In Vitro Transcribed RNA-basierter Luciferase Reporter Assay to Study Translation Regulation in Poxvirus-infizierten Zellen
Summary
Wir legen ein Protokoll vor, um die mRNA-Übersetzungsverordnung in poxvirus-infizierten Zellen zu untersuchen, die in vitro Transcribed RNA-based luciferase reporter Assay verwendet werden. Der Test kann für das Studium der Übersetzungsregulierung durch cis-Elemente einer mRNA verwendet werden, einschließlich 5 ‘-unübersetzter Region (UTR) und 3 ‘-UTR. Mit dieser Methode können auch verschiedene Übersetzungsinitiationsmodi untersucht werden.
Abstract
Jedes Poxvirus mRNA, das nach der viralen DNA-Replikation transkribiert wurde, hat einen evolutionär konservierten, nicht temperierten 5 ‘-poly (A)-Anführer im 5 ‘-UTR. Um die Rolle des 5 ‘-Poly (A)-Anführers in der mRNA-Übersetzung während der Poxvirus-Infektion zu zerlegen, haben wir einen in vitro transkribierten RNA-basierten Lluciferase-Reporter-Test entwickelt. Dieser Reporter-Test besteht aus vier Kernschritten: (1) PCR zur Verstärkung der DNA-Vorlage für die In-vitro-Transkription; (2) In-vitro-Transkription zur Erzeugung von mRNA mit T7-RNA Polymerase; (3) Transfection zur Einführung in vitro transkribierte mRNA in Zellen; (4) Erkennung der Luciferase-Aktivität als Indikator für die Übersetzung. Der hier beschriebene RNA-basierte Luciferase-Reporter-Test umgeht Probleme der Plasmid-Replikation in poxvirusinfizierten Zellen und kryptischer Transkription aus dem Plasmid. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um die Übersetzungsregulierung durch cis-Elemente in einer mRNA zu bestimmen, einschließlich 5 ‘-UTR und 3 ‘-UTR in anderen Systemen als poxvirus-infizierten Zellen. Darüber hinaus können mit dieser Methode verschiedene Arten der Übersetzungsinitiation wie kappenabhängig, kappenunabhängig, Wiederinitiation und interne Initiation untersucht werden.
Introduction
Nach dem zentralen Dogma fließt genetische Information von der DNA zur RNAund schließlich zudem Protein 1,2. Dieser Fluss von genetischen Informationen ist auf vielen Ebenen stark reguliert, einschließlich der mRNA-Übersetzung3,4. Die Entwicklung von Reporteranalysen zur Messung der Regulierung der Genexpression wird das Verständnis der in diesem Prozess involvierten Regulierungsmechanismen erleichtern. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Untersuchung der mRNA-Übersetzung mit einem in vitro transkribierten RNA-basierten Luciferase-Reporter-Test in poxvirus-infizierten Zellen.
Poxviren umfassen viele hochgefährliche menschliche und tierische Krankheitserreger 5. Wie alle anderen Viren setzen Poxviren bei der Proteinsynthese6,7,8ausschließlich auf Wirtszell-Maschinen. Um virale Proteine effizient zu synthetisieren, entwickelten Viren viele Strategien, um zelluläre Übersetzungsmaschinen zu entführen, um sie für die Übersetzung von viralen mRNAs7,8umzuleiten. Ein häufig von Viren verwendeteter Mechanismus ist es, cis-wirkende Elemente in ihren Transkripten zu verwenden. Bemerkenswerte Beispiele sind die interne Ribosome Entry Site (IRES) und cap-independent translation enhancer (CITE)9,10,11. Diese cis-Elementemachen die viralen Transkripte zu einem translationalen Vorteil, indem sie translationale Maschinenüberverschiedene Mechanismen 12, 13,14anziehen. Mehr als 100 poxvirus mRNAs haben ein evolutionär konserviertes cis-wirkendes Element in der 5 ‘-unübersetzten Region (5 ‘-UTR): Ein 5 ‘-Poly (A) Führer (A) an den ganz 5 ‘ Enden dieser mRNAs15,16. Die Längen dieser 5 ‘-poly (A)-Führer sind heterogen und werden durch das Verrutschen der poxviruskodierten RNA-Polymerase während der Transkription17,18erzeugt. Wir und andere haben vor kurzem herausgefunden, dass der 5 ‘-poly (A)-Führer einem mRNA in Zellen, die mit dem Impfinien-Virus (VACV) infiziert sind, einen Übersetzungsvorteil verleiht, demprototypischen Mitglied von Poxviren 19,20.
