उत्तेजित रमन तितर बितर के आधार पर एक गैर रेखीय माइक्रोस्कोप का कार्यान्वयन
Summary
इस पांडुलिपि में, एक प्रेरित रमन प्रकीर्णन (एसआरएस) माइक्रोस्कोप के कार्यान्वयन, एक लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप के साथ एक एसआरएस प्रयोगात्मक सेट अप के एकीकरण द्वारा प्राप्त, वर्णित है. एसआरएस माइक्रोस्कोप दो femtosecond (एफ एस) लेजर स्रोतों, एक Ti-Sapphire (Ti:Sa) और सिंक्रनाइज़ ऑप्टिकल पैरामीट्रिक थरथरानवाला (OPO) पर आधारित है।
Abstract
उत्तेजित रमन प्रकीर्णन (एसआरएस) माइक्रोस्कोपी के पास-इन्फ्रारेड उत्तेजना प्रकाश का उपयोग करता है; इसलिए, यह कई बहु-फोटोन सूक्ष्म इमेजिंग गुण साझा करता है। एसआरएस इमेजिंग मोडलिटी उचित bandpass फिल्टर और लॉक-इन एम्पलीफायर (LIA) का पता लगाने की योजना के साथ एक गैर-descanned आगे डिटेक्टर के साथ लैस द्वारा वाणिज्यिक लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है। एक ठेठ एसआरएस माइक्रोस्कोप के एक योजनाबद्ध लेआउट निम्नलिखित शामिल हैं: दो स्पंदित लेजर बीम, (यानी, पंप और जांच एक स्कैनिंग माइक्रोस्कोप में निर्देशित), जो दोनों अंतरिक्ष और समय में छवि विमान में ओवरलैप किया जाना चाहिए, तो में एक माइक्रोस्कोप उद्देश्य से ध्यान केंद्रित दो स्कैनिंग दर्पण (एस एम) के माध्यम से नमूना है, जो एक x-y विमान भर में फोकल स्पॉट raster. नमूने के साथ बातचीत के बाद, प्रेषित उत्पादन दालों एक ऊपरी उद्देश्य द्वारा एकत्र कर रहे हैं और एक उलटा माइक्रोस्कोप में डाला एक आगे का पता लगाने प्रणाली द्वारा मापा. पंप दालों ऑप्टिकल फिल्टर के एक ढेर द्वारा हटा रहे हैं, जबकि जांच दालों कि एसआरएस नमूना के फोकल मात्रा में होने वाली प्रक्रिया का परिणाम हैं एक photodiod (पीडी) द्वारा मापा जाता है. पीडी के readout मॉडुलन गहराई निकालने के लिए LIA द्वारा demodulated है. एक द्वि-आयामी (2डी) छवि माइक्रोस्कोप स्कैनिंग इकाई के साथ आगे का पता लगाने इकाई तुल्यकालन द्वारा प्राप्त की है. इस पत्र में, एक एसआरएस माइक्रोस्कोप के कार्यान्वयन का वर्णन किया गया है और सफलतापूर्वक प्रदर्शन किया है, साथ ही 3 डिग्री मीटर के व्यास के साथ polystyrene मोती के लेबल मुक्त छवियों की रिपोर्टिंग. यह ध्यान देने योग्य है कि एसआरएस माइक्रोस्कोप व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नहीं हैं लायक है, इसलिए इन विशेषताओं का लाभ लेने के लिए, घर का निर्माण एकमात्र विकल्प है। चूंकि एसआरएस माइक्रोस्कोपी कई क्षेत्रों में लोकप्रिय हो रहा है, यह माना जाता है कि एसआरएस माइक्रोस्कोप कार्यान्वयन के इस सावधान विवरण वैज्ञानिक समुदाय के लिए बहुत उपयोगी हो सकता है.
