כאן, פרוטוקולים עבור בידוד של cyanobacterial שוחרר פולימרים פחמימות ובידוד של exoproteomes שלהם מתוארים. שני ההליכים לגלם שלבים מרכזיים כדי להשיג פולימרים או חלבונים עם דרגות טוהר גבוהה, כי ניתן להשתמש לניתוח נוסף או יישומים. הם יכולים גם להיות מותאמים בקלות בהתאם לצרכים ספציפיים של המשתמש.
כחוליות יכול להפריש באופן פעיל מגוון רחב של biomolecules לתוך הסביבה החילוץ, כגון הפשפשים וחלבונים. ההזדהות והאפיון של biomolecules אלה יכולים לשפר את הידע על משעולים הפרשה שלהם ולעזור לתמרן אותם. יתרה מזאת, חלק מbiomolecules הללו מעניינים גם במונחים של יישומים ביו-טכנולוגיים. המתואר כאן הם שני פרוטוקולים עבור בידוד קל ומהיר של cyanobacterial שוחרר פולימרים פחמימות וחלבונים. השיטה לבידוד של פולימרים שפורסמו מבוססת על טכניקות משקעים קונבנציונליים של פוליסכרידים בפתרונות מימית באמצעות ממיסים אורגניים. שיטה זו משמרת את מאפייני הפולימר ובמקביל נמנעת מנוכחותם של מזהמים מפסולת התא וממדיום תרבותי. בסופו של התהליך, פולימר ליאופהיזה מוכן לשמש או מאופיין או יכול להיות נתון לסיבובים נוספים של טיהור, בהתאם לשימוש סופי מיועד. בנוגע לבידוד של cyanobacterial exoproteome, הטכניקה מבוססת על ריכוז של מדיום ללא תא לאחר הסרת המזהמים העיקריים על ידי צנטריפוגה וסינון. אסטרטגיה זו מאפשרת בידוד אמין של חלבונים המגיעים לתחומי החילוץ באמצעות מובילי הממברנה או שלפוחיות הקרום החיצוני. חלבונים אלה יכולים להיות מזוהים לאחר מכן באמצעות טכניקות המסה סטנדרטי ספקטרומטריה. הפרוטוקולים המוצגים כאן ניתן להחיל לא רק על מגוון רחב של כחוליות, אלא גם על זנים חיידקיים אחרים. יתר על כן, הליכים אלה יכולים להיות מותאמים בקלות על פי השימוש הסופי של המוצרים, תואר הטוהר הנדרש, והזן חיידקי.
כחוליות מוכרות באופן נרחב כמקורות פורה של מוצרים טבעיים עם יישומים מבטיחים ביו-טכנולוגיים/ביו-רפואיים. לכן, הבנת מנגנוני הפרשה cyanobacterial ואופטימיזציה של שיטות החילוץ/שחזור חיוניים כדי ליישם cyanחיידקים יעילים מפעלים תאים מיקרוביאלית.
זנים cyanobacterial רבים מסוגלים לייצר חומרים פולימריים מסחטות (EPS), שנוצרו בעיקר על ידי הפשפשים, כי להישאר משויך משטח התא או משתחררים לתוך המדיום1. אלה פולימרים פחמימות שפורסמו יש תכונות נפרדות לעומת אלה של חיידקים אחרים, אשר להפוך אותם מתאימים עבור מגוון רחב של יישומים (למשל, נוגדנים2, מגירוי חיסוני3, נוגד חמצון4, מתכת-הכלפת5, אמולסיה6, וסוכני משלוח הסמים7,8). מתודולוגיה לבידוד של פולימרים אלה תורמת בעיקר לא רק כדי לשפר את התשואה אלא גם להגדיל את הטוהר ואת התכונות הפיזיות הספציפיות של הפולימר השיג9. רוב עצום של שיטות אלה לבידוד של פולימרים להסתמך על אסטרטגיות משקעים מתוך מדיום התרבות כי הם מושגת בקלות בשל הטבע האנייוני חזק של הפולימר9,10. בנוסף, הסרת ממיסים המשמשים בשלב המשקעים יכולה להיות מושגת במהירות על ידי אידוי ו/או ליזוליזציה. בהתאם ליישום מיוצג, שלבים שונים יכולים להיות ביחד או לאחר או לפני משקעים פולימריים על מנת להתאים את המוצר הסופי, הכוללים חומצת חומץ triכלור (TCA) טיפול, סינון, או כרומטוגרפיה הדרה (SEC) הטור טיהור10.
