In vitro transkribere RNA-basert luciferase reporter analysen å studere oversettelse regulering i Poxvirus-infiserte celler
Summary
Vi presenterer en protokoll for å studere mRNA oversettelse regulering i poxvirus celler med in vitro transkribere RNA-basert luciferase reporter analysen. Analysen kan brukes til å studere oversettelse regulering av CIS-elementer av en mRNA, inkludert 5 ‘-uoversatt region (UTR) og 3 ‘-UTR. Ulike oversettelse initiering moduser kan også undersøkes ved hjelp av denne metoden.
Abstract
Hver poxvirus mRNA skrives etter viral DNA-replikering har en evolutionarily bevart, ikke-mal 5 ‘-Poly (A) leder i 5 ‘-UTR. Å analysere rollen som 5 ‘-Poly (A) leder i mRNA oversettelse under poxvirus infeksjon vi utviklet en in vitro kopieres RNA-baserte luciferase reporter analysen. Denne reporteren analysen består av fire kjerne trinn: (1) PCR å forsterke DNA malen for in vitro transkripsjon; (2) in vitro transkripsjon å generere mRNA bruker T7 RNA polymerase; (3) transfeksjoner å innføre in vitro skrives mRNA inn i celler; (4) påvisning av luciferase aktivitet som indikator på oversettelsen. Den RNA-baserte luciferase reporter analysen beskrevet her omgår spørsmål om plasmider replikering i poxvirus-infiserte celler og kryptiske transkripsjon fra plasmider. Denne protokollen kan brukes til å bestemme oversettelse regulering av CIS-elementer i en mRNA inkludert 5 ‘-UTR og 3 ‘-UTR i andre systemer enn poxvirus-infiserte celler. Videre kan ulike moduser av oversettelsen innvielse som cap-avhengige, cap-uavhengig, re-innvielse, og intern innvielse bli undersøkt ved hjelp av denne metoden.
Introduction
Ifølge den sentrale dogme, genetisk informasjon flyter fra DNA til RNA og så til slutt til protein1,2. Denne flyten av genetisk informasjon er svært regulert på mange nivåer, inkludert mRNA Translation3,4. Utvikling av reporter analyser for å måle regulering av genuttrykk vil lette forståelsen av regulatoriske mekanismer som er involvert i denne prosessen. Her beskriver vi en protokoll for å studere mRNA oversettelse ved hjelp av en in vitro som kan skrives RNA-basert luciferase reporter analysen i poxvirus celler.
Poxviruses omfatter mange svært farlige mennesker og dyr patogener5. Som alle andre virus, poxviruses utelukkende stole på Host Cell maskiner for protein syntese6,7,8. For å effektivt syntetisere viral proteiner, utviklet virus mange strategier for å kapre Cellular translational maskiner for å omdirigere den for oversettelse av viral mRNAs7,8. En vanligvis ansatt mekanisme av virus er å bruke CIS-fungerende elementer i sine transkripsjoner. Bemerkelsesverdige eksempler inkluderer interne ribosom oppføring nettsted (IRES) og cap-Independent oversettelse Enhancer (Cite)9,10,11. Disse CIS-elementer gjengi viral transkripsjoner en translational fordel ved å tiltrekke translational maskiner via ulike mekanismer12,13,14. Over 100 poxvirus mRNAs har en evolutionarily bevart CIS-fungerende element i 5 ‘-uoversatt region (5 ‘-UTR): a 5 ‘-Poly (a) leder ved very 5 ‘ endene av disse mRNAs15,16. Lengdene av disse 5 ‘-Poly (A) lederne er heterogene og er generert av glidning av poxvirus-kodet RNA polymerase under transkripsjon17,18. Vi, og andre, nylig oppdaget at 5 ‘-Poly (A) leder gir en oversettelse fordel til en mRNA i celler infisert med vaccinia virus (VACV), prototypic medlem av poxviruses19,20.
In vitro transkribere RNA-baserte luciferase reporter analysen ble opprinnelig utviklet for å forstå rollen som 5 ‘-Poly (A) leder i mRNA oversettelse under poxvirus infeksjon19,21. Selv om plasmider DNA-baserte luciferase reporter analyser har vært mye brukt, er det flere ulemper som vil komplisere resultatet tolkning i poxvirus-infiserte celler. Først, plasmider er i stand til å gjenskape i VACV-infiserte celler22. Andre, kryptiske transkripsjon ofte oppstår fra plasmider DNA18,23,24. Tredje, VACV promoter-drevet transkripsjon genererer Poly (A)-leder av heterogene lengder følgelig gjør det vanskelig å kontrollere Poly (A)-leder lengde i noen eksperimenter18. En in vitro i RNA-baserte luciferase reporter-analysen omgår disse problemene og data tolkningen er grei.