Introduction
जीवन विज्ञान अनुप्रयोगों में, एसआरएस माइक्रोस्कोपी लेबल मुक्त इमेजिंग के लिए शक्तिशाली उपकरण के रूप में उभरा है। एसआरएस माइक्रोस्कोपी का मूल विचार कंपन विपरीत की ताकत और कुछ ही सेकंड में छवियों को प्राप्त करने की क्षमता को संयोजित करने के लिए है।
एसआरएस एक प्रक्रिया है जिसमें दो लेजर बीम आवृत्तियों के बीच आवृत्ति अंतर (विभिन्न आवृत्तियों पर पंप संकेत और स्टोक्स संकेत) एक जांच नमूने के आणविक कंपन से मेल खाता है, जिससे रमन प्रकीर्णन और एक महत्वपूर्ण स्टोक्स संकेत में वृद्धि. रैखिक रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी के विपरीत, एसआरएस आने वाले प्रकाश क्षेत्रों पर एक nonlinear निर्भरता दर्शाती है और सुसंगत विकिरण पैदा करता है. एसआरएस के दो बुनियादी फायदे हैं: 1) गति, जो छवियों को नमूना आंदोलन या गिरावट से उत्पन्न होने वाली कलाकृतियों के प्रति कम संवेदनशील बनाती है, और 2) एक उत्कृष्ट संकेत-से-शोर अनुपात (एसआरएन)। इसके अलावा, एसआरएस सहज रमन के समान स्पेक्ट्रम दर्शाती है, और एसआरएस संकेत रैखिक रूप से रासायनिक बंधन की एकाग्रता के लिए आनुपातिक है उत्साहित1,2,3,4, 5.
हमारे सूक्ष्मदर्शी में, एक फेमोसेकंड (एफएस) एसआरएस प्रायोगिक व्यवस्था को एक उल्टे ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के साथ एकीकृत किया जाता है जो एक तीव्र दर्पण स्कैनिंग इकाई से सुसज्जित होता है (चित्र 1)6,7,8. इस सूक्ष्मदर्शी को कार्यान्वित करने के लिए दो स्पंदित लेजर स्रोतों का उपयोग किया जाता है। पहले एक fs-Ti:Sa लगभग 140 fs की एक पल्स अवधि के साथ, 80 मेगाहर्ट्ज की पुनरावृत्ति दर, और 680-1080 एनएम की सीमा में उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य है. दूसरा, जांच बीम के रूप में इस्तेमाल किया और Ti:Sa द्वारा पंप, एक femtosecond सिंक्रनाइज़ ऑप्टिकल पैरामीट्रिक थरथरानवाला (SOPO), लगभग 200 fs की एक पल्स अवधि के साथ, 80 मेगाहर्ट्ज की पुनरावृत्ति दर, और उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य की सीमा में 1000-1600 एनएम. यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि ती:सा और SOPO बीम के बीचन्यूनतम फोटॉन ऊर्जा अंतर 2500 से.मी. इसलिए, लेजर सिस्टम के इस संयोजन का उपयोग करते हुए, केवल उच्च आवृत्ति सी-एच क्षेत्र (2800-3200 सेमी-1)रमन स्पेक्ट्रम के6,7,8का पता लगाया जा सकता है।
आदेश में एक एसआरएस माइक्रोस्कोप स्थापित करने के लिए, वहाँ तीन महत्वपूर्ण मुद्दों पर विचार करने के लिए कर रहे हैं, जो क्रमिक पैराग्राफ में वर्णित हैं. पहले एक उच्च आवृत्ति मॉडुलन स्थानांतरण विधि का कार्यान्वयन है (एक विवरण के लिए प्रोटोकॉल के चित्र 2 और चरण 2.1 देखें).। एक एसआरएस प्रयोगात्मक जांच में, एक महत्वपूर्ण पैरामीटर प्रणाली की संवेदनशीलता है. एक एसआरएस संकेत उत्तेजना बीम की तीव्रता में एक छोटे से परिवर्तन के रूप में पता चला है; इसलिए, यह लेजर तीव्रता शोर और शॉट शोर से भ्रष्ट किया जा सकता है। इस समस्या को एक उच्च आवृत्ति मॉडुलन स्थानांतरण विधि के साथ इस प्रणाली को एकीकृत करके दूर किया जा सकता है (विवरण के लिए प्रोटोकॉल के चित्र 2 और चरण 2.1 देखें).। इस विधि में, पंप को व्यवस्थित करने के लिए इलेक्ट्रो-ऑप्टिक न्यूनाधिक (ईओएम) का उपयोग किया जाता है। जांच बीम करने के लिए स्थानांतरित मॉडुलन तो ऑप्टिकल फिल्टर के एक ढेर के साथ पंप बीम अवरुद्ध करने के बाद एक पीडी द्वारा पता लगाया जा सकता है [उत्तेजित रमन लाभ (एसआरजी) का पता लगाने मोड]. पीडी उत्पादन एक लॉक-इन एम्पलीफायर (एलआईए) के लिए एक कम पास फिल्टर से जुड़ा हुआ है, जो मापा संकेत demodulates. 1 मेगाहर्ट्ज से ऊपर आवृत्तियों के लिए बीम के मॉडुलन आवृत्ति में वृद्धि करके, PDs की आंतरिक सीमा प्राप्त किया जा सकता है.
