Looking utover: isolering av Cyanobacterial Released karbohydrater polymerer og proteiner

Summary

Her er protokoller for isolering av cyanobacterial utgitt karbohydrat polymerer og isolering av deres exoproteomes er beskrevet. Begge prosedyrene legemliggjøre viktige skritt for å få polymerer eller proteiner med høy renhet grader som kan brukes for videre analyse eller programmer. De kan også enkelt tilpasses i henhold til spesifikke brukerbehov.

Abstract

Cyanobakterier kan aktivt skille ut et bredt spekter av biomolekyler inn i ekstracellulære miljø, slik som heteropolysaccharides og proteiner. Identifisering og karakterisering av disse biomolekyler kan forbedre kunnskapen om deres sekresjon trasé og bidra til å manipulere dem. Videre er noen av disse biomolekyler også interessante når det gjelder bioteknologisk applikasjoner. Beskrevet her er to protokoller for enkel og rask isolering av cyanobacterial utgitt karbohydrater polymerer og proteiner. Metoden for isolering av frigitte karbohydrat polymerer er basert på konvensjonelle nedbørs polysakkarider teknikker i vandige oppløsninger ved hjelp av organiske løsemidler. Denne metoden bevarer egenskapene til polymer og samtidig unngår tilstedeværelsen av forurensninger fra celle rusk og kultur medium. På slutten av prosessen, den lyofilisert polymer er klar til å brukes eller karakteriseres eller kan utsettes for ytterligere runder av rensing, avhengig av den endelige tiltenkte bruk. Når det gjelder isolering av cyanobacterial exoproteome, er teknikken basert på konsentrasjonen av celle-fri medium etter fjerning av de store forurensninger av sentrifugering og filtrering. Denne strategien gjør det mulig for pålitelig isolering av proteiner som når det ekstracellulære miljøet via membran transportører eller ytre membran blemmer. Disse proteinene kan senere identifiseres ved hjelp av standard masse massespektrometri teknikker. Protokollene som presenteres her kan brukes ikke bare til et bredt spekter av cyanobakterier, men også til andre bakterielle stammer. Videre disse prosedyrene kan lett skreddersys i henhold til den endelige bruken av produktene, renhet grad nødvendig, og bakteriell belastning.

Introduction

Cyanobakterier er allment anerkjent som produktive kilder av naturlige produkter med lovende bioteknologisk/biomedisinsk applikasjoner. Derfor, forståelse cyanobacterial sekresjon mekanismer og optimalisering av utvinning/utvinning metoder er avgjørende for å implementere cyanobakterier som effektive mikrobielle celle fabrikker.

Mange cyanobacterial stammer er i stand til å produsere ekstracellulære polymer stoffer (EPS), hovedsakelig dannet av heteropolysaccharides, som forblir knyttet til celleoverflaten eller slippes ut i mediet¹. Disse frigitte karbohydrater polymerer har forskjellige funksjoner i forhold til de fra andre bakterier, som gjør dem egnet for et bredt spekter av applikasjoner (f. eks, antivirale midler², immunostimulatory³, antioksidant⁴, metall-chelaterande⁵, emulgering⁶, og legemiddellevering agenter^7,8). Metodikk for isolering av disse polymerer bidrar i stor grad ikke bare til økt utbytte, men også til økt renhet og de spesifikke fysiske egenskapene til polymer oppnådd⁹. Et stort flertall av disse metodene for isolering av polymerer stole på nedbør strategier fra kulturen medium som er lett oppnås på grunn av polymer sterke anioniske natur^9,10. I tillegg kan fjerning av løsemidler som brukes i nedbørs trinnet raskt oppnås ved fordampning og/eller lyophilization. Avhengig av den forutsett anvendelse, ulike trinn kan kobles enten etter eller før polymer nedbør for å skreddersy det endelige produktet, som inkluderer Trekloredikksyre acid (TCA) behandling, filtrering, eller størrelse eksklusjon kromatografi (SEC) kolonne rensing¹⁰.

