Ser utåt: isolering av Cyanobakterial släppt kolhydrat polymerer och proteiner
Summary
Här beskrivs protokoll för isolering av cyanobakterial som frigörs kolhydratpolymerer och isolering av deras exoproteomes. Båda procedurerna förkroppsligar viktiga steg för att få polymerer eller proteiner med hög renhetsgrad som kan användas för ytterligare analys eller tillämpningar. De kan också enkelt anpassas efter specifika användarbehov.
Abstract
Cyanobakterier kan aktivt utsöndra ett brett spektrum av biomolekyler i den extracellulära miljön, såsom heteropolysackarider och proteiner. Identifieringen och karakteriseringen av dessa biomolekyler kan förbättra kunskapen om deras utsöndringen vägar och hjälpa till att manipulera dem. Dessutom är några av dessa biomolekyler också intressanta när det gäller bioteknologiska tillämpningar. Här beskrivs två protokoll för enkel och snabb isolering av cyanobakterial utsläppt kolhydrat polymerer och proteiner. Metoden för isolering av frisläppt kolhydrat polymerer är baserad på konventionella nederbördstekniker av polysackarider i vattenlösningar med organiska lösningsmedel. Denna metod bevarar polymerens egenskaper och undviker samtidigt närvaron av föroreningar från Cellrester och odlingssubstrat. I slutet av processen, den frystorkade polymeren är redo att användas eller kännetecknas eller kan utsättas för ytterligare omgångar av rening, beroende på den slutliga avsedda användningen. När det gäller isoleringen av cyanobakterial exoproteome är tekniken baserad på koncentrationen av det cell fria mediet efter avlägsnande av de stora föroreningarna genom centrifugering och filtrering. Denna strategi möjliggör tillförlitlig isolering av proteiner som når den extracellulära miljö via membran transportörer eller yttre membran blåsor. Dessa proteiner kan därefter identifieras med hjälp av standardmasspektrometritekniker. De protokoll som presenteras här kan inte bara tillämpas på ett brett spektrum av cyanobakterier, utan även på andra bakteriestammar. Dessutom kan dessa förfaranden lätt anpassas efter den slutliga användningen av produkterna, renhetsgrad som krävs, och bakteriestam.
Introduction
Cyanobakterier är allmänt erkända som produktiva källor av naturliga produkter med lovande bioteknologiska/biomedicinska tillämpningar. Därför är det viktigt att förstå cyanobakteriala sekretionsmekanismer och optimering av utvinnings-och återvinningsmetoderna för att kunna implementera cyklo-terier som effektiva mikrobiella cell fabriker.
Många cyanobakterial stammar kan producera extracellulära polymera ämnen (EPS), huvudsakligen bildas av heteropolysackarider, som förblir associerade till cellytan eller släpps ut i mediet1. Dessa frigörs kolhydrat polymerer har distinkta funktioner jämfört med de från andra bakterier, som gör dem lämpliga för ett brett spektrum av tillämpningar (t. ex., antivirala läkemedel2, immunstimulerande3, antioxidant4, Metal-Kelating5, emulgering6, och Drug Delivery agenter7,8). Metod för isolering av dessa polymerer bidrar till stor del inte bara till förbättrad avkastning utan också till ökad renhet och de specifika fysikaliska egenskaperna hos den polymer som erhålls9. En stor majoritet av dessa metoder för isolering av polymererna förlitar sig på nederbördsstrategier från odlingsmediet som lätt kan åstadkommas på grund av polymerens starka anjonnatur9,10. Dessutom kan avlägsnande av lösningsmedel som används i nederbörden steg snabbt uppnås genom avdunstning och/eller frystorkade. Beroende på den planerade appliceringen kan olika steg kopplas antingen efter eller före polymernederbörd för att skräddarsy slutprodukten, som omfattar behandling med triklorättiksyra (TCA), filtrering eller kromatografi av storlek (SEC) kolumn rening10.
