JoVE Journal > Cancer Research
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Cancer Research

Vurdering tumor mikromiljø af metastase døråbning-medieret vaskulær permeabilitet forbundet med kræft celle udbredelse ved hjælp af Intravital Imaging og fast vævsanalyse

Published: June 26, 2019
doi:
10.3791/59633
, , , , , , ,
1Department of Anatomy and Structural Biology,Albert Einstein College of Medicine, 2Gruss-Lipper Biophotonics Center,Albert Einstein College of Medicine, 3Integrated Imaging Program,Albert Einstein College of Medicine, 4Department of Surgery,Montefiore Medical Center, 5Department of Pathology,Montefiore Medical Center

Summary

Vi beskriver to metoder til vurdering af forbigående vaskulær permeabilitet forbundet med tumor mikromiljø af metastase (TMEM) døråbning funktion og cancer celle intravasation ved hjælp af intravenøs injektion af høj molekylvægt (155 kDa) dextran i mus. Metoderne omfatter intravital billeddannelse i levende dyr og fast vævsanalyse ved hjælp af immunofluorescens.

Abstract

Den mest almindeligt årsag til kræft relateret dødelighed er metastase, en proces, der kræver udbredelse af kræftceller fra den primære tumor til sekundære steder. For nylig konstaterede vi, at kræft celle udbredelse i primær brystkræft og på metastatiske steder i lungerne kun sker ved døråbninger kaldet tumor mikromiljø af metastase (TMEM). TMEM dørnummer er prognostisk for fjern recidiv af metastatisk sygdom hos brystkræftpatienter. TMEM døråbninger er sammensat af en cancer celle, som over-udtrykker actin Regulatory protein Mena i direkte kontakt med en perivaskulær, proangiogen makrofag, som udtrykker høje niveauer af TIE2 og VEGF, hvor begge af disse celler er tæt bundet til en blod beholderen endotel celle. Kræftceller kan intravasere gennem tmem døråbninger på grund af forbigående vaskulær permeabilitet orkestrieret af den fælles aktivitet af tmem-associerede makrofag og den tmem-associerede Mena-udtrykker kræft celle. I dette manuskript beskriver vi to metoder til vurdering af TMEM-medieret forbigående vaskulær permeabilitet: intravital billeddannelse og fast vævs immunofluorescens. Selv om begge metoder har deres fordele og ulemper, kan kombinationen af de to give de mest komplette analyser af TMEM-medieret vaskulær permeabilitet samt mikromiljømæssige forudsætninger for TMEM funktion. Da den metastatiske proces i brystkræft, og eventuelt andre former for kræft, involverer kræft celle udbredelse via TMEM døråbninger, er det vigtigt at anvende veletablerede metoder til analyse af TMEM døråbning aktivitet. De to metoder, der beskrives her, giver en omfattende tilgang til analysen af TMEM-dørens aktivitet, enten i naive eller farmakologisk behandlede dyr, hvilket er af afgørende betydning for prækliniske forsøg med agenser, der forebygger kræft celle formidling via TMEM.

Introduction

Nylige fremskridt i vores forståelse af kræft metastaser har afsløret, at epitelial-til-mesenchymal overgang (EMT) og induktion af en migrerende/invasiv cancer celle delpopulation er ikke i sig selv tilstrækkelig til hæmatogen udbredelse 1. faktisk var det tidligere antaget, at metastadimensionerende kræftceller intravasat gennem hele kræft-associeret endotelet som tumor neovaskulatur er ofte karakteriseret ved lav pericyte dækning, og som sådan, er meget permeabel og ustabil2,3,4. Selv om meget suggestive af defekte funktioner inden for tumoren, vaskulære modifikationer under carcinogenese ikke giver beviser i det hele, at tumorceller kan trænge ind blodkar let og i en ukontrolleret måde. Indsigter fra intravital Imaging (IVI) undersøgelser, hvor tumorceller fluorescently-Tagged og Vaskulaturen er mærket via intravenøs injektion af lysstofrør (såsom dextran eller kvante prikker), viser, at, mens tumor skibe er ensartet gennemtrængelig til lav molekylvægt dextrans (fx 70 KD), høj molekylvægt dextrans (155 KD) og tumorceller kan krydse endotelet kun på specialiserede steder af intravasation, som fortrinsvis er placeret på vaskulære gren punkt5, 6 , 7. immunohistokemiske (IHC) analyser ved hjælp af dyremodeller og humant patient-afledt materiale har vist, at disse steder er “døråbninger”, der specialiserer sig i at regulere vaskulær permeabilitet, lokalt og transitivt, hvilket giver et kort vindue af mulighed for migrerende/invasive kræftceller til at komme ind i omløb. Disse døråbninger kaldes “tumor mikromiljø af metastase” eller “tmem”, og helt forventeligt, deres tæthed korrelerer med en øget risiko for at udvikle metastatisk sygdom hos brystkræftpatienter8,9, 10.

