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Cancer Research

Valutazione del microambiente tumorale della permeabilità vascolare mediata da Metastasi Doorway associata alla dissemimassione delle cellule tumorali utilizzando l'imaging intravitale e l'analisi dei tessuti fissi

Published: June 26, 2019
doi:
10.3791/59633
, , , , , , ,
1Department of Anatomy and Structural Biology,Albert Einstein College of Medicine, 2Gruss-Lipper Biophotonics Center,Albert Einstein College of Medicine, 3Integrated Imaging Program,Albert Einstein College of Medicine, 4Department of Surgery,Montefiore Medical Center, 5Department of Pathology,Montefiore Medical Center

Summary

Descriviamo due metodi per valutare la permeabilità vascolare transitoria associata al microambiente tumorale della funzione di metastasi (TMEM) e all’intravasazione delle cellule tumorali utilizzando l’iniezione endovenosa di peso molecolare elevato (155 kDa) dextran nei topi. I metodi includono l’imaging intravitale in animali vivi e l’analisi dei tessuti fissi utilizzando l’immunofluorescenza.

Abstract

La causa più comune della mortalità correlata al cancro è la metastasi, un processo che richiede la diffusione delle cellule tumorali dal tumore primario ai siti secondari. Recentemente, abbiamo stabilito che la diffusione delle cellule tumorali nel cancro mammario primario e nei siti metastatici nel polmone si verifica solo nelle porte chiamate Microambiente tumorale di Metastasi (TMEM). Il numero di porta TMEM è prognostico per una recidiva a distanza di malattia metastatica nei pazienti affetti da cancro al seno. Le porte del TMEM sono composte da una cellula tumorale che esprime eccessivamente la proteina regolatore di actina Mena a diretto contatto con un macrofago perivascolare e proangiogenico che esprime alti livelli di TIE2 e VEGF, dove entrambe le cellule sono strettamente legate a un sangue cellula endoteliale della nave. Le cellule tumorali possono invadere attraverso le porte TMEM a causa della permeabilità vascolare transitoria orchestrata dall’attività congiunta del macrofagio associato al TMEM e della cellula tumorale che esprime Mena associata al TMEM. In questo manoscritto vengono descritti due metodi per la valutazione della permeabilità vascolare transitoria mediata tramite TMEM: l’imaging intravitale e l’immunofluorescenza dei tessuti fissi. Anche se entrambi i metodi hanno i loro vantaggi e svantaggi, la combinazione dei due può fornire le analisi più complete della permeabilità vascolare mediata da TMEM e dei prerequisiti microambientali per la funzione TMEM. Poiché il processo metastatico nel cancro al seno, e possibilmente altri tipi di cancro, coinvolge la diffusione delle cellule tumorali attraverso porte TMEM, è essenziale impiegare metodi ben consolidati per l’analisi dell’attività delle porte TMEM. I due metodi qui descritti forniscono un approccio globale all’analisi dell’attività della porta TMEM, sia in animali ingenui che farmacologicamente trattati, il che è di fondamentale importanza per le sperimentazioni precliniche di agenti che prevengono le cellule tumorali diffusione tramite TMEM.

