकार के एक नंबर होते हैं, cardiomycytes सहित, फाइब्रोब्लास्ट्स, endothelial कोशिकाओं, संवहनी चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं, और दूसरों. एट्रियल मायोसाइट्स विद्युत ीय कोशिकाओं है कि दिल के माध्यम से बिजली के संकेतों के चालन में एक आवश्यक भूमिका निभाते हैं, जिससे प्रत्येक दिल की धड़कन1के दौरान उचित एट्रियल संकुचन सुनिश्चित कर रहे हैं। एट्रिया में विद्युत रोग के कारण अनेक एट्रियल विशिष्ट अतालता हो सकते हैं , जैसे कि एट्रियल स्पंदन और एट्रियल फाइब्रिलेशन2,3. ये अत्यधिक प्रचलित हैं, अभी तक खराब समझ, atrial arrhythmias कि महत्वपूर्ण रुग्णता और मृत्यु के लिए नेतृत्व. एट्रियल फाइब्रिलेशन आनुवंशिक उत्परिवर्तनों के साथ सहयोग में, उम्र बढ़ने के साथ या उच्च रक्तचाप,हृदय विफलता और मधुमेह 2,4,5 सहित हृदय रोग के अधिग्रहीत रूपों की स्थापना में हो सकता है ,6. ये स्थितियां एट्रियल मायोसाइट्स के विद्युत गुणों को बदल सकती हैं जो एक सब्सट्रेट बना सकती हैं जो अतालताजनन1,2के प्रसार को बढ़ाती हैं .
atria में सामान्य विद्युत समारोह, साथ ही एट्रियल arrhythmogenesis, महत्वपूर्ण रूप से कार्रवाई की क्षमता की आकृति विज्ञान से प्रभावित कर रहे हैं (एपी) atrial मायोसाइट्स में उत्पादित. एट्रियल एपी सोडियम वर्तमान (मैंना,ना द्वारा किए गए Na, 1.5 चैनलों द्वारा किए गए), एल-प्रकार कैल्शियम वर्तमान (मैंCa,L, Cav1.2 और CaV1.3 चैनलों द्वारा किए गए सहित आयनिक धाराओं की एक संख्या की गतिविधि से उत्पन्न होता है ), और अल्ट्रा तीव्र विलंबित दिष्टकारी पोटेशियम वर्तमान सहित कई पोटेशियम धाराओं (IKur, KV1.5 चैनलों द्वारा किया जाता है), क्षणिक जावक पोटेशियम वर्तमान (मैंकरने के लिए, KV4.2 और KV4.3 द्वारा किया जाता है चैनल), एक स्थिर राज्य पोटेशियम वर्तमान (मैंKss, KV2.1 चैनलों द्वारा किया जाता है), और आवक दिष्टकारी पोटेशियम वर्तमान (मैंK1, Kir2.1 चैनलों द्वारा किया जाता है)1,7, 8. हालांकि वे माउस atria में एक प्रमुख भूमिका नहीं निभाते हैं, देरी दिष्टकारी K+ वर्तमान के तेजी से और धीमी गति से घटकों (मैंKr और मैंKs) भी कुछ प्रजातियों में एपी repolarization के लिए योगदान7. इन आयनिक धाराओं में से एक या अधिक में परिवर्तन काफी एट्रियल मायोसाइट्स के विद्युत गुणों को बदल सकते हैं, जो एट्रियल एरिथमिया के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, मैंना में कमी एपी अपस्ट्रोक वेग को कम करने से atria भर में चालन वेग धीमा कर सकते हैं. दूसरी ओर, पोटेशियम धाराओं repolarizing में कमी या या तो मैंCa,L या देर से मैंना में वृद्धि afterdepolarizations के विकास में परिणाम कर सकते हैं कि atria1में सहज गतिविधि को गति प्रदान कर सकते हैं, 2,9.