Hver tmem døråbning består af tre forskellige typer af celler: en perivaskulær makrofag, en tumor celle over-udtrykker actin-regulatoriske protein pattedyr aktiveret (Mena), og en endotel celle, alle i direkte fysisk kontakt med hinanden1, 5,9,10,11,12,13. Den vigtigste begivenhed for funktionen af tmem som en intravasation døråbning er den lokaliserede frigivelse af vaskulær endotel vækstfaktor (VEGF) på det underliggende fartøj af perivaskulære makrofag14. VEGF kan forstyrre Homotypiske vejkryds mellem endotheliale celler15,16,17,18,19, et fænomen, der resulterer i forbigående vaskulær lækage, også kendt som “sprængning” permeabilitet som beskrevet i IVI undersøgelser 5. Det er påvist, at tmem-makrofager udtrykker tyrosinkinasereceptoren TIE2, som er nødvendig for VEGF-medieret tmem-funktion og homing af disse makrofager til den perivaskulære niche5,20,21 , 22. ud over at regulere kræftcellernes udbredelse og metastase har TIE2+ makrofager vist sig at være centrale regulatorer af tumor angiogenese21,22,23, 24,25,26,27,28,29,30,31. Som sådan udgør TIE2+ makrofager en kritisk bestanddel af Tumorens mikromiljø og den vigtigste regulator af den metastatiske kaskade.

For bedre at konceptualisere TMEM-medieret vaskulær permeabilitet (dvs. “sprængning”), er det meget vigtigt at skelne det fra andre former for vaskulær permeabilitet, der ikke er forbundet med opløsningen af endotel celle-celle knudepunkter. I en intakt endotelet (en, hvis stramme og klæber kryds ikke forstyrres), er der tre hovedtyper af vaskulær permeabilitet: (a) pinocytose, som kan, eller ikke kan, kobles til transcytose af det indtagne materiale; b) transport af materiale gennem endotel fenestrae og (c) transport af materiale gennem paracellulær pathway, som er reguleret af endotel stramme kryds15,16,17,18,19,32 , 33 , 34. selv om dereguleret i mange tumorer, de førnævnte former for vaskulær permeabilitet er blevet beskrevet for det meste i forbindelse med normal vævs fysiologi og homøostase, hvis ekstremer er væv med enten begrænset permeabilitet ( f. eks. blod-hjerne-barriere, blod-testis-barriere) eller rigelig permeabilitet (f. eks. fenestreret kapillærer i nyre-glomerulære apparater)34,35,36,37.

Ved hjælp af multiphoton intravital Imaging og multiplexed immunofluorescens mikroskopi, vi er i stand til at skelne mellem TMEM-medieret vaskulære permeabilitet (“sprængning”) og andre former for vaskulær permeabilitet i brysttumorer. For at opnå dette, udfører vi en enkelt intravenøs injektion af en høj molekylvægt, fluorescently-mærket sonde i mus. Spontane sprængning begivenheder kan derefter fanges ved hjælp af intravital Imaging i levende mus; Alternativt kan ekstravasation af sonden kvantificeres ved samlokaliserings undersøgelser med blodvaskulaturen (f. eks. CD31+ eller Endomucin+) og tmem-døråbninger ved hjælp af immunofluorescens mikroskopi. De protokoller, der præsenteres her, beskriver begge disse teknikker, som kan anvendes enten uafhængigt eller sammen med hinanden.