Introduction

I recenti progressi nella nostra comprensione della metastasi tumorale hanno scoperto che la transizione epiteliale-mesenchy (EMT) e l’induzione di una sottopopolazione di cellule tumorali migratorie/invasive non sono, di per sé, sufficienti per la diffusione ematogena 1. Infatti, in precedenza si pensava che metastasizzare le cellule tumorali intravasi attraverso l’intero endotelio associato al cancro, poiché la neovasculatura tumorale è spesso caratterizzata da una bassa copertura pericita, e come tale, è altamente permeabile e instabile2,3,4. Anche se altamente suggestivo di funzioni difettose all’interno del tumore, le modifiche vascolari durante la carcinogenesi non forniscono la prova di per sé che le cellule tumorali possono penetrare i vasi sanguigni facilmente e in modo incontrollato. Gli studi sull’imaging intravitale (IVI), in cui le cellule tumorali sono etichettate fluorescenti e la vascoliera è etichettata tramite l’iniezione endovenosa di sonde fluorescenti (come dextran o punti quantici), mostrano che, mentre i vasi tumorali sono uniformemente permeabile a basso peso molecolare dextrans (ad es. 70 kD), dextrans ad alto peso molecolare (155 kD) e le cellule tumorali possono attraversare l’endotelio solo in siti specializzati di intravasazione che sono preferibilmente situati al punto di diramazione vascolare5, 6 È possibile: , 7.Le analisi immunoistochimiche (IHC) utilizzando modelli animali e materiale di origine del paziente umano hanno dimostrato che questi siti sono “porte” specializzate nella regolazione della permeabilità vascolare, localmente e transitoriamente, fornendo una breve finestra di l’opportunità per le cellule tumorali migratorie/invasive di entrare nella circolazione. Queste porte sono chiamate “Microambiente tumorale di Metastasi” o “TMEM” e, molto a quanto pare, la loro densità è correlata a un aumento del rischio di sviluppare malattie metastatiche nei pazienti con cancro al seno8,9, 10.

Ogni porta TMEM è costituita da tre tipi distinti di cellule: un macrofago perivascolare, una cellula tumorale che sovraesprime il mammifero proteico actin-regulatory abilitato (Mena) e una cellula endoteliale, il tutto in contatto fisico diretto tra loro1, 5,9,10,11,12,13. L’evento chiave per la funzione del TMEM come porta d’intravasamento è il rilascio localizzato del fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF) sulla nave sottostante dal macrofaage perivascolare14. VEGF può interrompere le giunzioni omotipiche tra le cellule endoteliali15,16,17,18,19, un fenomeno che si traduce in perdite vascolari transitorie, anche noto come “bursting” permeabilità come descritto negli studi IVI 5. I macrofagi TMEM hanno dimostrato di esprimere il recettore della chinasi tirosina TIE2, che è necessario per la funzione TMEM mediata dal VEGF e l’homing di questi macrofagi alla nicchia perivascolare5,20,21 , 22.Oltre a regolare la diffusione e la metastasi delle cellule tumorali, è stato dimostrato che i macrofagi TIE2sono stati regolatori centrali dell’angiogenesi tumorale21,22,23, 24,25,26,27,28,29,30,31. Come tale, i macrofagi TIE2 rappresentano un costituente critico del microambiente tumorale e il principale regolatore della cascata metastatica.

Per concettualizzare meglio la permeabilità vascolare mediata da TMEM (cioè “bursting”), è molto importante distinguerla da altre modalità di permeabilità vascolare che non sono associate alla dissoluzione delle giunzioni endoteliali cellula-cellula. In un endotelio intatto (uno le cui giunzioni strette e aderenti non sono interrotte), ci sono tre tipi principali di permeabilità vascolare: (a) pinocytosi, che può, o non può, essere accoppiato alla transcitosi del materiale ingerito; b) trasporto di materiale attraverso fenestrae endoteliali; e (c) trasporto di materiale attraverso il percorso paracellulare, che è regolato da giunzioni strette endote15,16,17,18,19,32 , 33 Mi lasa , 34.Sebbene deregolamentati in molti tumori, i suddetti modi di permeabilità vascolare sono stati descritti principalmente nel contesto della normale fisiologia tissutale e dell’omeostasi, i cui estremi sono tessuti con permeabilità limitata ( ad esempio, barriera emato-encefalica, barriera emato-prova), o abbondante permeabilità (ad esempio, capillari fenestrated dell’apparato glomerare renale)34,35,36,37.

