In vitro transkriberas RNA-baserade Luciferase reporter assay att studera översättning förordning i Poxvirus-infekterade celler
Summary
Vi presenterar ett protokoll för att studera mRNA översättning förordning i poxvirus-infekterade celler använder in vitro-transkriberas RNA-baserade luciferas reporter assay. Analysen kan användas för att studera översättning förordning av CIS-element i en mRNA, inklusive 5 ‘-oöversatt region (utr) och 3 ‘-utr. Olika lägen för översättnings initiering kan också undersökas med den här metoden.
Abstract
Varje poxvirus mRNA transkriberas efter viral DNA-replikering har en evolutionärt bevaras, icke-templated 5 ‘-poly (A) ledare i 5 ‘-UTR. Att dissekera den roll som 5 ‘-poly (a) ledare i mRNA översättning under poxvirus infektion vi utvecklat en in vitro transkriberat RNA-baserade luciferas reporter assay. Denna reporter analys består av fyra centrala steg: (1) PCR att förstärka DNA-mall för in vitro-transkription; (2) in vitro-transkription för att generera mRNA med T7 RNA-polymeras; (3) transfektion för att introducera in vitro-transkriberad mRNA i celler; (4) detektion av luciferasaktivitet som indikator för översättningen. Den RNA-baserade luciferas reporter analysen beskrivs här kringgår frågor av Plasmid replikering i poxvirus-infekterade celler och kryptisk transkription från plasmid. Detta protokoll kan användas för att fastställa översättning reglering av CIS-element i en mRNA inklusive 5 ‘-utr och 3 ‘-utr i andra system än poxvirus-infekterade celler. Dessutom, olika former av översättning initiering som Cap-beroende, Cap-oberoende, återinsättande, och inre initiering kan undersökas med hjälp av denna metod.
Introduction
Enligt den centrala dogm, genetisk information flödar från DNA till RNA och sedan slutligen till protein1,2. Detta flöde av genetisk information är mycket reglerad på många nivåer inklusive mRNA översättning3,4. Utveckling av rapportörs analyser för att mäta reglering av gen uttryck kommer att under lätta förståelsen av regleringsmekanismer som är involverade i denna process. Här beskriver vi ett protokoll för att studera mRNA översättning med hjälp av en in vitro transkriberat RNA-baserade luciferas reporter assay i poxvirus-infekterade celler.
Poxviruses omfattar många mycket farliga mänskliga och animaliska patogener5. Liksom alla andra virus, poxviruses förlitar sig uteslutande på värd cell maskiner för protein syntes6,7,8. För att effektivt syntetisera virala proteiner, utvecklade virus många strategier för att kapa cellulära translationella maskiner för att omdirigera den för översättning av viral mrnas7,8. En vanlig anställd mekanism av virus är att använda CIS-verkande element i sina utskrifter. Anmärknings värda exempel är den inre ribosome ingångs plats (IRES) och Cap-oberoende översättning förstärkare (Cite)9,10,11. Dessa CIS-element gör virus avskrifter till en translationell fördel genom att attrahera translationella maskiner via olika mekanismer12,13,14. Över 100 poxvirus mrnas har en evolutionärt bevarade CIS-verkande elementet i 5 ‘-oöversatt region (5 ‘-utr): en 5 ‘-poly (a) ledare vid mycket 5 ‘ ändar av dessa mrnas15,16. Längderna av dessa 5 ‘-poly (a) ledare är heterogena och genereras av glidning av poxvirus-kodade RNA-polymeras under transkription17,18. Vi, och andra, upptäckte nyligen att 5 ‘-poly (a) ledaren ger en översättning fördel till en mRNA i celler infekterade med vaccinia virus (vacv), den prototypiska medlemmen av poxviruses19,20.
In vitro transkriberade RNA-baserade luciferas reporter analysen utvecklades ursprungligen för att förstå den roll som 5 ‘-poly (a) ledare i mRNA översättning under poxvirus infektion19,21. Även plasmid DNA-baserade luciferas reporter analyser har använts i stor utsträckning, det finns flera nack delar som kommer att komplicera resultatet tolkningen i poxvirus-infekterade celler. Först, plasmider kan replikera i VACV-infekterade celler22. För det andra sker kryptisk transkription ofta från plasmid DNA18,23,24. För det tredje, VACV promotor-driven transkription genererar poly (A)-ledare av heterogena längder vilket gör det svårt att kontrol lera poly (A)-ledare längd i vissa experiment18. En in vitro transkriberat RNA-baserade luciferas reporter assay kringgår dessa frågor och data tolkningen är okomplicerad.