כחוליות מסוגלות גם להפריש מגוון רחב של חלבונים באמצעות מסלולים התלויים בטרנספורטי קרום (קלאסי)11 או בתיווך על ידי שלפוחיות (לא קלאסית)12. לכן, ניתוח של cyanexoproteome terial מהווה כלי חיוני, הן כדי להבין/לתמרן הפרשת חלבון cyanobacterial מנגנונים ולהבין את הפונקציה החילוץ ספציפיים של חלבונים אלה. הבידוד האמין והניתוח של הexoproteomes דורשים את הריכוז של הסביבה המועטה, שכן השפע של החלבונים מופרש נמוך יחסית. בנוסף, צעדים פיזיים או כימיים אחרים (למשל, צנטריפוגה, סינון או משקעים בחלבון) עשויים למטב את איכות הexoproteome המתקבלת, להעשיר את תוכן החלבון13, ולהימנע מנוכחות מזהמים (למשל, פיגמנטים, פחמימות, וכו‘) מיכל בן 14 , 15 או שליטה מראש של חלבונים תאיים בדגימות. עם זאת, חלק מהשלבים הללו עשויים גם להגביל את ערכת החלבונים שניתן לאתרם, המובילה לניתוח מוטה.
עבודה זו מתארת פרוטוקולים יעילים לבידוד של פולימרים משוחררים של פחמימות וexoproteomes מתוך מדיה של התרבות הקיאנקטריה. פרוטוקולים אלה ניתן להתאים בקלות את המטרות הספציפיות של המחקר ואת צורכי המשתמש, תוך שמירה על הצעדים הבסיסיים המוצגים כאן.
כדי להבין טוב יותר מנגנוני הפרשה חיידקיים וללמוד את המוצרים שפורסמו, זה חשוב ביותר כדי להדגים את הבידוד יעיל וניתוח של הbiomolecules הנוכחי בסביבה חיידקי החילוץ (כגון שוחרר פולימרים של פחמימות וחלבונים).
מסחטות cyanobacterial פולימרים פחמימות מורכבים מאוד, בעיקר בשל מספר ופרופורציה של …
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו היתה ממומנת על ידי Fundo אירופu de Desenvolvimento האזורית (פדר) קרנות באמצעות 2020 להתחרות-תוכנית Operacional לתחרותיות ובאינטראלליזציה (POCI), פורטוגל 2020, ועל ידי כספים פורטוגזית דרך FCT-Funda, הסדרה האלקטרונית e Tecnoלוג/Ministério da Ciência, Tecnoלוגיה e Ensino מעולה במסגרת הפרויקט POCI-01-0145-פדר-028779 והענק SFRH/BD/99715/2014 (CF).
Dialysis membranes | Medicell Membranes Ltd | DTV.12000.07 | Visking Tubing Size 7, Dia 23.8 mm, Width 39-41 mm 30m Roll |
Ethanol 96% | AGA – Álcool e Géneros Alimentares, S.A. | 4.000.02.02.00 | Fermentation ethyl alcohol 96% AGA |
PES Filter 0.2 μm | Fisher Scientific, Lda | 15206869 | Syringe filter polystyrene 33MM 0.2µM STR |
Amicon Ultra-15, Ultracel-3K | Merck Millipore Ltd. | UFC900324 | Centrifugal filters with a nominal molecular weight cut-off of 3 kDa |
Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay | Fisher Scientific, Lda | 10741395 | Green-to-blue, precise, detergent-compatible assay reagent to measure total protein concentration |
Brillant Blue G Colloidal Concentrate | Sigma Aldrich Química SL | B2025-1EA | Coomassie blue |