Utilizzando l’imaging intravitale multifotone e la microscopia a immunofluorescenza multiplexata, siamo in grado di distinguere tra permeabilità vascolare mediata da TMEM (“bursting”) e altre modalità di permeabilità vascolare nei tumori al seno. Per raggiungere questo obiettivo, eseguiamo una singola iniezione endovenosa di una sonda ad alto peso molecolare, con etichetta fluorescente nei topi. Gli eventi di scoppio spontaneo possono quindi essere catturati utilizzando l’imaging intravitale nei topi vivi; o, in alternativa, l’stravaganza della sonda può essere quantificata mediante studi di co-localizzazione convascolarizzazione del sangue (ad es. porte CD31 o Endomucin ) e TMEM utilizzando la microscopia a immunofluorescenza. I protocolli qui presentati descrivono entrambe queste tecniche, che potrebbero essere utilizzate in modo indipendente o in combinazione tra loro.

Protocol

Tutti gli esperimenti che utilizzano animali vivi devono essere condotti in conformità con le linee guida e le normative sull’uso degli animali e per la cura. Le procedure descritte in questo studio sono state eseguite in conformità con le normative nazionali di salute riguardanti la cura e l’uso di animali sperimentali e con l’approvazione dell’Albert Einstein College of Medicine Animal Care and Use (IACUC). 1. Valutazione della “permeabilità” utilizzando l’imaging animale vivo <…

Representative Results

Le procedure sperimentali descritte in questo articolo di protocollo sono brevemente riassunte e illustrate nella Figura 1A-C. Per misurare la permeabilità vascolare mediata da TMEM (“attività di scoppio”) e ridurre il rumore sperimentale da altri modi di permeabilità vascolare (cioè transcellulare e paracellulare, come spiegato nell’introduzione), abbiamo eseguito permeno (i.v.) iniezione di sonde ad alto peso molecolare, come 155 kDa Dextran…

Discussion

Qui, dedichiamo due protocolli che possono essere applicati per visualizzare e quantificare un tipo specifico di permeabilità vascolare che è presente alle porte TMEM ed è associato all’interruzione della stretta vascolare e aderisce giunzioni. Questo tipo di permeabilità vascolare è transitoria e controllata dal complesso cellulare TMEM tripartito, come spiegato sopra5. La capacità di identificare e quantificare la permeabilità vascolare associata al TMEM è fondamentale per la valutazione…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ringraziamo l’Analytical Imaging Facility (AIF) dell’Albert Einstein College of Medicine per il supporto dell’imaging. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del NCI (P30CA013330, CA150344, CA 100324 e CA216248), il SIG 1S10OD019961-01, il Gruss-Lipper Biophotonics Center e il suo programma Integrated Imaging, e Ruth L. Kirschstein T32 per lo studio del microambiente tumorale (CA200561).

GSK ha co-scritto il manoscritto, ha eseguito l’imaging per le figure 1C e 3B, ha sviluppato un protocollo di analisi dei tessuti fissi e ha analizzato e interpretato tutti i dati; JMP ha co-scritto il manoscritto, ed eseguito l’intervento chirurgico e l’imaging intravitale per la Figura 1B,2C e 3A; LB & AC ha eseguito l’intervento chirurgico e l’imaging intravitale per la figura 2B; RJ ha eseguito l’intervento chirurgico e l’imaging intravitale per la Figura 2A; JSC co-scrisse il manoscritto e analizzò e interpretò tutti i dati; MHO ha co-scritto il manoscritto e analizzato e interpretato tutti i dati; e DE ha eseguito l’intervento chirurgico e l’imaging intravitale per la Figura 2D, ha co-scritto il manoscritto, sviluppato l’analisi dei tessuti fissi e protocolli di imaging intravitale e analizzato e interpretato tutti i dati.