Det finns fyra viktiga steg i denna metod: (1) polymeras kedje reaktion (PCR) för att generera DNA-mall för in vitro-transkription; 2. in vitro-transkription för att generera mRNA. (3) transfektion för att leverera mRNA till celler; och (4) detektion av luciferasaktivitet som indikator för översättning (figur 1). Den resulterande PCR-Amplikonen innehåller följande element i 5 ‘ till 3 ‘ riktning: T7-Promotorn, poly (a) ledare eller önskad 5 ‘-utr sekvens, Firefly luciferas öppen läsram (ORF) följt av en poly (a) svans. PCR-amplikon används som mall för att syntetisera mRNA genom in vitro-transkription med T7-polymeras. Under in vitro-transkription, m7G Cap eller andra Cap analog ingår i nyligen syntetiserade mRNA. De utjämnade avskrifter är transfekterade till oinfekterade eller vacv-infekterade celler. Cellen lysate samlas på önskad tid efter transfektion att mäta luciferas aktiviteter som indikerar protein produktion från transfekterade mRNA. Denna reporter analys kan användas för att studera översättning förordning av CIS-element som finns i 5 ‘-utr, 3 ‘-utr eller andra regioner i en mRNA. Vidare, in vitro transkriberas RNA-baserade analysen kan användas för att studera olika mekanismer för översättning initiering inklusive Cap-beroende initiering, Cap-oberoende initiering, återinsättande och inre initiering som IRES.
Protocol
Representative Results
Discussion
Alla fyra-core steg är avgörande för framgången för in vitro-transkriberade RNA-baserade luciferas reporter analysen. Särskild uppmärksamhet bör ägnas primer design, särskilt för T7 promotor sekvens. T7 RNA-polymeras påbörjar transkription från den understrukna första G (ggg-5 ‘-utr-aug-) i T7 Promotorn som lagts till före 5 ‘-utr-sekvensen. Även om transkription start site (TSS) startar från den första G vid 5 ‘ slutet, minskar antalet G: s mindre än tre i T7 promotor regionen minskade RNA avk…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Projektet finansierades av National Institute of Health (AI128406 www.nih.gov) till ZY och delvis av Johnson cancer Research Center (http://cancer.k-state.edu) i form av Graduate student Summer stipendium till PD.
Materials
| 2X-Q5 Master mix | New England Biolabs | M0492 | High-Fidelity DNA Polymerase used in PCR |
| 3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA Cap Structure Analog | New England Biolabs | S1411L | Anti reverse Cap analog or ARCA |
| Corning 96 Well Half-Area white flat bottom polystyrene microplate | Corning | 3693 | Opaque walled 96 well white plate with solid bottom |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1960 | Dual-Luciferase Assay Kit (DLAK) |
| E.Z.N.A. Cycle Pure Kit | OMEGA BIO-TEK | D6492 | PCR purification kit |
| GloMax Navigator Microplate Luminometer | Promega | GM2010 | Referred as multimode plate reader luminometer |
| HiScribe T7 Quick High Yield RNA synthesis Kit | New England Biolabs | E2050S | In-Vitro transcription kit |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | Cationic lipid transfection reagent |
| NanoDrop2000 | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | Used to measure DNA and RNA concentration |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | Reduced serum media |
| Purelink RNA Mini Kit | Thermo Fisher Scientific | 12183018A | RNA purification kit |
| Vaccinia Capping System | New England Biolabs | M2080 | Capping system |
References
- Crick, F. H. On protein synthesis. Symposia of the Society for Experimental Biology. 12, 138-163 (1958).
- Crick, F. Central Dogma of Molecular Biology. Nature. 227, 561-563 (1970).
- Sonenberg, N., Hinnebusch, A. G. Regulation of Translation Initiation in Eukaryotes: Mechanisms and Biological Targets. Cell. 136, 731-745 (2009).
- Spriggs, K. A., Bushell, M., Willis, A. E. Translational Regulation of Gene Expression during Conditions of Cell Stress. Molecular Cell. 40, 228-237 (2010).
- Shchelkunov, S. N., Marennikova, S. S., Moyer, R. W. . Orthopoxviruses Pathogenic for Humans. , (2005).
- Gale, M., Tan, S. L., Katze, M. G. Translational Control of Viral Gene Expression in Eukaryotes. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64, 239-280 (2000).
- Walsh, D., Mathews, M. B., Mohr, I. Tinkering with Translation: Protein Synthesis in Virus-Infected Cells. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5, a012351 (2013).
- Cao, S., Dhungel, P., Yang, Z. Going against the Tide: Selective Cellular Protein Synthesis during Virally Induced Host Shutoff. Journal of Virology. 91, e00071-e00017 (2017).
- Pelletier, J., Kaplan, G., Racaniello, V. R., Sonenberg, N. Cap-independent translation of poliovirus mRNA is conferred by sequence elements within the 5’ noncoding region. Molecular and Cellular Biology. 8, 1103-1112 (1988).
- Pelletier, J., Sonenberg, N. Internal initiation of translation of eukaryotic mRNA directed by a sequence derived from poliovirus RNA. Nature. 334, 320-325 (1988).