Protocol

Alle forsøg med levende dyr skal gennemføres i overensstemmelse med retningslinjer og bestemmelser for dyre brug og-pleje. De procedurer, der er beskrevet i denne undersøgelse, blev udført i overensstemmelse med de nationale institutter for sundhedsbestemmelser om pleje og anvendelse af forsøgsdyr og med godkendelse af Albert Einstein College of Medicine Animal Care og use Udvalg (IACUC). 1. evaluering af “sprængning permeabilitet” ved hjælp af levende dyr billeddannelse <stro…

Representative Results

De eksperimentelle procedurer, der er beskrevet i denne protokol artikel, opsummeres kort og illustreres i figur 1A-C. For at måle TMEM-medieret vaskulær permeabilitet (“sprængning aktivitet”) og for at reducere eksperimentel støj fra andre former for vaskulær permeabilitet (dvs. transcellulære og paracellulære, som forklaret i indledningen), vi udførte intravenøs (i.v.) injektion af sonder med høj molekylvægt, såsom 155 kDa dextran, k…

Discussion

Her skitserer vi to protokoller, der kan anvendes til at visualisere og kvantificere en bestemt type vaskulær permeabilitet, som er til stede ved TMEM døråbninger og er forbundet med afbrydelse af vaskulære stramme og klæber kryds. Denne type vaskulær permeabilitet er forbigående og styres af treparts TMEM-celle komplekset, som forklaret ovenfor5. Evnen til at identificere og kvantificere TMEM-associeret vaskulær permeabilitet er afgørende for vurderingen af en Pro-metastatisk cancer cell…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi vil gerne takke den analytiske Imaging Facility (AIF) i Albert Einstein College of Medicine for Imaging support. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra NIC (P30CA013330, CA150344, CA 100324 og CA216248), SIG 1S10OD019961-01, Gruss-Lipper Biophotonics Center og dets integrerede billedbehandlings program, og Montefiore ‘s Ruth L. Kirschstein T32 uddannelse tilskud af kirurger til studiet af tumor mikromiljø (CA200561).

GSK co-skrev manuskriptet, udførte Imaging for figur 1c og 3b, udviklet fast vævsanalyse protokol, og analyseret og fortolket alle data; JMP co-skrev manuskriptet, og udførte kirurgi og intravital Imaging for figur 1b, 2C og 3A; LB &AMP; AC udført operationen og intravital Imaging for figur 2b; RJ udførte operationen og intravital billeddannelse for figur 2a; JSC co-skrev manuskriptet og analyserede og fortolkede alle data; MHO co-skrev manuskriptet og analyserede og fortolkede alle data; og de udførte kirurgi og intravital Imaging for figur 2D, co-skrev manuskriptet, udviklede fast vævsanalyse og intravital Imaging protokoller, og analyseret og fortolket alle data.