Materials

Anti-rabbit IgG (Alexa 488) Life Technologies Corporation A-11034
Anti-rat IgG (Alexa 647) Life Technologies Corporation A-21247
Bovine Serum Albumin Fisher Scientific BP1600-100
Citrate Eng Scientific Inc 9770
Cover Glass Slips Electron Microscopy Sciences 72296-08
Cyanoacrylate Adhesive Henkel Adhesive 1647358
DAPI Perkin Elmer FP1490
Dextran-Tetramethyl-Rhodamine Sigma Aldrich T1287
DMEM/F12 Gibco 11320-033
Endomucin (primary antibody) Santa Cruz Biotechnology sc-65495
Enrofloxacin Bayer 84753076 v-06/2015
Fetal Bovine Serum Sigma Aldrich F2442
Fish Skin Gelatin Fisher Scientific G7765
Insulin Syringe Becton Dickinson 309659
Isofluorane Henry Schein NDC 11695-6776-2
Matrigel Corning CB40234 Artificial extracellular matrix
Needle (30 G) Becton Dickinson 305128
Phosphate Buffered Saline Life Technologies Corporation PBS
Polyethylene Tubing Scientific Commodities Inc BB31695-PE/1
Pulse Oximeter Kent Scientific MouseOx
Puralube Vet Ointment Dechra NDC 17033-211-38
Quantum Dots Life Technologies Corporation Q21561MP
Rubber McMaster Carr 1310N14
TMR (primary antibody) Invitrogen A6397
Tween-20 MP Biologicals TWEEN201
Xylene Fisher Scientific 184835
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References