Cyanobakterier kan också utsöndra ett brett spektrum av proteiner genom vägar som är beroende av membran transportörer (klassisk)11 eller medieras av vesikler (icke-klassisk)12. Därför är analys av cyanobakterial exoproteome ett viktigt verktyg, både för att förstå/manipulera cyanobakterial proteinutsöndringen mekanismer och förstå den specifika extracellulära funktionen av dessa proteiner. Tillförlitlig isolering och analys av exoproteomes kräver koncentrationen av den extracellulära miljön, eftersom överflödet av utsöndras proteiner är relativt lågt. Dessutom kan andra fysikaliska eller kemiska steg (t. ex. centrifugering, filtrering eller protein nederbörd) optimera kvaliteten på det exoproteome som erhålls, berika proteinhalten13och undvika förekomst av föroreningar (t. ex. pigment, kolhydrater, etc.) fjorton , 15 eller dominans av intracellulära proteiner i proverna. Men vissa av dessa steg kan också begränsa den uppsättning proteiner som kan upptäckas, vilket leder till en partisk analys.
Detta arbete beskriver effektiva protokoll för isolering av utsläppt kolhydrat polymerer och exoproteomes från cyanobakterier odlingsmedier. Dessa protokoll kan lätt anpassas till studiens specifika mål och användarbehov, samtidigt som de grundläggande stegen som presenteras här.
Protocol
Representative Results
Discussion
För att bättre förstå bakteriella sekretionsmekanismer och studera de frisläppta produkterna, är det av yttersta vikt att demonstrera effektiv isolering och analys av biomolekyler som finns i den extracellulära bakteriella miljön (såsom utsläppt kolhydrat polymerer och proteiner).
Cyanobakterial extracellulära kolhydrat polymerer är extremt komplexa, främst på grund av antalet och andelen olika monosackarider som utgör deras sammansättning1. De konventio…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete finansierades av Fundo europeu de Desenvolvimento regional (FEDER) medel genom att konkurrera 2020-Operacional program för konkurrenskraft och internationalisering (POCI), Portugal 2020, och av portugisiska fonder genom FCT-Fundação para a Ciência e en Tecnologia/Ministério da Ciência, Tecnologia e ensino överlägsen inom ramen för projektet POCI-01-0145-FEDER-028779 och Grant SFRH/BD/99715/2014 (CF).
Materials
| Dialysis membranes | Medicell Membranes Ltd | DTV.12000.07 | Visking Tubing Size 7, Dia 23.8 mm, Width 39-41 mm 30m Roll |
| Ethanol 96% | AGA – Álcool e Géneros Alimentares, S.A. | 4.000.02.02.00 | Fermentation ethyl alcohol 96% AGA |
| PES Filter 0.2 μm | Fisher Scientific, Lda | 15206869 | Syringe filter polystyrene 33MM 0.2µM STR |
| Amicon Ultra-15, Ultracel-3K | Merck Millipore Ltd. | UFC900324 | Centrifugal filters with a nominal molecular weight cut-off of 3 kDa |
| Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay | Fisher Scientific, Lda | 10741395 | Green-to-blue, precise, detergent-compatible assay reagent to measure total protein concentration |
| Brillant Blue G Colloidal Concentrate | Sigma Aldrich Química SL | B2025-1EA | Coomassie blue |
References
- Pereira, S., et al. Complexity of cyanobacterial exopolysaccharides: composition, structures, inducing factors and putative genes involved in their biosynthesis and assembly. FEMS Microbiology Reviews. 33 (5), 917-941 (2009).
- Kanekiyo, K., et al. Isolation of an Antiviral Polysaccharide, Nostoflan, from a Terrestrial Cyanobacterium, Nostoc flagelliforme. Journal of Natural Products. 68 (7), 1037-1041 (2005).
- Løbner, M., Walsted, A., Larsen, R., Bendtzen, K., Nielsen, C. H. Enhancement of human adaptive immune responses by administration of a high-molecular-weight polysaccharide extract from the cyanobacterium Arthrospira platensis. Journal of Medicinal Food. 11 (2), 313-322 (2008).