यह समझना महत्वपूर्ण है कि एट्रियल मायोकार्डियम के विभिन्न भागों में एपी आकृति विज्ञान में अंतर है जो इन अंतर्निहित आयन चैनलों की अभिव्यक्ति या विनियमन में अंतर के कारण होने की संभावना है। उदाहरण के लिए, सही और बाएँ atria के बीच एपी अवधि में मतभेद मैं में वर्तमान घनत्व में अंतरके साथ सहयोग में अच्छी तरह से वर्णित किया गया है10,11,12,13. इसके अलावा, हम हाल ही में दिखा दिया है कि वहाँ बिजली remodeling के अलग पैटर्न हैं सही और पुराने उच्च रक्तचाप के साथ चूहों के बाईं atria6,14. दाईं ओर पीछे की दीवार में साइनोट्रियल नोड भी होता है, जिसका एपी आकृति विज्ञान और फायरिंग पैटर्न15का अपना अलग पैटर्न होता है। एट्रिया के इन विभिन्न भागों में से प्रत्येक में मायोसाइट्स के अलग-अलग गुणों की इन क्षेत्रों में से प्रत्येक से अलग मायोसाइट्स का उपयोग करके विस्तार से जांच की जा सकती है।
वहाँ अलग अलग दृष्टिकोण है कि पैच-क्लैम्प इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी अध्ययन16के लिए एट्रियल मायोसाइट्स को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. एक संभावना एक प्रतिगामी भ्रम दृष्टिकोण का उपयोग करने के लिए जहां दिल एंजाइमों की डिलीवरी के लिए महारा के माध्यम से cannulated है. हालांकि यह एक व्यवहार्य दृष्टिकोण है, यह atria के perfusion में विसंगतियों के कारण atrial मायोसाइट गुणवत्ता में परिवर्तनशीलता का उत्पादन कर सकते हैं. हमने एट्रियल मायोसाइट्स के अलगाव के लिए एक ‘चंक’ पाचन दृष्टिकोण अपनाया है जो हृदय के प्रतिगामी भ्रम की आवश्यकता को समाप्त करता है। हमारे दृष्टिकोण एंजाइमी पाचन और एट्रियल ऊतक है कि लगातार और मज़बूती से पैच-क्लैम्प अध्ययन के लिए उपयुक्त हैं कि अलग एट्रियल मायोसाइट्स की बड़ी संख्या पैदावार के यांत्रिक वियोजन का एक संयोजन का उपयोग करता है। जब तक हम अपने दृष्टिकोण का वर्णन यहाँ atrial उपांग ऊतक का उपयोग कर, दृष्टिकोण atrial मायोकार्डियम के किसी भी क्षेत्र पर इस्तेमाल किया जा सकता है (यानी, सही है या छोड़ दिया atrial उपांग, मुक्त दीवारों, पीछे की दीवारों) कि अन्वेषक चुनता है. यह दृष्टिकोण आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों में एट्रियल मायोसाइट इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के अध्ययन के लिए आदर्श है, हृदय रोग के माउस मॉडल में, या औषधीय यौगिकों के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए5,6,17 , 18 , 19.
हमारी प्रयोगशाला नियमित रूप से इस प्रोटोकॉल का उपयोग करता है पैच-क्लैम्प प्रयोगों में उपयोग के लिए माउस एट्रियल मायोसाइट्स को अलग करने के लिए हृदय रोग के विभिन्न रूपों के प्रभाव की जांच करने के लिए, आनुवंशिक उत्परिवर्तन, या एट्रियल मायोसाइट पर औषधीय यौगिकों वैद्युत शरीर विज्ञान। हालांकि अत्यधिक reproduible, अलग एट्रियल मायोसाइट्स से प्राप्त डेटा की गुणवत्ता अलगाव की गुणवत्ता पर निर्भर करता है. इसके अलावा, एट्रियल मायोसाइट अलगाव के बाद कैल्शियम को फिर से शुरू करने से कैल्शियम विरोधाभास16के कारण अलग-अलग मायोसाइट्स की आबादी के लिए कोशिका मृत्यु हो जाएगी। तदनुसार, इस दृष्टिकोण का उपयोग कर व्यवहार्य, उच्च गुणवत्ता वाले एट्रियल मायोसाइट्स को अलग-थलग करने के लिए पूरे अलगाव में कई बिंदुओं पर अभ्यास और अनुकूलन की आवश्यकता होती है। एक बार अनुकूलित, यह अनुमान है कि कुल atrial mycytes के 70-90% के बीच इस दृष्टिकोण का उपयोग कर अलग कैल्शियम सहिष्णु और रॉड के आकार का हो जाएगा. सबसे अधिक अभ्यास और अनुकूलन की आवश्यकता के चरणों के नीचे चर्चा कर रहे हैं.
विच्छेदन की गति और दक्षता अलग कोशिकाओं की गुणवत्ता पर बहाव प्रभाव पड़ेगा. यह सुनिश्चित करने के लिए समय लेने के लिए महत्वपूर्ण है कि सभी रक्त एट्रियल ऊतक से हटा दिया जाता है और ऊतक स्ट्रिप्स एक समान आकार में कटौती कर रहे हैं. यह लगभग 5 मिनट लेने के लिए एट्रियल उपांग को दूर करना चाहिए, स्ट्रिप्स में ऊतक में कटौती, और संशोधित Tyrode पीएच 6.9 समाधान की पहली ट्यूब में ऊतक स्ट्रिप्स हस्तांतरण. हालांकि, अगर यह कदम बहुत लंबा लगता है, ऊतक की गुणवत्ता समझौता किया जा सकता है.