Materials

Anti-rabbit IgG (Alexa 488) Life Technologies Corporation A-11034
Anti-rat IgG (Alexa 647) Life Technologies Corporation A-21247
Bovine Serum Albumin Fisher Scientific BP1600-100
Citrate Eng Scientific Inc 9770
Cover Glass Slips Electron Microscopy Sciences 72296-08
Cyanoacrylate Adhesive Henkel Adhesive 1647358
DAPI Perkin Elmer FP1490
Dextran-Tetramethyl-Rhodamine Sigma Aldrich T1287
DMEM/F12 Gibco 11320-033
Endomucin (primary antibody) Santa Cruz Biotechnology sc-65495
Enrofloxacin Bayer 84753076 v-06/2015
Fetal Bovine Serum Sigma Aldrich F2442
Fish Skin Gelatin Fisher Scientific G7765
Insulin Syringe Becton Dickinson 309659
Isofluorane Henry Schein NDC 11695-6776-2
Matrigel Corning CB40234 Artificial extracellular matrix
Needle (30 G) Becton Dickinson 305128
Phosphate Buffered Saline Life Technologies Corporation PBS
Polyethylene Tubing Scientific Commodities Inc BB31695-PE/1
Pulse Oximeter Kent Scientific MouseOx
Puralube Vet Ointment Dechra NDC 17033-211-38
Quantum Dots Life Technologies Corporation Q21561MP
Rubber McMaster Carr 1310N14
TMR (primary antibody) Invitrogen A6397
Tween-20 MP Biologicals TWEEN201
Xylene Fisher Scientific 184835
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Karagiannis, G. S., Goswami, S., Jones, J. G., Oktay, M. H., Condeelis, J. S. Signatures of breast cancer metastasis at a glance. Journal of Cell Science. 129 (9), 1751-1758 (2016).
  2. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
  3. Raza, A., Franklin, M. J., Dudek, A. Z. Pericytes and vessel maturation during tumor angiogenesis and metastasis. American Journal of Hematology. 85 (8), 593-598 (2010).
  4. Pietras, K., Ostman, A. Hallmarks of cancer: interactions with the tumor stroma. Experimental Cell Research. 316 (8), 1324-1331 (2010).
  5. Harney, A. S., et al. Real-Time Imaging Reveals Local, Transient Vascular Permeability, and Tumor Cell Intravasation Stimulated by TIE2hi Macrophage-Derived VEGFA. Cancer Discovery. 5 (9), 932-943 (2015).
  6. Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nature Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
  7. Wyckoff, J. B., et al. Direct visualization of macrophage-assisted tumor cell intravasation in mammary tumors. Cancer Research. 67 (6), 2649-2656 (2007).
  8. Sparano, J. A., et al. A metastasis biomarker (MetaSite Breast Score) is associated with distant recurrence in hormone receptor-positive, HER2-negative early-stage breast cancer. npj Breast Cancer. 3, 42 (2017).
  9. Rohan, T. E., et al. Tumor microenvironment of metastasis and risk of distant metastasis of breast cancer. Journal of the National Cancer Institute. 106 (8), (2014).
  10. Robinson, B. D., et al. Tumor microenvironment of metastasis in human breast carcinoma: a potential prognostic marker linked to hematogenous dissemination. Clinical Cancer Research. 15 (7), 2433-2441 (2009).
  11. Pignatelli, J., et al. Invasive breast carcinoma cells from patients exhibit MenaINV- and macrophage-dependent transendothelial migration. Science Signaling. 7 (353), 112 (2014).
  12. Oktay, M. H., Jones, J. G. TMEM: a novel breast cancer dissemination marker for the assessment of metastatic risk. Biomarkers in Medicine. 9 (2), 81-84 (2015).
  13. Roussos, E. T., et al. Mena invasive (Mena(INV)) and Mena11a isoforms play distinct roles in breast cancer cell cohesion and association with TMEM. Clinical & Experimental Metastasis. 28 (6), 515-527 (2011).
  14. Harney, A. S., et al. The Selective Tie2 Inhibitor Rebastinib Blocks Recruitment and Function of Tie2(Hi) Macrophages in Breast Cancer and Pancreatic Neuroendocrine Tumors. Molecular Cancer Therapeutics. 16 (11), 2486-2501 (2017).
  15. Bates, D. O., Lodwick, D., Williams, B. Vascular endothelial growth factor and microvascular permeability. Microcirculation. 6 (2), 83-96 (1999).