विचार करने के लिए दूसरा मुद्दा एक यांत्रिक माउंट की स्थापना है जो आगे का पता लगाने के लिए और एक ही समय में उज्ज्वल क्षेत्र में माइक्रोस्कोप अवलोकन को बनाए रखने के लिए परमिट. इसके अतिरिक्त, छवियों के उत्पादन के दौरान यांत्रिक कंपन के कारण शोर को कम करना होगा और पता लगाने प्रणाली की सटीक स्थिति को अनुमति देनी होगी (चित्र 3 और प्रोटोकॉल के चरण 2-2 देखें)।
तीसरा चरण के प्रति संवेदनशील पता लगाने की योजना द्वारा प्राप्त संकेत का तुल्यकालन है, माइक्रोस्कोप के स्कैन सिर द्वारा निगरानी नमूने पर तैनात बीम के साथ। आदेश में छवियों का एहसास करने के लिए, एसएमएस तीन TTL संकेत है कि माइक्रोस्कोप नियंत्रक स्कैन सिर इकाई से जुड़े द्वारा उपलब्ध कराया जाता है की आवश्यकता होती है: पिक्सेल घड़ी, लाइन सिंक, और फ्रेम सिंक. तुल्यकालन एक PCI कार्ड का उपयोग कर नियंत्रित करने के द्वारा हासिल की है, तीन TTL संकेत, और LIA6,7,8के उत्पादन चैनल पर एक वोल्टेज संकेत के अधिग्रहण. एक घर का बना सॉफ्टवेयर विकसित किया गया है और पहले6,7,8का वर्णन किया गया है , जबकि तुल्यकालन प्रणाली के हार्डवेयर चित्र 4में रिपोर्ट किया गया है .
एसआरएस इमेजिंग करते समय एक मौलिक प्रक्रिया सूक्ष्मदर्शी संरेखण है। यह चार चरणों के पाठ्यक्रम पर महसूस किया जाता है, जो क्रमिक पैराग्राफ में वर्णित हैं। पहले दो बीम के स्थानिक ओवरलैप है (प्रोटोकॉल के चरण 3.1 देखें).। इस प्रयोगात्मक सेट-अप में, दो बीम एक द्विवर्णीय दर्पण द्वारा स्थानिक रूप से कोलिनी द्वारा संयोजित किए गए थे। प्रारंभिक कदम OPO और Ti:Sa का संरेखण है ताकि प्रत्येक माइक्रोस्कोप तक पहुँचता है. फिर, एक संदर्भ बीम के रूप में ओपीओ पर विचार और एक स्थिति संवेदनशील डिटेक्टर का लाभ लेने, ती:Sa स्थानिक रूप से OPO के लिए ओवरलैप है.
