이 프로토콜은 청크 소화 접근법을 사용하여 성인 마우스 심장으로부터 단일 심방 심근세포를 분리하는 데 사용됩니다. 이 접근법은 패치 클램프 연구에서 심방 근세포 전기 생리학을 특성화하는 데 사용할 수 있는 우측 또는 좌심방 근세포를 분리하는 데 사용됩니다.
심방 근세포의 전기 생리학적 특성은 전반적인 심장 기능에 중요한 영향을 미칩니다. 활동 잠재력에 책임 있는 근본적인 이온 전류에 있는 변경은 많은 조건 및 질병 상태에서 높게 널리 퍼진 심방 세동과 같은 부정맥의 밑에 있는 pro 부정맥 기판을 일으키는 원인이 될 수 있습니다. 패치 클램프 실험에 사용하기 위해 성인 마우스 심방 심근 세포체를 분리하는 것은 건강한 심방 심근과 심방 병리생리학의 설정에서 세포 전기 생리학에 대한 우리의 지식과 이해를 크게 발전시켰습니다. 추가로, 유전 마우스 모형을 사용하여 연구 결과는 심방 전기 생리학통제에 있는 단백질의 광대한 배열의 역할을 설명했습니다. 여기에서 우리는 이 조직의 효소 소화 그리고 기계적인 해리의 조합을 사용하여 성인 마우스의 심방 부속물에서 심근세포의 격리를 위한 상세한 프로토콜을 제공합니다. 이 접근법은 일관되고 안정적으로 고립된 심방 심근구를 생성하여 여러 실험하에 패치 클램프 실험에서 작용 전위 및 이온 전류를 측정하여 세포 전기 생리학을 특성화하는 데 사용할 수 있습니다. 조건.
심방은 우수하고 열등한 정맥뿐만 아니라 폐 정맥에서 혈액을 받는 심장의 얇은 벽, 저압 챔버이며 정상적인 심장 생리학에 필수적입니다. 심혼의 그밖 지구 같이, 심방은 심근세포, 섬유아세포, 내피 세포, 혈관 평활근 세포 및 그 외를 포함하여 세포 모형의 수를 포함합니다. 심방 근세포는 심장을 통한 전기 신호의 전도에 필수적인 역할을 하는 전기적으로 흥분되는 세포로서, 각 심장 박동1동안 적절한 심방 수축을 보장합니다. 심방의 전기 기능 장애는 심방 펄터 및 심방 세동과 같은 심방 특정 부정맥의 수로 이어질 수있습니다2,3. 이들은 매우 널리 퍼짐, 아직 제대로 이해, 상당한 사망률과 사망률로 이어지는 심방 부정맥. 심방 세동은 유전 적 돌연변이와 관련하여, 노화와 관련하여 또는 고혈압, 심부전 및 당뇨병을 포함한후천적 인 형태의 심장 질환의 설정에서 발생할 수 있습니다 2,4,5 ,6. 이러한 조건은 부정맥 발생의 유병률을 증가시키는 기질을 생성할 수 있는 심방근세포의 전기적 특성을 변경할 수 있다 1,2.
심방 부정맥 발생뿐만 아니라 심방의 정상적인 전기 적 기능은 심방 근세포에서 생성 되는 행동 전위 (AP)의 형태에 의해 중요하게 영향을받습니다. 심방 AP는 나트륨 전류(INa,Na 1.5 채널에 의해 운반됨),L형 칼슘 전류(ICa,L, Cav1.2 및 CaV1.3 채널에 의해 운반됨)를 포함한 다수의 이온 전류의 활성으로부터 생성된다. ), 초고속 지연 정류기 칼륨 전류(IKur,KV1.5 채널로 운반), 일시적인 외부 칼륨 전류(Ito, KV4.2 및 KV4.3에 의해 운반됨) 등 여러 칼륨 전류 채널), 정상 상태 칼륨 전류 (IKss,KV2.1 채널에 의해 수행), 및 내부 정류기 칼륨 전류 (IK1,Kir2.1 채널에 의해 수행)1,7 ,7, 8. 그들은 마우스 심트리아에서 중요한 역할을하지 않지만, 지연 정류기 K+ 전류의 신속하고 느린 구성 요소 (IKr 및 IKs)또한 일부 종7에서AP 재분극에 기여한다. 이러한 이온 전류 중 하나 이상의 변화는 심방 심근 세포의 전기적 특성을 크게 변화시킬 수 있으며, 이는 심방 부정맥으로 이어질 수 있습니다. 예를 들어, INa의 감소는 AP 업스트로크 속도를 줄임으로써 심미국 전체의 전도 속도를 느리게 할 수 있습니다. 한편, 칼륨 전류의 재분극 감소 또는 ICa, L 또는 후기 INa의 증가는 심방1에서 자발적인 활동을 유발할 수 있는 분과분극의 발달을 초래할 수 있다. 2,9.
