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Cancer Research

Evaluación del microambiente tumoral de la permeabilidad vascular mediada por la puerta de la puerta asociada con la diseminación de células cancerosas mediante imágenes intravitales y análisis de tejido fijo

Published: June 26, 2019
doi:
10.3791/59633
, , , , , , ,
1Department of Anatomy and Structural Biology,Albert Einstein College of Medicine, 2Gruss-Lipper Biophotonics Center,Albert Einstein College of Medicine, 3Integrated Imaging Program,Albert Einstein College of Medicine, 4Department of Surgery,Montefiore Medical Center, 5Department of Pathology,Montefiore Medical Center

Summary

Describimos dos métodos para evaluar la permeabilidad vascular transitoria asociada con el microambiente tumoral de la función de la puerta de metástasis (TMEM) y la intravasación de células cancerosas mediante inyección intravenosa de dextran de alto peso molecular (155 kDa) en ratones. Los métodos incluyen imágenes intravitales en animales vivos y análisis de tejido fijo utilizando inmunofluorescencia.

Abstract

La causa más común de mortalidad relacionada con el cáncer es la metástasis, un proceso que requiere la diseminación de las células cancerosas del tumor primario a los sitios secundarios. Recientemente, establecimos que la diseminación de células cancerosas en el cáncer de mama primario y en los sitios metastásicos en el pulmón ocurre sólo en las puertas llamadas Microambiente Tumoral de Metástasis (TMEM). El número de puerta tmEM es pronóstico para la recurrencia distante de la enfermedad metastásica en pacientes con cáncer de mama. Las puertas TMEM están compuestas por una célula cancerosa que expresa excesivamente la proteína reguladora de la actina Mena en contacto directo con un macrófago perivascular y proangiogénico que expresa altos niveles de TIE2 y VEGF, donde ambas células están estrechamente unidas a una sangre recipiente endotelial. Las células cancerosas pueden entrar en travas a través de las puertas de TMEM debido a la permeabilidad vascular transitoria orquestada por la actividad articular del macrófago asociado a TMEM y la célula cancerosa mena-expressing asociada a TMEM. En este manuscrito, describimos dos métodos para la evaluación de la permeabilidad vascular transitoria mediada por TMEM: imágenes intravitales e inmunofluorescencia de tejido fijo. Aunque ambos métodos tienen sus ventajas y desventajas, la combinación de los dos puede proporcionar los análisis más completos de la permeabilidad vascular mediada por TMEM, así como los requisitos previos microambientales para la función TMEM. Dado que el proceso metastásico en el cáncer de mama, y posiblemente otros tipos de cáncer, implica la diseminación de células cancerosas a través de las puertas TMEM, es esencial emplear métodos bien establecidos para el análisis de la actividad de las puertas TMEM. Los dos métodos descritos aquí proporcionan un enfoque integral para el análisis de la actividad de las puertas de TMEM, ya sea en animales ingenuos o tratados farmacológicamente, lo cual es de suma importancia para los ensayos preclínicos de agentes que previenen las células cancerosas difusión a través de TMEM.

Introduction

Los avances recientes en nuestra comprensión de la metástasis oncológica han descubierto que la transición epitelial a mesenquimal (EMT) y la inducción de una subpoblación migratoria/invasiva de células cancerosas no son, por sí solas, suficientes para la diseminación hematogena 1. De hecho, anteriormente se pensaba que la metástasis de las células cancerosas se intravasa a través de la totalidad del endotelio asociado al cáncer, ya que la neovasculatura tumoral se caracteriza a menudo por una baja cobertura de pericita, y como tal, es altamente permeable y inestables2,3,4. Aunque son altamente sugestivas de funciones defectuosas dentro del tumor, las modificaciones vasculares durante la carcinogénesis no proporcionan evidencia según el se de que las células tumorales pueden penetrar los vasos sanguíneos fácilmente y de manera incontrolada. Las estadísticas de los estudios de imágenes intravitales (IVI), en los que las células tumorales están etiquetadas fluorescentemente y la vasculatura se etiqueta mediante la inyección intravenosa de sondas fluorescentes (como dextran o puntos cuánticos), muestran que, mientras que los vasos tumorales son uniformemente permeable a bajo peso molecular dextrans (por ejemplo, 70 kD), dextrans de alto peso molecular (155 kD) y células tumorales pueden cruzar el endotelio sólo en sitios especializados de intravasión que se encuentran preferentemente en el puntoderama vascular5, 6 , 7. Los análisis inmunohistoquímicos (IHC) utilizando modelos animales y material humano derivado del paciente han demostrado que estos sitios son “puertas” que se especializan en regular la permeabilidad vascular, local y transitoriamente, proporcionando una breve ventana de oportunidad de que las células cancerosas migratorias/invasivas entren en la circulación. Estas puertas se denominan “Microambiente tumoral de metástasis” o “TMEM”, y, muy esperadamente, su densidad se correlaciona con un mayor riesgo de desarrollar enfermedad metastásica en pacientes con cáncer de mama8,9, 10.