दूसरा महत्वपूर्ण पहलू दो बीम के अस्थायी ओवरलैप है (प्रोटोकॉल के चरण 3.2 देखें)। यहां तक कि अगर पंप और OPO बीम पूरी तरह से सिंक्रनाइज़ कर रहे हैं9, क्योंकि वे OPO आवास के अंदर थोड़ा अलग बीम रास्तों का पालन करें, OPO निकास पर वे के बारे में 5 एन और 5 सेमी के स्थानिक अंतर का एक समय देरी है. इसलिए, Ti:Sa और OPO नमूना पर अस्थायी ओवरलैप सुनिश्चित करने के लिए ऑप्टिकली फिर से समय की आवश्यकता है. यह आम तौर पर एक पतले टूनाबल ऑप्टिकल विलंब लाइन के साथ पूरा किया जाता है, जो इस मामले में ती:सा और माइक्रोस्कोप के बीच डाला जाता है (चित्र 1देखें)। दो बीमों के अस्थायी अतिव्यापन को प्राप्त करने के लिए दो तकनीकों का उपयोग किया जाता है। पहला एक तेजी से पीडी और आस्टसीलस्कप का उपयोग कर के बाहर किया जाता है, जबकि दूसरा ऑटो और पार ऑप्टिकल सहसंबंध पर आधारित है. पहली तकनीक का उपयोग करना, दो बीम के किसी न किसी ओवरलैप प्राप्त किया है (10 ps की अनिश्चितता), जबकि दो बीम का एक सटीक अस्थायी ओवरलैप एक क्रॉस-कोरेलेटर का उपयोग कर प्राप्त किया जाता है (1 fs का संकल्प).
तीसरा महत्वपूर्ण पहलू माइक्रोस्कोप के अंदर दो बीम का संरेखण है (प्रोटोकॉल के चरण 3.3 देखें)। नमूने का एक प्रारंभिक सफेद प्रकाश अवलोकन देखने के वांछित क्षेत्र individuate करने के लिए अनुमति देता है (FOV). बाद में, माइक्रोस्कोप के एक किनारे के पोर्ट द्वारा माइक्रोस्कोप में प्रवेश करने वाले लेजर बीम, ऊपरी भाग पर लगे पीडी तक पहुंचने के लिए संरेखित होते हैं (चित्र3)। हालांकि, एक सही छवि प्राप्ति के लिए, कई पैरामीटर सेट करना आवश्यक है (उदाहरण के लिए, पिक्सेल आयाम और पिक्सेल रहने का समय). नमूना आवृत्ति एक छवि में सभी जानकारी की रक्षा के क्रम में NyQuist के प्रमेय द्वारा लगाए गए प्रतिबंध का सम्मान करना चाहिए, जबकि पिक्सल और एसआरएस प्रत्येक पिक्सेल में मापा मूल्य के स्थानिक निर्देशांक के बीच एक सही पत्राचार के लिए, एकीकरण समय LIA के बराबर या पिक्सेल रहने के समय के लिए तुलनीय होना चाहिए.
माइक्रोस्कोप संरेखण के अंतिम चरण में, स्थानिक और लौकिक संरेखण को अनुकूलित करने के लिए कई परीक्षण किए जाते हैं (प्रोटोकॉल के चरण 3.4 देखें)। दोनों Ti:Sa और OPO के लिए संचरण छवियों (TI) के एक नंबर स्थानिक ओवरलैप अनुकूलन करने के लिए अधिग्रहण कर रहे हैं. एक टीआई में, एक एकल बीम का उपयोग किया जाता है, और नमूने से संचारित बीम तीव्रता एक पीडी द्वारा मापा जाता है। OPO द्वारा महसूस की TI के मामले में, पीडी आउटपुट संकेत सीधे PCI कार्ड से जुड़ा है, जबकि Ti के मामले में TI:Sa द्वारा महसूस किया, पीडी आउटपुट संकेत LIA से जुड़ा है और LIA के अनुरूप उत्पादन PCI कार्ड से जुड़ा है. संचरण छवियों FOV, रोशनी, माइक्रोस्कोप उद्देश्यों की फोकल स्थिति का अनुकूलन करने के लिए और अगर दो बीम स्थानिक रूप से ओवरलैप6,7,8की जाँच करने के लिए बहुत उपयोगी होते हैं।
पंप और जांच बीम के अस्थायी ओवरलैप का अनुकूलन 0.001 मिमी के चरणों के साथ देरी लाइन स्कैनिंग द्वारा प्राप्त किया जाता है जो 3.3 एफएस समय-पारी के अनुरूप है और एक एसआरएस माप को एक पॉलीस्टाइरीन मनका नमूना के एक बिंदु में ले जा रहा है 3 मीटर व्यास में। एक एसआरएस संकेत के आयाम LIA से मूल्यों के उपाय, जांच पंप देरी के एक समारोह के रूप में,और दो बीम 6,7,8के सटीक लौकिक ओवरलैप के साथ एक अधिकतम इसी प्रदान करता है. समापन से पहले, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि सभी चर्चा कदम एक उच्च गुणवत्ता छवि प्राप्त करने के लिए अनिवार्य हैं.