이러한 기본 이온 채널의 발현 또는 조절의 차이로 인해 심방 심근의 다른 부분에 AP 형태에 차이가 있음을 인식하는 것이 중요합니다. 예를 들어, 현재 밀도에 대한 I의 차이와 관련하여 좌우 심트리아 사이의 AP 지속 시간 차이는10,11,12,13을잘 기재되어 있다. 또한, 최근에는 만성 고혈압6,14를가진 마우스의 좌우 심증에 전기 리모델링의 뚜렷한 패턴이 있음을 입증했습니다. 오른쪽 심방 후방 벽에는 AP 형태와 발사 패턴15의고유한 패턴이있는 심방 노드가 포함되어 있습니다. 심방의 이 다른 부분의 각각에 있는 myocytes의 명백한 속성은 이 지구의 각각에서 고립된 myocytes를 사용하여 상세히 조사될 수 있습니다.
패치 클램프 전기 생리학 연구16에대한 심방 근세포를 분리하는 데 사용할 수있는 다른 접근법이 있다. 한 가지 가능성은 심장이 효소의 전달을 위해 대류를 통해 절제되는 역행 관류 접근법을 사용하는 것입니다. 이것은 실행 가능한 접근하는 동안, 그것은 심방 근세포 질에 있는 가변성을 심방의 관류에 있는 불일치 때문에 생성할 수 있습니다. 우리는 심방 근세포의 격리를 위한 ‘덩어리’ 소화 접근법을 채택하여 심장의 역행 관류의 필요성을 제거합니다. 우리의 접근 방식은 항문 산화와 심방 조직의 기계적 해리의 조합을 사용하여 패치 클램프 연구에 적합한 많은 수의 단고심 심근 세포가 일관되고 안정적으로 산출합니다. 우리는 심방 부속기 조직을 사용하여 여기에서 우리의 접근을 기술하는 동안, 접근은 조사자가 선택하는 심방 심근의 어떤 지역든지에 사용될 수 있습니다 (즉, 오른쪽 또는 왼쪽 심방 부속기, 자유로운 벽, 후방 벽). 이 접근법은 유전자 변형 마우스의 심방 근세포 전기생리학, 심혈관 질환의 마우스 모델 또는 약리화합물 5,6,17의 효과를 연구하는 데 이상적입니다. , 18세 , 19.
우리의 실험실은 심방 근세포에 대한 다양한 형태의 심혈관 질환, 유전 돌연변이 또는 약리화합물의 효과를 조사하기 위해 패치 클램프 실험에 사용하기 위해 마우스 심방 근세포계를 분리하기 위해 이 프로토콜을 일상적으로 사용합니다. 전기 생리학. 높은 재현성이지만, 분리된 심방 근세포로부터 얻은 데이터의 품질은 절연의 품질에 달려 있다. 또한, 심방 근세포 격리 에 따른 칼슘의 재도입은 칼슘 역설16로인한 고립된 근세포 집단에 대한 세포 사멸을 초래할 것이다. 따라서, 이 접근법을 사용하여 실행 가능한 고품질 심방 근세포를 분리하려면 격리 전반에 걸쳐 여러 지점에서 연습 및 최적화가 필요합니다. 일단 최적화되면, 이 접근법을 사용하여 분리된 총 심방 근세포의 70-90% 사이에서 칼슘 내성과 막대 모양둘 다 일 것이라는 추정된다. 가장 많은 연습과 최적화가 필요한 단계는 아래에서 설명합니다.