- Guo, L., Allen, E., Miller, W. A. Structure and function of a cap-independent translation element that functions in either the 3′ or the 5′ untranslated region. RNA. 6, 1808-1820 (2000).
- Simon, A. E., Miller, W. A. 3′ Cap-Independent Translation Enhancers of Plant Viruses. Annual Review of Microbiology. 67, 21-42 (2013).
- Marom, L., et al. Diverse poly(A) binding proteins mediate internal translational initiation by a plant viral IRES. RNA Biology. 6, 446-454 (2009).
- Liu, B., Qian, S. B. Translational reprogramming in cellular stress response. Wiley Interdisciplinary Review. RNA. 5, 301-305 (2014).
- Ahn, B. Y., Moss, B. Capped poly(A) leaders of variable lengths at the 5’ ends of vaccinia virus late mRNAs. Journal of Virology. 63, 226-232 (1989).
- Ahn, B. Y., Jones, E. V., Moss, B. Identification of the vaccinia virus gene encoding an 18-kilodalton subunit of RNA polymerase and demonstration of a 5’ poly(A) leader on its early transcript. Journal of Virology. 64, 3019-3024 (1990).
- Schwer, B., Visca, P., Vos, J. C., Stunnenberg, H. G. Discontinuous transcription or RNA processing of vaccinia virus late messengers results in a 5′ poly(A) leader. Cell. 50, 163-169 (1987).
- Yang, Z., Martens, C. A., Bruno, D. P., Porcella, S. F., Moss, B. Pervasive initiation and 3′ end formation of poxvirus post-replicative RNAs. Journal of Biological Chemistry. 287, 31050-31060 (2012).
- Dhungel, P., Cao, S., Yang, Z. The 5’-poly(A) leader of poxvirus mRNA confers a translational advantage that can be achieved in cells with impaired cap-dependent translation. PLOS Pathogens. 13, e1006602 (2017).
- Jha, S., et al. Trans-kingdom mimicry underlies ribosome customization by a poxvirus kinase. Nature. 546, 651-655 (2017).
- Dai, A., et al. Ribosome Profiling Reveals Translational Upregulation of Cellular Oxidative Phosphorylation mRNAs during Vaccinia Virus-Induced Host Shutoff. Journal of Virology. 91, e01858-e01816 (2017).
- De Silva, F. S., Moss, B. Origin-independent plasmid replication occurs in vaccinia virus cytoplasmic factories and requires all five known poxvirus replication factors. Journal of Virology. 2, 23 (2005).
- Yang, Z., Bruno, D. P., Martens, C. A., Porcella, S. F., Moss, B. Simultaneous high-resolution analysis of vaccinia virus and host cell transcriptomes by deep RNA sequencing. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, 11513-11518 (2010).
- Yang, Z., Bruno, D. P., Martens, C. A., Porcella, S. F., Moss, B. Genome-Wide Analysis of the 5′ and 3′ Ends of Vaccinia Virus Early mRNAs Delineates Regulatory Sequences of Annotated and Anomalous Transcripts. Journal of Virology. 85, 5897-5909 (2011).
- Lorenz, T. C. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies. Journal of Visualized Experiments. , (2012).
- Dieffenbach, C. W., Lowe, T. M., Dveksler, G. S. General concepts for PCR primer design. PCR Methods and Applications. 3, S30-S37 (1993).
- Innis, M. A., Gelfand, D. H., Sninsky, J. J., White, T. J. . PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. , (2012).
- Baklanov, M. M., Golikova, L. N., Malygin, E. G. Effect on DNA Transcription of Nucleotide Sequences Upstream to T7 Promoter. Nucleic Acids Research. 24, 3659-3660 (1996).
- Thornton, J. A. Splicing by Overlap Extension PCR to Obtain Hybrid DNA Products. The Genetic Manipulation of Staphylococci: Methods and Protocols. , 43-49 (2017).
- Akichika, S., et al. Cap-specific terminal N6-methylation of RNA by an RNA polymerase II–associated methyltransferase. Science. , (2018).
- Sun, H., Zhang, M., Li, K., Bai, D., Yi, C. Cap-specific, terminal N6-methylation by a mammalian m6Am methyltransferase. Cell Research. 1, (2018).
- Boulias, K., et al. Identification of the m6Am methyltransferase PCIF1 reveals the location and functions of m6Am in the transcriptome. bioRxiv. , 485862 (2018).
- Dominissini, D., Rechavi, G. N4-acetylation of Cytidine in mRNA by NAT10 Regulates Stability and Translation. Cell. 175, 1725-1727 (2018).
- Wei, J., et al. Differential m6A, m6Am, and m1A Demethylation Mediated by FTO in the Cell Nucleus and Cytoplasm. Molecular Cell. 71, 973-985 (2018).
- Fu, Y., Dominissini, D., Rechavi, G., He, C. Gene expression regulation mediated through reversible m6A RNA methylation. Nature Reviews Genetics. 15, 293-306 (2014).