  1. Karagiannis, G. S., Goswami, S., Jones, J. G., Oktay, M. H., Condeelis, J. S. Signatures of breast cancer metastasis at a glance. Journal of Cell Science. 129 (9), 1751-1758 (2016).
  2. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
  3. Raza, A., Franklin, M. J., Dudek, A. Z. Pericytes and vessel maturation during tumor angiogenesis and metastasis. American Journal of Hematology. 85 (8), 593-598 (2010).
  4. Pietras, K., Ostman, A. Hallmarks of cancer: interactions with the tumor stroma. Experimental Cell Research. 316 (8), 1324-1331 (2010).
  5. Harney, A. S., et al. Real-Time Imaging Reveals Local, Transient Vascular Permeability, and Tumor Cell Intravasation Stimulated by TIE2hi Macrophage-Derived VEGFA. Cancer Discovery. 5 (9), 932-943 (2015).
  6. Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nature Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
  7. Wyckoff, J. B., et al. Direct visualization of macrophage-assisted tumor cell intravasation in mammary tumors. Cancer Research. 67 (6), 2649-2656 (2007).
  8. Sparano, J. A., et al. A metastasis biomarker (MetaSite Breast Score) is associated with distant recurrence in hormone receptor-positive, HER2-negative early-stage breast cancer. npj Breast Cancer. 3, 42 (2017).
  9. Rohan, T. E., et al. Tumor microenvironment of metastasis and risk of distant metastasis of breast cancer. Journal of the National Cancer Institute. 106 (8), (2014).
  10. Robinson, B. D., et al. Tumor microenvironment of metastasis in human breast carcinoma: a potential prognostic marker linked to hematogenous dissemination. Clinical Cancer Research. 15 (7), 2433-2441 (2009).
  11. Pignatelli, J., et al. Invasive breast carcinoma cells from patients exhibit MenaINV- and macrophage-dependent transendothelial migration. Science Signaling. 7 (353), 112 (2014).
  12. Oktay, M. H., Jones, J. G. TMEM: a novel breast cancer dissemination marker for the assessment of metastatic risk. Biomarkers in Medicine. 9 (2), 81-84 (2015).
  13. Roussos, E. T., et al. Mena invasive (Mena(INV)) and Mena11a isoforms play distinct roles in breast cancer cell cohesion and association with TMEM. Clinical & Experimental Metastasis. 28 (6), 515-527 (2011).
  14. Harney, A. S., et al. The Selective Tie2 Inhibitor Rebastinib Blocks Recruitment and Function of Tie2(Hi) Macrophages in Breast Cancer and Pancreatic Neuroendocrine Tumors. Molecular Cancer Therapeutics. 16 (11), 2486-2501 (2017).
  15. Bates, D. O., Lodwick, D., Williams, B. Vascular endothelial growth factor and microvascular permeability. Microcirculation. 6 (2), 83-96 (1999).
  16. Lee, Y. C. The involvement of VEGF in endothelial permeability: a target for anti-inflammatory therapy. Current Opinion in Investigational Drugs. 6 (11), 1124-1130 (2005).
  17. Roberts, W. G., Palade, G. E. Neovasculature induced by vascular endothelial growth factor is fenestrated. Cancer Research. 57 (4), 765-772 (1997).
  18. Stan, R. V., et al. Immunoisolation and partial characterization of endothelial plasmalemmal vesicles (caveolae). Molecular Biology of the Cell. 8 (4), 595-605 (1997).
  19. Roberts, W. G., Palade, G. E. Increased microvascular permeability and endothelial fenestration induced by vascular endothelial growth factor. Journal of Cell Science. 108, 2369-2379 (1995).
  20. Arwert, E. N., et al. A Unidirectional Transition from Migratory to Perivascular Macrophage Is Required for Tumor Cell Intravasation. Cell Reports. 23 (5), 1239-1248 (2018).
  21. Kadioglu, E., De Palma, M. Cancer Metastasis: Perivascular Macrophages Under Watch. Cancer Discovery. 5 (9), 906-908 (2015).
  22. Hughes, R., et al. Perivascular M2 Macrophages Stimulate Tumor Relapse after Chemotherapy. Cancer Research. 75 (17), 3479-3491 (2015).
  23. Riabov, V., et al. Role of tumor associated macrophages in tumor angiogenesis and lymphangiogenesis. Frontiers in Physiology. 5, 75 (2014).
  24. Squadrito, M. L., De Palma, M. Macrophage regulation of tumor angiogenesis: implications for cancer therapy. Molecular Aspects of Medicine. 32 (2), 123-145 (2011).
  25. Ferrara, N. Role of myeloid cells in vascular endothelial growth factor-independent tumor angiogenesis. Current Opinion in Hematology. 17 (3), 219-224 (2010).
  26. Solinas, G., Germano, G., Mantovani, A., Allavena, P. Tumor-associated macrophages (TAM) as major players of the cancer-related inflammation. Journal of Leukocyte Biology. 86 (5), 1065-1073 (2009).
  27. Venneri, M. A., et al. Identification of proangiogenic TIE2-expressing monocytes (TEMs) in human peripheral blood and cancer. Blood. 109 (12), 5276-5285 (2007).
  28. Lewis, C. E., De Palma, M., Naldini, L. Tie2-expressing monocytes and tumor angiogenesis: regulation by hypoxia and angiopoietin-2. Cancer Research. 67 (18), 8429-8432 (2007).