Det er fire viktige trinn i denne metoden: (1) polymerase kjedere reaksjon (PCR) for å generere DNA-malen for in vitro-transkripsjon; (2) in vitro transkripsjon å generere mRNA; (3) transfeksjoner å levere mRNA inn i celler; og (4) påvisning av luciferase aktivitet som indikator på oversettelsen (figur 1). Den resulterende PCR-amplicon inneholder følgende elementer i 5 ‘ til 3 ‘ retning: T7-promoter, Poly (A) leder eller ønsket 5 ‘-UTR sekvens, Firefly luciferase åpen lese ramme (ORF) etterfulgt av en Poly (A) hale. PCR-amplicon brukes som mal for å syntetisere mRNA av in vitro-transkripsjon ved hjelp av T7-polymerase. Under in vitro transkripsjon, m7G cap eller andre cap analoge er innarbeidet i nylig syntetisert mRNA. Avkortet transkripsjoner er transfekterte inn infisert eller VACV-infiserte celler. Celle lysat samles i ønsket tid etter transfeksjoner for å måle luciferase aktiviteter som tyder på protein produksjon fra transfekterte mRNA. Dette reporter analysen kan brukes til å studere oversettelse regulering av CIS-element til stede i 5 ‘-UTR ‘-UTR eller andre regioner i en mRNA. Videre kan in vitro kopieres RNA-basert analysen brukes til å studere ulike mekanismer for oversettelse innvielse inkludert cap-avhengige initiering, cap-uavhengig innvielse, re-innvielse og intern innvielse som IRES.
Protocol
Representative Results
Discussion
Alle fire-Core trinn er avgjørende for suksessen til in vitro kopieres RNA-basert luciferase reporter analysen. Spesiell oppmerksomhet bør gis til primer design, spesielt for T7 promoter sekvensen. T7 RNA polymerase starter transkripsjon fra den understrekede første G (GGG-5′-UTR-aug-) i T7 promoter lagt før 5 ‘-UTR sekvens. Selv om transkripsjon Start site (TSS) starter fra den første G på 5 ‘ end, redusere antall G er mindre enn tre i T7 promoter regionen redusert RNA yield/output fra in vitro transkripsjo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Prosjektet ble finansiert av National Institutes of Health (AI128406 www.nih.gov) til ZY og delvis av Johnson Cancer Research Center (http://cancer.k-state.edu) i form av graduate student Summer stipend til PD.
Materials
| 2X-Q5 Master mix | New England Biolabs | M0492 | High-Fidelity DNA Polymerase used in PCR |
| 3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA Cap Structure Analog | New England Biolabs | S1411L | Anti reverse Cap analog or ARCA |
| Corning 96 Well Half-Area white flat bottom polystyrene microplate | Corning | 3693 | Opaque walled 96 well white plate with solid bottom |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1960 | Dual-Luciferase Assay Kit (DLAK) |
| E.Z.N.A. Cycle Pure Kit | OMEGA BIO-TEK | D6492 | PCR purification kit |
| GloMax Navigator Microplate Luminometer | Promega | GM2010 | Referred as multimode plate reader luminometer |
| HiScribe T7 Quick High Yield RNA synthesis Kit | New England Biolabs | E2050S | In-Vitro transcription kit |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | Cationic lipid transfection reagent |
| NanoDrop2000 | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | Used to measure DNA and RNA concentration |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | Reduced serum media |
| Purelink RNA Mini Kit | Thermo Fisher Scientific | 12183018A | RNA purification kit |
| Vaccinia Capping System | New England Biolabs | M2080 | Capping system |
References
- Crick, F. H. On protein synthesis. Symposia of the Society for Experimental Biology. 12, 138-163 (1958).
- Crick, F. Central Dogma of Molecular Biology. Nature. 227, 561-563 (1970).
- Sonenberg, N., Hinnebusch, A. G. Regulation of Translation Initiation in Eukaryotes: Mechanisms and Biological Targets. Cell. 136, 731-745 (2009).
- Spriggs, K. A., Bushell, M., Willis, A. E. Translational Regulation of Gene Expression during Conditions of Cell Stress. Molecular Cell. 40, 228-237 (2010).
- Shchelkunov, S. N., Marennikova, S. S., Moyer, R. W. . Orthopoxviruses Pathogenic for Humans. , (2005).
- Gale, M., Tan, S. L., Katze, M. G. Translational Control of Viral Gene Expression in Eukaryotes. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64, 239-280 (2000).
- Walsh, D., Mathews, M. B., Mohr, I. Tinkering with Translation: Protein Synthesis in Virus-Infected Cells. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5, a012351 (2013).
- Cao, S., Dhungel, P., Yang, Z. Going against the Tide: Selective Cellular Protein Synthesis during Virally Induced Host Shutoff. Journal of Virology. 91, e00071-e00017 (2017).
- Pelletier, J., Kaplan, G., Racaniello, V. R., Sonenberg, N. Cap-independent translation of poliovirus mRNA is conferred by sequence elements within the 5’ noncoding region. Molecular and Cellular Biology. 8, 1103-1112 (1988).
- Pelletier, J., Sonenberg, N. Internal initiation of translation of eukaryotic mRNA directed by a sequence derived from poliovirus RNA. Nature. 334, 320-325 (1988).