  16. Lee, Y. C. The involvement of VEGF in endothelial permeability: a target for anti-inflammatory therapy. Current Opinion in Investigational Drugs. 6 (11), 1124-1130 (2005).
  17. Roberts, W. G., Palade, G. E. Neovasculature induced by vascular endothelial growth factor is fenestrated. Cancer Research. 57 (4), 765-772 (1997).
  18. Stan, R. V., et al. Immunoisolation and partial characterization of endothelial plasmalemmal vesicles (caveolae). Molecular Biology of the Cell. 8 (4), 595-605 (1997).
  19. Roberts, W. G., Palade, G. E. Increased microvascular permeability and endothelial fenestration induced by vascular endothelial growth factor. Journal of Cell Science. 108, 2369-2379 (1995).
  20. Arwert, E. N., et al. A Unidirectional Transition from Migratory to Perivascular Macrophage Is Required for Tumor Cell Intravasation. Cell Reports. 23 (5), 1239-1248 (2018).
  21. Kadioglu, E., De Palma, M. Cancer Metastasis: Perivascular Macrophages Under Watch. Cancer Discovery. 5 (9), 906-908 (2015).
  22. Hughes, R., et al. Perivascular M2 Macrophages Stimulate Tumor Relapse after Chemotherapy. Cancer Research. 75 (17), 3479-3491 (2015).
  23. Riabov, V., et al. Role of tumor associated macrophages in tumor angiogenesis and lymphangiogenesis. Frontiers in Physiology. 5, 75 (2014).
  24. Squadrito, M. L., De Palma, M. Macrophage regulation of tumor angiogenesis: implications for cancer therapy. Molecular Aspects of Medicine. 32 (2), 123-145 (2011).
  25. Ferrara, N. Role of myeloid cells in vascular endothelial growth factor-independent tumor angiogenesis. Current Opinion in Hematology. 17 (3), 219-224 (2010).
  26. Solinas, G., Germano, G., Mantovani, A., Allavena, P. Tumor-associated macrophages (TAM) as major players of the cancer-related inflammation. Journal of Leukocyte Biology. 86 (5), 1065-1073 (2009).
  27. Venneri, M. A., et al. Identification of proangiogenic TIE2-expressing monocytes (TEMs) in human peripheral blood and cancer. Blood. 109 (12), 5276-5285 (2007).
  28. Lewis, C. E., De Palma, M., Naldini, L. Tie2-expressing monocytes and tumor angiogenesis: regulation by hypoxia and angiopoietin-2. Cancer Research. 67 (18), 8429-8432 (2007).
  29. Mazzieri, R., et al. Targeting the ANG2/TIE2 axis inhibits tumor growth and metastasis by impairing angiogenesis and disabling rebounds of proangiogenic myeloid cells. Cancer Cell. 19 (4), 512-526 (2011).
  30. Lewis, C. E., Ferrara, N. Multiple effects of angiopoietin-2 blockade on tumors. Cancer Cell. 19 (4), 431-433 (2011).
  31. Gabrusiewicz, K., et al. Anti-vascular endothelial growth factor therapy-induced glioma invasion is associated with accumulation of Tie2-expressing monocytes. Oncotarget. 5 (8), 2208-2220 (2014).
  32. Karagiannis, G. S., Condeelis, J. S., Oktay, M. H. Chemotherapy-induced metastasis: mechanisms and translational opportunities. Clinical & Experimental Metastasis. , (2018).
  33. Senger, D. R., et al. Tumor cells secrete a vascular permeability factor that promotes accumulation of ascites fluid. Science. 219 (4587), 983-985 (1983).
  34. Obermeier, B., Verma, A., Ransohoff, R. M. The blood-brain barrier. Handbook of Clinical Neurology. 133, 39-59 (2016).
  35. Satchell, S. C., Braet, F. Glomerular endothelial cell fenestrations: an integral component of the glomerular filtration barrier. American Journal of Physiology: Renal Physiology. 296 (5), 947-956 (2009).
  36. Stan, R. V. Endothelial stomatal and fenestral diaphragms in normal vessels and angiogenesis. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 11 (4), 621-643 (2007).
  37. Mruk, D. D., Cheng, C. Y. The Mammalian Blood-Testis Barrier: Its Biology and Regulation. Endocrine Reviews. 36 (5), 564-591 (2015).
  38. Entenberg, D., et al. Imaging Tumor Cell Movement in Vivo. Current Protocols in Cell Biology. 58 (1), 1-19 (2013).