  29. Mazzieri, R., et al. Targeting the ANG2/TIE2 axis inhibits tumor growth and metastasis by impairing angiogenesis and disabling rebounds of proangiogenic myeloid cells. Cancer Cell. 19 (4), 512-526 (2011).
  30. Lewis, C. E., Ferrara, N. Multiple effects of angiopoietin-2 blockade on tumors. Cancer Cell. 19 (4), 431-433 (2011).
  31. Gabrusiewicz, K., et al. Anti-vascular endothelial growth factor therapy-induced glioma invasion is associated with accumulation of Tie2-expressing monocytes. Oncotarget. 5 (8), 2208-2220 (2014).
  32. Karagiannis, G. S., Condeelis, J. S., Oktay, M. H. Chemotherapy-induced metastasis: mechanisms and translational opportunities. Clinical & Experimental Metastasis. , (2018).
  33. Senger, D. R., et al. Tumor cells secrete a vascular permeability factor that promotes accumulation of ascites fluid. Science. 219 (4587), 983-985 (1983).
  34. Obermeier, B., Verma, A., Ransohoff, R. M. The blood-brain barrier. Handbook of Clinical Neurology. 133, 39-59 (2016).
  35. Satchell, S. C., Braet, F. Glomerular endothelial cell fenestrations: an integral component of the glomerular filtration barrier. American Journal of Physiology: Renal Physiology. 296 (5), 947-956 (2009).
  36. Stan, R. V. Endothelial stomatal and fenestral diaphragms in normal vessels and angiogenesis. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 11 (4), 621-643 (2007).
  37. Mruk, D. D., Cheng, C. Y. The Mammalian Blood-Testis Barrier: Its Biology and Regulation. Endocrine Reviews. 36 (5), 564-591 (2015).
  38. Entenberg, D., et al. Imaging Tumor Cell Movement in Vivo. Current Protocols in Cell Biology. 58 (1), 1-19 (2013).
  39. Entenberg, D., et al. Setup and use of a two-laser multiphoton microscope for multichannel intravital fluorescence imaging. Nature Protocols. 6 (10), 1500-1520 (2011).
  40. Sasmono, R. T., et al. A macrophage colony-stimulating factor receptor-green fluorescent protein transgene is expressed throughout the mononuclear phagocyte system of the mouse. Blood. 101 (3), 1155-1163 (2003).
  41. Ovchinnikov, D. A., et al. Expression of Gal4-dependent transgenes in cells of the mononuclear phagocyte system labeled with enhanced cyan fluorescent protein using Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP double-transgenic mice. Journal of Leukocyte Biology. 83 (2), 430-433 (2008).
  42. Entenberg, D., et al. Time-lapsed, large-volume, high-resolution intravital imaging for tissue-wide analysis of single cell dynamics. Methods. 128, 65-77 (2017).
  43. Pastoriza, J. M., et al. Black race and distant recurrence after neoadjuvant or adjuvant chemotherapy in breast cancer. Clinical & Experimental Metastasis. , (2018).
  44. Williams, J. K., et al. Validation of a device for the active manipulation of the tumor microenvironment during intravital imaging. Intravital. 5 (2), 1182271 (2016).
  45. Harney, A. S., Wang, Y., Condeelis, J. S., Entenberg, D. Extended Time-lapse Intravital Imaging of Real-time Multicellular Dynamics in the Tumor Microenvironment. Journal of Visualized Experiments. (112), e54042 (2016).
  46. Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
  47. Roussos, E. T., et al. Mena invasive (MenaINV) promotes multicellular streaming motility and transendothelial migration in a mouse model of breast cancer. Journal of Cell Science. 124, 2120-2131 (2011).
  48. Karagiannis, G. S., et al. Neoadjuvant chemotherapy induces breast cancer metastasis through a TMEM-mediated mechanism. Science Translational Medicine. 9 (397), (2017).
  49. Chang, Y. S., Jalgaonkar, S. P., Middleton, J. D., Hai, T. Stress-inducible gene Atf3 in the noncancer host cells contributes to chemotherapy-exacerbated breast cancer metastasis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (34), 7159-7168 (2017).
  50. Jain, R. K. Normalization of tumor vasculature: an emerging concept in antiangiogenic therapy. Science. 307 (5706), 58-62 (2005).
  51. Winkler, F., et al. Kinetics of vascular normalization by VEGFR2 blockade governs brain tumor response to radiation: role of oxygenation, angiopoietin-1, and matrix metalloproteinases. Cancer Cell. 6 (6), 553-563 (2004).
  52. Goel, S., et al. Normalization of the vasculature for treatment of cancer and other diseases. Physiological Reviews. 91 (3), 1071-1121 (2011).
  53. Jain, R. K. Normalizing tumor microenvironment to treat cancer: bench to bedside to biomarkers. Journal of Clinical Oncology. 31 (17), 2205-2218 (2013).
  54. Carmeliet, P., Jain, R. K. Principles and mechanisms of vessel normalization for cancer and other angiogenic diseases. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (6), 417-427 (2011).
  55. Meijer, E. F., Baish, J. W., Padera, T. P., Fukumura, D. Measuring Vascular Permeability In Vivo. Methods in Molecular Biology. 1458, 71-85 (2016).

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