Protocol
Representative Results
Discussion
एसआरएस माइक्रोस्कोपी ने लेबल-मुक्त इमेजिंग को नई ऊंचाइयों पर ले लिया है, विशेष रूप से लिपिड जैसे जटिल जैविक संरचनाओं के अध्ययन में, जो कोशिकाओं और सेलुलर वास्तुकला के लिए मौलिक हैं। लिपिड कई शारीरिक र?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम अपने मूल्यवान तकनीकी सहायता और Giacomo Cozzi, Nikon उपकरण से उत्पाद विशेषज्ञ, उपयोगी विचार विमर्श और निरंतर समर्थन के लिए के लिए आई एम एम सीएनआर से वी Tufano की सराहना करते हैं. यह काम आंशिक रूप से इतालवी राष्ट्रीय ऑपरेटिव कार्यक्रम PONa3 00025 (BIOforIU) और यूरो द्वारा बड़े पैमाने पर panEuropean अनुसंधान बुनियादी ढांचा परियोजना द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| Acquisation tool | Nikon | Nikon C2Tool | Acquisation supported tool |
| APE Pulse link control software | APE- | APE Pulse link control software | software control |
| Autocorrelator | APE | APE PulseCheck USB 50 | Autocorrelator |
| Detector | Thorlabs | Thorlabs DET10A | Photodiode |
| Detector card | Thorlabs | Thorlabs VRC | IR detector Card |
| Dichroic mirror | Semrock | Semrock FF875-Di01-25X36 | Dichroic mirror |
| Dichroic mirror | Semrock | FF875-Di01-25×36 | Dichroic mirror |
| EOM | Conoptics | (EOM CONOPTICS 3350-160 KD*P). | Pockels cell |
| Fast detector | Thorlabs | Thorlabs DET025AL/M | Photodiode |
| Fast mirror scanning unit | Nikon | C2 | Microscpe scanning head |
| Femtosecond laser Ti:SA | Coherent | Coherent Chameleon Ultra II | Chameleon Ultra II |
| Function generator | TTi | TG5011 AIM – TTi | Function generator |
| Inverted optical microscope | Nikon | Eclipse TE-2000-E, Nikon | Eclipse TE-2000-E, Nikon |
| Lock-in Amplifier | Standford Research System | SR844-200 MHz dual phase | A lock-in amplifier from Stanford Research Systems |
| Notch filter, | Semrock | NF03-808E-25 | Notch filter |
| Optical delay line | Newport | Newport M-ILS200CC | Tunable optical delay line |
| Optical Parametric Oscillator | Coherent | Coherent Compact OPO | Coherent Compact OPO |
| Oscilloscope | WaveRunner | 640Zi 4GHz OSC/LeCroy | Digital Oscilloscope |
| PCI Card | National instrument | NI PCIe 6363 | Data acquisation card |
| Position Sensors Detectors | Newport | Newport Conex PSD9 | Position detector sensor |
| Power meter head | Coherent | PowerMax PM10, | Laser power detector |
| Translation Stages | Thorlabs | Thorlabs PT1/M | Meachnical Translation Stage with Standard Micrometer |
References
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