해부의 속도와 효율은 단리 된 세포의 품질에 다운 스트림 영향을 미칠 것입니다. 모든 혈액이 심방 조직에서 제거되고 조직 스트립이 비슷한 크기로 절단되도록 하는 데 시간이 걸리는 것이 중요합니다. 심방 부속기를 제거하고 조직을 스트립으로 자르고 조직 스트립을 변형 된 Tyrode의 pH 6.9 용액의 첫 번째 튜브로 옮기는 데 약 5 분이 소요됩니다. 그러나,이 단계가 너무 오래 걸리는 경우, 조직의 품질이 손상 될 수 있습니다.
조직 스트립은 격리 내에서 그리고 마음 사이 균일 한 크기로 절단하는 것이 중요합니다. 조직 스트립이 너무 크거나 너무 작거나 격리 내에서 균일하지 않은 경우 효소 소화및 삼조 중에 문제가 발생할 수 있습니다. 작은 스트립이 더 철저하게 소화되고 큰 스트립이 소화되기 때문입니다. 심방 부속기의 크기가 동물마다 다를 수 있기 때문에 연구되고 있는 유전자형 및 질병 설정을 고려하는 것이 동등하게 중요합니다. 예를 들어, 비대 심장은 건강한 심장에 비해 심방 부속기가 더 크므로 실험자는 정상적인 크기의 심장에 비해 비대 심장에서 더 많은 스트립을 자를 수 있습니다. 따라서, 절단 조직 스트립의 크기를 최적화하고 각 개별 심방 부속기에 이러한 치수를 적용하면 실험 조건 사이의 근세포 격리의 재현성이 크게 향상될 것이다.
효소 소화와 기계적 해리 사이의 섬세한 균형은이 프로토콜을 사용하여 성공적인 심방 근세포 격리의 핵심입니다. 조직이 효소 소화 도중 적당하게 소용돌이치지 않는 경우에 개별 조직 조직은 응집하고 함께 붙는 경향이 있을 것이고, 이는 효소 소화의 효과를 제한할 것입니다. 너무 자주 또는 적극적으로 교반 하는 경우, 이 심 방 조직을 손상 시킬 수 있습니다., 실행 불가능 한 세포의 격리 귀 착될 것 이다. 삼조 동안 조직 스트립에서 분리 된 심방 근세포의 기계적 해리는 심방 근세포를 분리하기 위해이 접근법을 사용하여 연습하고 최적화하는 가장 중요한 단계입니다. 삼조가 너무 부드러우면 셀 수율이 낮습니다. 반면에 삼조가 너무 가혹하면 실행 불가능한 근세포가 풍부하게 격리되고 패치 클램프 실험 중에 얻은 데이터의 품질이 위태로워집니다. 또한, 심트리아의 조성은 격리에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들면, 조직이 섬유성인 경우에, 효소 소화 및 삼각 단계는 수정될 필요가 있을 수 있습니다. 따라서 패치 클램프 실험에 사용할 수있는 삼조 중에 고품질의 세포를 얻는 데 필요한 기술을 개발하는 데 시간이 걸리는 것이 중요합니다.
모든 실험 기술과 마찬가지로 한계가 있습니다. 이 기술은 재현 가능한, 고품질 myocytes를 재현하기 위하여 연습을 요구합니다, 차례차례로 이 근세포를 사용하여 수행되는 어떤 실험든지의 타당성에 영향을 미칠 것입니다. 이러한 접근법은 또한 단말 및 심방 근세포가 이 접근법을 사용하여 격리된 날에만 사용될 수 있다. 우리의 실험실은 격리의 6-7 시간 안에 세포를 이용합니다.