Der in vitro transkribierte RNA-basierte Luciferase-Reporter-Test wurde ursprünglich entwickelt,umdie Rolle des 5 ‘-poly (A)-Anführers in der mRNA-Übersetzung währendder Poxvirus-Infektion 19,21zuverstehen. Obwohl Plasmid-DNA-basierte Lluciferase-Reporter-Assays weit verbreitet sind, gibt es mehrere Nachteile, die die Ergebnisinterpretation in poxvirus-infizierten Zellen erschweren. Zunächst können Plasmide in VACV-infizierten Zellen 22 vermehren. Zweitens kommt die kryptische Transkription häufig von Plasmid-DNA18,23, 24. Drittens erzeugt VACV-Promoter-getriebene Transkription Poly (A)-Führer heterogener Längen, was es schwierig macht, die Poly-(A)-Anleiterlänge in einigen Experimenten 18 zu kontrollieren. Ein in vitro transkribierter RNA-basierter Luciferase-Reporter-Test umgeht diese Probleme und die Dateninterpretation ist einfach.
Es gibt vier Schlüsselschritte in dieser Methode: (1) Polymerase-Kettenreaktion (PCR), um die DNA-Vorlage für die In-vitro-Transkription zu erzeugen; (2) In-vitro-Transkription zur Erzeugung mRNA; (3) Transfektion zur Lieferung mRNA in Zellen; Und (4) Erkennung der Luciferase-Aktivität als Indikator für die Übersetzung (Abbildung1). Das daraus resultierende PCR-Amplizium enthält folgende Elemente in 5 ‘ bis 3 ‘ Richtung: T7-Promoter, Poly (A) Leader oder gewünschte 5 ‘-UTR-Sequenz, firefly luciferase open reading frame (ORF), gefolgt von einem Poly (A) Schwanz. PCR-Ampliver wird als Vorlage verwendet, um mRNA durch In-vitro-Transkription mit T7-Polymerase zu synthetisieren. Bei der In-vitro-Transkriptionwird m 7 G-Kappe oder andere Kappenanaloge in neu synthetisierte mRNA integriert. Die gekappten Transkripte werden in nicht infizierte oder VACV-infizierte Zellen transferiert. Das Zelllysat wird zum gewünschten Zeitpunkt nach der Transfektion gesammelt, um die Aktivitäten der Luciferase zu messen, die auf die Proteinproduktion aus der transfektiven mRNA hinweisen. Dieser Reporter-Test kann verwendet werden, um die Übersetzungsregulierung durch cis-element zu untersuchen, das in 5 ‘-UTR, 3 ‘-UTR oder anderen Regionen einer mRNA vorhanden ist. Darüber hinaus kann der in vitro transkribierte RNA-basierte Test verwendet werden, um verschiedene Mechanismen der Übersetzungsinitiation zu untersuchen, einschließlich kap-abhängiger Initiation, kap-unabhängiger Initiation, Wiederinitiation und interner Initiation wie IRES.
Protocol
Representative Results
Discussion
Alle Vierkernschritte sind entscheidend für den Erfolg des in vitro transkribierten RNA-basierten Lluciferase-Reporter-Sassay. Besonderes Augenmerk sollte auf das Grundierdesign gelegt werden, insbesondere für die T7-Promoter-Sequenz. Die Transkription von T7-RNA beginnt mit der Transkription des unterstrichenen ersten G (GGG-5 ‘-UTR-AUG-) im T7-Promoter, der vor der 5 ‘-UTR-Sequenz hinzugefügt wurde. Obwohl die Transkription Startplatz (TSS) beginnt von der ersten G am 5 ‘-Ende, sank die Zahl der G es weniger …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Das Projekt wurde von den National Institutes of Health (AI128406 www.nih.gov) an ZY und teilweise vom Johnson Cancer Research Center (http://cancer.k-state.edu) in Form des Graduate Student Summer Stipend to PD gefördert.
Materials
| 2X-Q5 Master mix | New England Biolabs | M0492 | High-Fidelity DNA Polymerase used in PCR |
| 3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA Cap Structure Analog | New England Biolabs | S1411L | Anti reverse Cap analog or ARCA |
| Corning 96 Well Half-Area white flat bottom polystyrene microplate | Corning | 3693 | Opaque walled 96 well white plate with solid bottom |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1960 | Dual-Luciferase Assay Kit (DLAK) |
| E.Z.N.A. Cycle Pure Kit | OMEGA BIO-TEK | D6492 | PCR purification kit |
| GloMax Navigator Microplate Luminometer | Promega | GM2010 | Referred as multimode plate reader luminometer |
| HiScribe T7 Quick High Yield RNA synthesis Kit | New England Biolabs | E2050S | In-Vitro transcription kit |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | Cationic lipid transfection reagent |
| NanoDrop2000 | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | Used to measure DNA and RNA concentration |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | Reduced serum media |
| Purelink RNA Mini Kit | Thermo Fisher Scientific | 12183018A | RNA purification kit |
| Vaccinia Capping System | New England Biolabs | M2080 | Capping system |
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