यह भी महत्वपूर्ण है कि ऊतक स्ट्रिप्स एक अलगाव के भीतर और दिल के बीच एक समान आकार में कटौती कर रहे हैं. यदि ऊतक स्ट्रिप्स बहुत बड़े या बहुत छोटे हैं, या यदि वे एक अलगाव के भीतर वर्दी नहीं हैं, यह दोनों एंजाइमी पाचन और trituration के दौरान समस्याओं का कारण बन सकता है. इसका कारण यह है कि छोटे स्ट्रिप्स अधिक अच्छी तरह से पचा जाएगा और बड़ी स्ट्रिप्स पचा के तहत किया जाएगा. यह भी उतना ही जीनोटाइप और रोग सेटिंग पर विचार करने के लिए महत्वपूर्ण है के रूप में अध्ययन किया जा रहा है एट्रियल उपांग के आकार जानवरों के बीच भिन्न हो सकते हैं. उदाहरण के लिए, hypertrophic दिल स्वस्थ दिल की तुलना में बड़ा एट्रियल उपांग है, और इसलिए प्रयोगकर्ता सामान्य आकार दिल की तुलना में hypertrophic दिल में अधिक स्ट्रिप्स कटौती कर सकते हैं. तदनुसार, कटौती ऊतक स्ट्रिप्स के आकार का अनुकूलन और प्रत्येक व्यक्ति atrial उपांग के लिए इन आयामों को लागू करने बहुत प्रयोगात्मक स्थितियों के बीच मायोसाइट अलगाव के reproducibility में सुधार होगा.
एंजाइमी पाचन और यांत्रिक वियोजन के बीच नाजुक संतुलन इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर एक सफल एट्रियल मायोसाइट अलगाव के लिए महत्वपूर्ण है। यदि ऊतक एंजाइमी पाचन के दौरान पर्याप्त रूप से घूमता नहीं है, तो व्यक्तिगत ऊतक स्ट्रिप्स झुरमुट करते हैं और एक साथ चिपके रहते हैं, जो एंजाइमी पाचन की प्रभावशीलता को सीमित करेगा। यदि बहुत बार या जोरदार ढंग से उत्तेजित किया जाता है, तो यह एट्रियल ऊतक को नुकसान पहुंचा सकता है, जिसके परिणामस्वरूप अव्यवहार्य कोशिकाओं का अलगाव होगा। अनुत्यकेश के दौरान ऊतक स्ट्रिप्स से अलग एट्रियल मायोसाइट्स का यांत्रिक वियोजन एट्रियल मायोसाइट्स को अलग करने के लिए इस दृष्टिकोण का उपयोग करने का अभ्यास और अनुकूलन करने के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम है। यदि trituration बहुत कोमल है, सेल उपज कम हो जाएगा. दूसरी ओर, यदि trituration भी कठोर है, तो गैर-व्यवहार्य मायोसाइट्स की एक बहुतायत अलग हो जाएगा, और पैच-क्लैम्प प्रयोगों के दौरान प्राप्त डेटा की गुणवत्ता ख़तरे में डाल दिया जाएगा। इसके अलावा, atria की संरचना अलगाव को प्रभावित कर सकते हैं. उदाहरण के लिए, यदि ऊतक फाइब्रोटिक है, एंजाइमी पाचन और trituration कदम संशोधित करने की आवश्यकता हो सकती है. इसलिए यह पैच-क्लैम्प प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि trituration के दौरान उच्च गुणवत्ता कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए आवश्यक कौशल विकसित करने के लिए समय लेने के लिए महत्वपूर्ण है.
सभी प्रयोगात्मक तकनीकों के साथ के रूप में वहाँ सीमाएं हैं. इस तकनीक के क्रम में अभ्यास की आवश्यकता है reproducibly को अलग व्यवहार्य, उच्च गुणवत्ता myocytes, जो बारी में किसी भी प्रयोगों की व्यवहार्यता को प्रभावित करेगा इन myocytes का उपयोग कर प्रदर्शन किया जाएगा. यह दृष्टिकोण भी टर्मिनल है और इस दृष्टिकोण का उपयोग कर अलग atrial mycytes अलगाव के दिन ही इस्तेमाल किया जा सकता है. हमारे प्रयोगशाला अलगाव के 6-7 एच के भीतर कोशिकाओं का उपयोग करता है.