- Wang, H. B., Wu, S. J., Liu, D. Preparation of polysaccharides from cyanobacteria Nostoc commune and their antioxidant activities. Carbohydrate Polymers. 99, 553-555 (2014).
- Ozturk, S., Aslim, B., Suludere, Z., Tan, S. Metal removal of cyanobacterial exopolysaccharides by uronic acid content and monosaccharide composition. Carbohydrate Polymers. 101, 265-271 (2014).
- Han, P. P., et al. Emulsifying, flocculating, and physicochemical properties of exopolysaccharide produced by cyanobacterium Nostoc flagelliforme. Applied Biochemistry and Biotechnology. 172 (1), 36-49 (2014).
- Leite, J. P., et al. Cyanobacterium‐Derived Extracellular Carbohydrate Polymer for the Controlled Delivery of Functional Proteins. Macromolecular Bioscience. 17 (2), 1600206 (2017).
- Estevinho, B. N., et al. Application of a cyanobacterial extracellular polymeric substance in the microencapsulation of vitamin B12. Powder Technology. 343, 644-651 (2019).
- Klock, J. H., Wieland, A., Seifert, R., Michaelis, W. Extracellular polymeric substances (EPS) from cyanobacterial mats: characterisation and isolation method optimisation. Marine Biology. 152 (5), 1077-1085 (2007).
- Delattre, C., Pierre, G., Laroche, C., Michaud, P. Production, extraction and characterization of microalgal and cyanobacterial exopolysaccharides. Biotechnology Advances. 34 (7), 1159-1179 (2016).
- Costa, T. R., et al. Secretion systems in gram-negative bacteria: structural and mechanistic insights. Nature Reviews Microbiology. 13 (6), 343-359 (2015).
- Roier, S., Zingl, F. G., Cakar, F., Schild, S. Bacterial outer membrane vesicle biogenesis: a new mechanism and its implications. Microbial Cell. 3 (6), 257-259 (2016).
- Sergeyenko, T. V., Los, D. A. Identification of secreted proteins of the cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC 6803. FEMS Microbiology Letters. 193 (2), 213-216 (2000).
- Oliveira, P., et al. The versatile TolC-like Slr1270 in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Environmental Microbiology. 18 (2), 486-502 (2016).
- Flores, C., et al. The alternative sigma factor SigF is a key player in the control of secretion mechanisms in Synechocystis sp. PCC 6803. Environmental Microbiology. 21 (1), 343-359 (2018).
- Dubois, M., Gilles, K. A., Hamilton, J. K., Rebers, P. A., Smith, F. Colorimetric method for determination of sugars and related substances. Analytical Chemistry. 28 (3), 350-356 (1956).
- Parikh, A., Madamwar, D. Partial characterization of extracellular polysaccharides from cyanobacteria. Bioresource Technology. 97 (15), 1822-1827 (2006).
- Rühmann, B., Schmid, J., Sieber, V. Methods to identify the unexplored diversity of microbial exopolysaccharides. Frontiers in Microbiology. 6, 565 (2015).
- Pathak, J., Rajneesh, R., Sonker, A. S., Kannaujiya, V. K., Sinha, R. P. Cyanobacterial extracellular polysaccharide sheath pigment, scytonemin: A novel multipurpose pharmacophore. Marine Glycobiology. , 343-358 (2016).
- Nguyen, A. T. B., et al. Performances of different protocols for exocellular polysaccharides extraction from milk acid gels: Application to yogurt. Food Chemistry. 239, 742-750 (2018).
- Jamshidian, H., Shojaosadati, S. A., Mousavi, S. M., Soudi, M. R., Vilaplana, F. Implications of recovery procedures on structural and rheological properties of schizophyllan produced from date syrup. International Journal of Biological Macromolecules. 105, 36-44 (2017).
- Couto, N., Schooling, S. R., Dutcher, J. R., Barber, J. Proteome profiles of outer membrane vesicles and extracellular matrix of Pseudomonas aeruginosa biofilms. Journal of Proteome Research. 14 (10), 4207-4222 (2015).