심방 심근구를 격리하는 이 접근법에는 여러 가지 응용 분야가 있습니다. 예를 들면, 이 접근은 인간 적인 심방 조직 생검을 포함하여 그밖 종에서 심방 myocytes (뿐만 아니라 심장 섬유아세포)를 격리하기 위하여 수정될 수 있습니다. 또한 심방 심근 세포 격리 (심장의 역행 관류와는 대조적으로)에 이 청크 방법을 사용하면 심근 세포가 심혼의 다른 영역(예: 심방 노드 또는 기타 특정 영역)으로부터 심근구를 분리하도록 수정할 수 있다는 장점이 있습니다. 심방 심근의, 또는 심장의 전체 상심 영역을 포괄. 우리의 실험실은 이 접근법이 이 기술에 국한될 필요는 없지만, 패치 클램프 실험을 위해 심방 심근세포를 사용하여 작용 전위 및 이온 전류를 측정합니다. 예를 들어, 고립 된 근세포는 다양한 실험 환경에서 칼슘 과도 및 수축성의 변화를 조사하는 데 사용할 수 있습니다. 심방 심근세포는 또한 관심 있는 단백질 또는 구조물의 위치를 공부하기 위하여 면역 형광 연구 결과에서 이용될 수 있습니다. 따라서 이 방법은 가능한 많은 응용 분야에서 매우 다재다능합니다.
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 캐나다 보건 연구 기관 (MOP 93718, 142486)과 R.A. Rose에 캐나다의 심장 및 뇌졸중 재단에서 보조금을 운영하여 지원됩니다. H.J. 얀센은 킬람 박사 후 펠로우십의 수혜자입니다.
1, 2-Bis(2-Aminophenoxy)ethane-N, N, N', N'-tetraacetic acid 98% | Sigma | A4926-1G | |
Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate BioXtra, > 99%, from microbial | Sigma | A7699-1G | |
Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt > 95%, bacterial | Sigma | A9187-1G | |
Amphocetericin B from Streptomyces sp. ~80% (HPLC), powder | Sigma | A4888-500 MG | |
Bovine serum albumin | Sigma | A3059-50G | |
Calcium chloride dihydrate | Sigma | 223506-500G | |
Cesium chloride ReagentPlus, 99.9% | Sigma | 289329-100G | |
Cesium hydroxide monohydrate > 99.5% trace metals basis | Sigma | 562505-1KG | |
Collagenase Type 2 | Worthington Biochemical Corporation | LS004176 | |
Creatine anhydrous | Sigma | C0780 | |
D-(+)-Glucose | Sigma | G7021-1KG | |
DL-Aspartic acid potassium salt | Sigma | A2025-100G | |
Elastase suspension | Worthington Biochemical Corporation | LS002279 | |
Ethylene glycol-bis(2-amino-ethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid >97.0% | Sigma | E4378-25G | |
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate > 95% (HPLC), powder | Sigma | G8877-250MG | |
Heparin 10 000 USP units/10mL | SANDOZ | 10750 | |
HEPES > 99.5% (titration) | Sigma | H3375-500G | |
L-Glutamic acid potassium salt monohydrate > 99% (HPLC), powder | Sigma | G1501-500G | |
Magnesium sulfate | Sigma | M2643-500G | |
Nifedipine > 98% (HPLC), powder | Sigma | N7634-1G | |
Phosphocreatine disodium salt hydrate enzymatic, approx 98% | Sigma | P7936-5G | |
Potassium chloride ACS reagent, 99.0-100.5% | Sigma | P3911-500G | |
Potassium hydroxide | EM Science | PX1480-1 | |
Potassium phosphate monobasic | EMD | PX1565-1 | |
Protease from Streptomyces griseus, type XIV, >3.5 units/mg solid, powder | Sigma | P5147-1G | |
Sodium chloride ACS reagent, > 99.0% | Sigma | S9888-2.5KG | |
Sodium hydroxide, pellets, 97+%, A.C.S. reagent | Sigma | 221465-500G | |
Sylgard 184 silicone elastomer kit | World Precision Instruments Inc | SYLG184 | |
Taurine | Sigma | T0625-100G | |
Tetraethylammonium chloride > 98% (titration) | Sigma | T2265-100G |