Cyanobakterier er også i stand til å skille ut et bredt spekter av proteiner gjennom stier avhengig av membran transportører (klassisk)¹¹ eller mediert av blemmer (ikke-klassisk)¹². Derfor analyse av cyanobacterial exoproteome utgjør et viktig verktøy, både for å forstå/manipulere cyanobacterial protein sekresjon mekanismer og forstå den spesifikke ekstracellulære funksjon av disse proteinene. Pålitelig isolering og analyse av exoproteomes krever konsentrasjonen av ekstracellulære miljø, siden overflod av utskilles proteiner er relativt lav. I tillegg kan andre fysiske eller kjemiske tiltak (f.eks. sentrifugering, filtrering eller protein nedbør) optimere kvaliteten på exoproteome, berike proteininnholdet¹³, og unngå tilstedeværelsen av forurensninger (f.eks. pigmenter, karbohydrater, etc.) ¹⁴ priser og priser ^{, 15} eller overvekt av intracellulære proteiner i prøvene. Noen av disse trinnene kan imidlertid også begrense settet med proteiner som kan oppdages, noe som fører til en partisk analyse.

Dette arbeidet beskriver effektive protokoller for isolering av frigitte karbohydrat polymerer og exoproteomes fra cyanobakterier kultur medier. Disse protokollene kan enkelt tilpasses til studiet spesifikke mål og brukerbehov, og samtidig opprettholde de grunnleggende trinnene som presenteres her.

Protocol

1. Cyanobacterial utgitt karbohydrat polymer isolasjon Polymer isolering og fjerning av forurensninger Dyrke cyanobacterial belastning under standard forhold [f. eks, 30 ° c under en 12 h lys (50 μE m− 2s− 1)/12 h Dark regime, med orbital risting ved 150 RPM]. Mål vekst ved hjelp av standardprotokoller [f. eks optisk tetthet ved 730 NM (OD730nm), klorofyll a, tørr-vekt, etc.], og deretter måle produksjonen av frigitte polysakkarider …

Representative Results

En skjematisk fremstilling av metoden beskrevet for å utvinne frigitte karbohydrat polymerer fra cyanobacterial kulturer er avbildet i figur 1. Igangsatte polymerer fra den moderate EPS-produsenten cyanobacterium Synechocystis Sp. PCC 6803 og den effektive EPS-produsenten CYANOTHECE Sp. CCY 0110 er vist i figur 2. I Figur 3, lyofilisert polymerer med ulike grader av forurensning er vist, fremhever viktigheten av s…

Discussion

For bedre å forstå bakteriell sekresjon mekanismer og studere frigitte produkter, er det av ekstrem viktighet å demonstrere effektiv isolasjon og analyse av biomolekyler stede i ekstracellulære bakterielle miljøet (for eksempel utgitt karbohydrater polymerer og proteiner).

Cyanobacterial ekstracellulære karbohydrat polymerer er svært komplekse, hovedsakelig på grunn av antall og andel av ulike monosakkarider som utgjør deres sammensetning¹. Den konvensjonelle m…

Materials

Dialysis membranes	Medicell Membranes Ltd	DTV.12000.07	Visking Tubing Size 7, Dia 23.8 mm, Width 39-41 mm 30m Roll
Ethanol 96%	AGA – Álcool e Géneros Alimentares, S.A.	4.000.02.02.00	Fermentation ethyl alcohol 96% AGA
PES Filter 0.2 μm	Fisher Scientific, Lda	15206869	Syringe filter polystyrene 33MM 0.2µM STR
Amicon Ultra-15, Ultracel-3K	Merck Millipore Ltd.	UFC900324	Centrifugal filters with a nominal molecular weight cut-off of 3 kDa
Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay	Fisher Scientific, Lda	10741395	Green-to-blue, precise, detergent-compatible assay reagent to measure total protein concentration
Brillant Blue G Colloidal Concentrate	Sigma Aldrich Química SL	B2025-1EA	Coomassie blue