एट्रियल कार्डियोमायोसाइट्स को अलग करने के इस दृष्टिकोण में कई आवेदन हैं। उदाहरण के लिए, इस दृष्टिकोण मानव एट्रियल ऊतक बायोप्सी सहित अन्य प्रजातियों से एट्रियल मायोसाइट्स (साथ ही कार्डियक फाइब्रोब्लास्ट्स) को अलग करने के लिए संशोधित किया जा सकता है। इसके अलावा, एट्रियल मायोसाइट अलगाव के लिए इस खंड विधि का उपयोग करने के लिए एक लाभ (दिल के प्रतिगामी भ्रम के विपरीत) यह है कि इसे दिल के अन्य क्षेत्रों से कार्डियोमायोसाइट्स को अलग करने के लिए संशोधित किया जा सकता है, जैसे कि साइनोएट्रियल नोड या अन्य विशिष्ट क्षेत्र एट्रियल मायोकार्डियम की, या दिल के पूरे सुप्रावेंट्रिकुलर क्षेत्र को घेरते हैं। हमारी प्रयोगशाला कार्रवाई क्षमता और आयनिक धाराओं को मापने के लिए पैच-क्लैम्प प्रयोगों के लिए एट्रियल कार्डियोमायोसाइट्स का उपयोग करता है, हालांकि इस दृष्टिकोण को इस तकनीक तक सीमित नहीं होना चाहिए। उदाहरण के लिए, अलग मायोसाइट्स का उपयोग विभिन्न प्रयोगात्मक सेटिंग्स में कैल्शियम यात्रियों और संकुचन में परिवर्तन की जांच करने के लिए किया जा सकता है। एट्रियल कार्डियोमायोसाइट्स का उपयोग प्रोटीन या रुचि की संरचनाओं के स्थान का अध्ययन करने के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस अध्ययन में भी किया जा सकता है। तदनुसार, इस दृष्टिकोण अत्यधिक कई संभव अनुप्रयोगों के साथ बहुमुखी है.
The authors have nothing to disclose.
यह काम कनाडा के स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थानों (एमओपी 93718, 142486) और आर.ए. गुलाब के लिए कनाडा के हार्ट एंड स्ट्रोक फाउंडेशन से अनुदान के संचालन द्वारा समर्थित है. एच.जे. जेन्सेन एक किलम पोस्टडॉक्टोरल फैलोशिप के प्राप्तकर्ता हैं।
1, 2-Bis(2-Aminophenoxy)ethane-N, N, N', N'-tetraacetic acid 98% | Sigma | A4926-1G | |
Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate BioXtra, > 99%, from microbial | Sigma | A7699-1G | |
Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt > 95%, bacterial | Sigma | A9187-1G | |
Amphocetericin B from Streptomyces sp. ~80% (HPLC), powder | Sigma | A4888-500 MG | |
Bovine serum albumin | Sigma | A3059-50G | |
Calcium chloride dihydrate | Sigma | 223506-500G | |
Cesium chloride ReagentPlus, 99.9% | Sigma | 289329-100G | |
Cesium hydroxide monohydrate > 99.5% trace metals basis | Sigma | 562505-1KG | |
Collagenase Type 2 | Worthington Biochemical Corporation | LS004176 | |
Creatine anhydrous | Sigma | C0780 | |
D-(+)-Glucose | Sigma | G7021-1KG | |
DL-Aspartic acid potassium salt | Sigma | A2025-100G | |
Elastase suspension | Worthington Biochemical Corporation | LS002279 | |
Ethylene glycol-bis(2-amino-ethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid >97.0% | Sigma | E4378-25G | |
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate > 95% (HPLC), powder | Sigma | G8877-250MG | |
Heparin 10 000 USP units/10mL | SANDOZ | 10750 | |
HEPES > 99.5% (titration) | Sigma | H3375-500G | |
L-Glutamic acid potassium salt monohydrate > 99% (HPLC), powder | Sigma | G1501-500G | |
Magnesium sulfate | Sigma | M2643-500G | |
Nifedipine > 98% (HPLC), powder | Sigma | N7634-1G | |
Phosphocreatine disodium salt hydrate enzymatic, approx 98% | Sigma | P7936-5G | |
Potassium chloride ACS reagent, 99.0-100.5% | Sigma | P3911-500G | |
Potassium hydroxide | EM Science | PX1480-1 | |
Potassium phosphate monobasic | EMD | PX1565-1 | |
Protease from Streptomyces griseus, type XIV, >3.5 units/mg solid, powder | Sigma | P5147-1G | |
Sodium chloride ACS reagent, > 99.0% | Sigma | S9888-2.5KG | |
Sodium hydroxide, pellets, 97+%, A.C.S. reagent | Sigma | 221465-500G | |
Sylgard 184 silicone elastomer kit | World Precision Instruments Inc | SYLG184 | |
Taurine | Sigma | T0625-100G | |
Tetraethylammonium chloride > 98% (titration) | Sigma | T2265-100G |