- Guo, L., Allen, E., Miller, W. A. Structure and function of a cap-independent translation element that functions in either the 3′ or the 5′ untranslated region. RNA. 6, 1808-1820 (2000).
- Simon, A. E., Miller, W. A. 3′ Cap-Independent Translation Enhancers of Plant Viruses. Annual Review of Microbiology. 67, 21-42 (2013).
- Marom, L., et al. Diverse poly(A) binding proteins mediate internal translational initiation by a plant viral IRES. RNA Biology. 6, 446-454 (2009).
- Liu, B., Qian, S. B. Translational reprogramming in cellular stress response. Wiley Interdisciplinary Review. RNA. 5, 301-305 (2014).
- Ahn, B. Y., Moss, B. Capped poly(A) leaders of variable lengths at the 5’ ends of vaccinia virus late mRNAs. Journal of Virology. 63, 226-232 (1989).
- Ahn, B. Y., Jones, E. V., Moss, B. Identification of the vaccinia virus gene encoding an 18-kilodalton subunit of RNA polymerase and demonstration of a 5’ poly(A) leader on its early transcript. Journal of Virology. 64, 3019-3024 (1990).
- Schwer, B., Visca, P., Vos, J. C., Stunnenberg, H. G. Discontinuous transcription or RNA processing of vaccinia virus late messengers results in a 5′ poly(A) leader. Cell. 50, 163-169 (1987).
- Yang, Z., Martens, C. A., Bruno, D. P., Porcella, S. F., Moss, B. Pervasive initiation and 3′ end formation of poxvirus post-replicative RNAs. Journal of Biological Chemistry. 287, 31050-31060 (2012).
- Dhungel, P., Cao, S., Yang, Z. The 5’-poly(A) leader of poxvirus mRNA confers a translational advantage that can be achieved in cells with impaired cap-dependent translation. PLOS Pathogens. 13, e1006602 (2017).
- Jha, S., et al. Trans-kingdom mimicry underlies ribosome customization by a poxvirus kinase. Nature. 546, 651-655 (2017).
- Dai, A., et al. Ribosome Profiling Reveals Translational Upregulation of Cellular Oxidative Phosphorylation mRNAs during Vaccinia Virus-Induced Host Shutoff. Journal of Virology. 91, e01858-e01816 (2017).
- De Silva, F. S., Moss, B. Origin-independent plasmid replication occurs in vaccinia virus cytoplasmic factories and requires all five known poxvirus replication factors. Journal of Virology. 2, 23 (2005).
- Yang, Z., Bruno, D. P., Martens, C. A., Porcella, S. F., Moss, B. Simultaneous high-resolution analysis of vaccinia virus and host cell transcriptomes by deep RNA sequencing. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, 11513-11518 (2010).
- Yang, Z., Bruno, D. P., Martens, C. A., Porcella, S. F., Moss, B. Genome-Wide Analysis of the 5′ and 3′ Ends of Vaccinia Virus Early mRNAs Delineates Regulatory Sequences of Annotated and Anomalous Transcripts. Journal of Virology. 85, 5897-5909 (2011).
- Lorenz, T. C. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies. Journal of Visualized Experiments. , (2012).
- Dieffenbach, C. W., Lowe, T. M., Dveksler, G. S. General concepts for PCR primer design. PCR Methods and Applications. 3, S30-S37 (1993).
- Innis, M. A., Gelfand, D. H., Sninsky, J. J., White, T. J. . PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. , (2012).
- Baklanov, M. M., Golikova, L. N., Malygin, E. G. Effect on DNA Transcription of Nucleotide Sequences Upstream to T7 Promoter. Nucleic Acids Research. 24, 3659-3660 (1996).
- Thornton, J. A. Splicing by Overlap Extension PCR to Obtain Hybrid DNA Products. The Genetic Manipulation of Staphylococci: Methods and Protocols. , 43-49 (2017).
- Akichika, S., et al. Cap-specific terminal N6-methylation of RNA by an RNA polymerase II–associated methyltransferase. Science. , (2018).
- Sun, H., Zhang, M., Li, K., Bai, D., Yi, C. Cap-specific, terminal N6-methylation by a mammalian m6Am methyltransferase. Cell Research. 1, (2018).
- Boulias, K., et al. Identification of the m6Am methyltransferase PCIF1 reveals the location and functions of m6Am in the transcriptome. bioRxiv. , 485862 (2018).
- Dominissini, D., Rechavi, G. N4-acetylation of Cytidine in mRNA by NAT10 Regulates Stability and Translation. Cell. 175, 1725-1727 (2018).
- Wei, J., et al. Differential m6A, m6Am, and m1A Demethylation Mediated by FTO in the Cell Nucleus and Cytoplasm. Molecular Cell. 71, 973-985 (2018).
- Fu, Y., Dominissini, D., Rechavi, G., He, C. Gene expression regulation mediated through reversible m6A RNA methylation. Nature Reviews Genetics. 15, 293-306 (2014).