  39. Entenberg, D., et al. Setup and use of a two-laser multiphoton microscope for multichannel intravital fluorescence imaging. Nature Protocols. 6 (10), 1500-1520 (2011).
  40. Sasmono, R. T., et al. A macrophage colony-stimulating factor receptor-green fluorescent protein transgene is expressed throughout the mononuclear phagocyte system of the mouse. Blood. 101 (3), 1155-1163 (2003).
  41. Ovchinnikov, D. A., et al. Expression of Gal4-dependent transgenes in cells of the mononuclear phagocyte system labeled with enhanced cyan fluorescent protein using Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP double-transgenic mice. Journal of Leukocyte Biology. 83 (2), 430-433 (2008).
  42. Entenberg, D., et al. Time-lapsed, large-volume, high-resolution intravital imaging for tissue-wide analysis of single cell dynamics. Methods. 128, 65-77 (2017).
  43. Pastoriza, J. M., et al. Black race and distant recurrence after neoadjuvant or adjuvant chemotherapy in breast cancer. Clinical & Experimental Metastasis. , (2018).
  44. Williams, J. K., et al. Validation of a device for the active manipulation of the tumor microenvironment during intravital imaging. Intravital. 5 (2), 1182271 (2016).
  45. Harney, A. S., Wang, Y., Condeelis, J. S., Entenberg, D. Extended Time-lapse Intravital Imaging of Real-time Multicellular Dynamics in the Tumor Microenvironment. Journal of Visualized Experiments. (112), e54042 (2016).
  46. Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
  47. Roussos, E. T., et al. Mena invasive (MenaINV) promotes multicellular streaming motility and transendothelial migration in a mouse model of breast cancer. Journal of Cell Science. 124, 2120-2131 (2011).
  48. Karagiannis, G. S., et al. Neoadjuvant chemotherapy induces breast cancer metastasis through a TMEM-mediated mechanism. Science Translational Medicine. 9 (397), (2017).
  49. Chang, Y. S., Jalgaonkar, S. P., Middleton, J. D., Hai, T. Stress-inducible gene Atf3 in the noncancer host cells contributes to chemotherapy-exacerbated breast cancer metastasis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (34), 7159-7168 (2017).
  50. Jain, R. K. Normalization of tumor vasculature: an emerging concept in antiangiogenic therapy. Science. 307 (5706), 58-62 (2005).
  51. Winkler, F., et al. Kinetics of vascular normalization by VEGFR2 blockade governs brain tumor response to radiation: role of oxygenation, angiopoietin-1, and matrix metalloproteinases. Cancer Cell. 6 (6), 553-563 (2004).
  52. Goel, S., et al. Normalization of the vasculature for treatment of cancer and other diseases. Physiological Reviews. 91 (3), 1071-1121 (2011).
  53. Jain, R. K. Normalizing tumor microenvironment to treat cancer: bench to bedside to biomarkers. Journal of Clinical Oncology. 31 (17), 2205-2218 (2013).
  54. Carmeliet, P., Jain, R. K. Principles and mechanisms of vessel normalization for cancer and other angiogenic diseases. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (6), 417-427 (2011).
  55. Meijer, E. F., Baish, J. W., Padera, T. P., Fukumura, D. Measuring Vascular Permeability In Vivo. Methods in Molecular Biology. 1458, 71-85 (2016).

Tags

Tumor MicroenvironmentTMEMVascular PermeabilityCancer Cell DisseminationIntravital ImagingDextranTumor TransplantationMacrophagesMammary Fat PadExtracellular MatrixTail Vein Catheter
check_url/59633?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Karagiannis, G. S., Pastoriza, J. M., Borriello, L., Jafari, R., Coste, A., Condeelis, J. S., Oktay, M. H., Entenberg, D. Assessing Tumor Microenvironment of Metastasis Doorway-Mediated Vascular Permeability Associated with Cancer Cell Dissemination using Intravital Imaging and Fixed Tissue Analysis. J. Vis. Exp. (148), e59633, doi:10.3791/59633 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image