Análise Citométrica de fluxo de espécies reativas de oxigênio mitocondrial em células tronco e progenitoras hematopoiéticas Murinas e leucemia acionada por MLL-AF9
Summary
Nós descrevemos um método para usar a citometria do fluxo do multiparâmetro para detectar a espécie reactiva mitochondrial do oxigênio (ROS) em pilhas hematopoietic saudáveis murino da haste e do progenitor (hspcs) e nas pilhas da leucemia de um modelo do rato da leucemia Myeloid aguda (AML) conduzida por MLL-AF9.
Abstract
Nós apresentamos uma aproximação cytometric do do fluxo para analisar ROS mitochondrial na vária medula viva (BM)-populações derivadas da pilha da haste e do progenitor dos ratos saudáveis assim como ratos com AML conduzido por MLL-AF9. Especificamente, nós descrevemos um processo de coloração da pilha de duas etapas, por meio de que as pilhas saudáveis ou da leucemia BM são manchadas primeiramente com um corante cromogênicos fluorogênicos que detecte superóxidos mitochondrial, seguidos manchando com os anticorpos monoclonais fluorochrome-lig que são usados para distinguir várias populações hematopoiéticas saudáveis e malignas do progenitor. Também fornecemos uma estratégia para a aquisição e análise das amostras por citometria de fluxo. Todo o protocolo pode ser realizado em um prazo tão curto quanto 3-4 h. Destacamos, também, as principais variáveis a serem consideradas, bem como as vantagens e limitações do monitoramento da produção de Eros no compartimento mitocondrial de subpopulações hematopoiéticas e de leucemia de tronco e progenitoras ao vivo, utilizando corantes fluorogênicos por citometria de fluxo . Além disso, nós apresentamos dados que a abundância mitochondrial dos Ros varia entre subpopulações saudáveis distintas do hspc e progenitores da leucemia e discutimos as aplicações possíveis desta técnica na pesquisa hematológicas.
Introduction
Espécies reativas de oxigênio (ROS) são moléculas altamente reativas derivadas de oxigênio molecular. A localização celular mais bem definida da produção de Eros é a mitocôndria, onde elétrons que passam pela cadeia de transporte de elétrons (ETC) durante a fosforilação oxidativa (OXPHOS) são absorvidos por oxigênio molecular, levando à formação de um específico tipo de ROS denominados superóxidos1. Através das ações de uma série de enzimas, chamadas superóxido superóxido ou Sods, os superóxidos são convertidos em peróxidos de hidrogênio, que são posteriormente neutralizados em água por enzimas como catalase ou glutationa peroxidases (GPX). Perturbações nos mecanismos de regulamentação de ROS podem levar ao excesso de produção de Eros, muitas vezes referido como estresse oxidativo, que têm conseqüências celulares prejudiciais e potencialmente letais, como danos de macromoléculas (ou seja, DNA, proteínas, lipídios). Além disso, o estresse oxidativo está relacionado a diversas patologias, como diabetes, doenças inflamatórias, envelhecimento e tumores2,3,4. Para manter a homeostase redox e prevenir o estresse oxidativo, as células possuem uma variedade de mecanismos de regulação de ROS5.
Os níveis fisiológicos de certas Eros são necessários para a hematopoiese embrionária e adulta adequada6. No entanto, o excesso de Eros está associado a danos no DNA, diferenciação celular e exaustão da haste hematopoiética e do grupo progenitor. Há também evidências de que alterações na biologia redox podem diferir entre leucemia e células saudáveis. Por exemplo, os níveis de Ros tendem a ser mais elevados em células de leucemia mielóide aguda (AML) em relação aos seus homólogos saudáveis e outros estudos sugeriram que as células-tronco de leucemia mantêm um baixo nível de estado estacionário de Ros para a sobrevivência7,8. É importante ressaltar que as estratégias para capitalizar terapeuticamente nessas diferenças redox mostraram-se promissora em váriasconfigurações de câncerhumano9,10. Portanto, os ensaios que permitem a avaliação dos níveis de Eros em modelos de camundongo podem melhorar nossa compreensão de como essas espécies contribuem para a fisiologia celular e a patogênese da doença, bem como potencialmente fornecem uma plataforma para avaliar a eficácia da novo redox-visando terapias anti-câncer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Corantes fluorogênicos que foram desenvolvidos para a detecção de Eros são freqüentemente avaliados em células fixas por microscopia ou em células ao vivo por citometria de fluxo22. A avaliação citométrica do fluxo de Ros mitochondrial em pilhas de BM usando tinturas cromogênicos fluorogênicos mitocondrial dos Ros tem duas vantagens principais: 1) é uma técnica rápida e simples que seja apropriada para a análise viva da pilha e 2) permite distinguir e analisar raro populações no …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo Fox Chase Cancer Center Conselho de administração (DDM), a sociedade americana de Hematologia Scholar Award (SMS), American Cancer Society RSG (SMS) e do departamento de defesa (Award #: W81XWH-18-1-0472).
Materials
| Heat inactivated FBS | VWR Seradigm LIFE SCIENCE | 97068-085 | Media |
| Penicillin Streptomycin | Corning | 30-002-CI | Media |
| PBS | Fisher Scientific | BP399-20 | Buffer |
| 15 mL conical tube | BD falcon | 352096 | Tissue Culture Supplies |
| 50 mL conical tube | BD falcon | 352098 | Tissue Culture Supplies |
| 40 μm cell strainers | Fisher Scientific | 22-363-547 | Tissue Culture Supplies |
| RBC Lysis Buffer | Fisher Scientific | 50-112-9751 | Tissue Culture Supplies |
| Menadione sodium Bisulfite | Sigma aldrich | M5750 | Pro-oxidant |
| NAC | Sigma aldrich | A7250 | Anti-oxidant |
| CD3 PE-Cy5 clone 145-2c11 | Biolegend | 100310 | Antibody |
| CD4 PE-Cy5 clone RM4-5 | eBioscience | 15-0041-81 | Antibody |
| CD8 PE-Cy5 clone 53-6.7 | eBioscience | 15-0081-81 | Antibody |
| CD19 PE-Cy5 clone 6D5 | Biolegend | 115510 | Antibody |
| B220 PE-Cy5 clone RA3-6B2 | Biolegend | 103210 | Antibody |
| Gr1 PE-Cy5 clone RB6-8C5 | Biolegend | 108410 | Antibody |
| Ter119 PE-Cy5 clone Ter-119 | Biolegend | 116210 | Antibody |
| CD48 PE-Cy5 clone HM48-1 | Biolegend | 103420 | Antibody |
| CD117 APC-Cy7 clone 2B8 | Biolegend | 105825 | Antibody |
| Sca1 peacific Blue clone D7 | Biolegend | 108120 | Antibody |
| CD150 APC clone TC15-12F12.2 | Biolegend | 115909 | Antibody |
| CD34 FITC clone RAM34 | BD Bioscience | 553733 | Antibody |
| CD45.2 APC clone 104 | Biolegend | 1098313 | Antibody |
| MitoSOX Red | ThermoFisher Scientific | M36008 | Dye |
| Mitotracker Green | ThermoFisher Scientific | M7514 | Dye |
| Live/dead Yellow Dye | ThermoFisher Scientific | L34967 | Dye |
References
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