Cada puerta TMEM consta de tres tipos distintos de células: un macrofaje perivascular, una célula tumoral que expresa excesivamente la proteína reguladora de actina mamífero habilitado (Mena), y una célula endotelial, todas en contacto físico directo entre sí1, 5,9,10,11,12,13. El evento clave para la función de TMEM como puerta de intravasión es la liberación localizada del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) en el vaso subyacente por el macroófago perivascular14. EL VEGF puede interrumpir las unión homotípica entre las células endoteliales15,16,17,18,19, un fenómeno que resulta en fugas vasculares transitorias, también conocida como permeabilidad “ráfaga” como se describe en los estudios IVI 5. Se ha demostrado que los macrófagos TMEM expresan el receptor de tirosina quinasa TIE2, que es necesario parala función TMEM mediada por VEGF y el acceso a estos macrófagos al nicho perivascular 5,20,21 , 22. Además de regular la diseminación y metástasis de las células cancerosas, se ha demostrado que los macrofagos TIE2+ son reguladores centrales de la angiogénesis tumoral21,22,23, 24,25,26,27,28,29,30,31. Como tal, los macrófagos TIE2+ representan un componente crítico del microambiente tumoral y el principal regulador de la cascada metastásica.

Para conceptualizar mejor la permeabilidad vascular mediada por TMEM (es decir, “bursting”), es muy importante distinguirla de otros modos de permeabilidad vascular que no están asociados con la disolución de las uniones celulares endoteliales. En un endotelio intacto (uno cuyas uniones apretadas y adheridas no se interrumpen), hay tres tipos principales de permeabilidad vascular: a) la pinocitosis, que puede, o no, acoplarse a la transcitosis del material ingerido; (b) transporte de material a través de fenestras endoteliales; y c) transporte de material a través de la vía paracelular, que está regulada por cruces herméticas endoteliales15,16,17,18,19,32 , 33 , 34. Aunque desregulados en muchos tumores, los modos antes mencionados de permeabilidad vascular se han descrito principalmente en el contexto de la fisiología normal del tejido y la homeostasis, cuyos extremos son tejidos con permeabilidad limitada ( por ejemplo, barrera hematoencefálica, barrera hematoencefálica) o permeabilidad abundante (p. ej., capilares fenestrados del aparato glomerular renal)34,35,36,37.

Utilizando imágenes intravitales multifotonas y microscopía de inmunofluorescencia multiplexada, somos capaces de distinguir entre la permeabilidad vascular mediada por TMEM (“ráfaga”) y otros modos de permeabilidad vascular en tumores mamarios. Para lograresto, realizamos una sola inyección intravenosa de una sonda de alto peso molecular, etiqueta fluorescentemente en ratones. Los eventos de ráfaga espontánea pueden ser capturados usando imágenes intravitales en ratones vivos; o alternativamente, la extravasación de la sonda se puede cuantificar mediante estudios de colocalización con vasculatura de sangre (por ejemplo, CD31+ o Endomucin+) y puertas TMEM mediante microscopía de inmunofluorescencia. Los protocolos presentados aquí describen ambas técnicas, que podrían utilizarse de forma independiente o conjunta entre sí.

Protocol

Todos los experimentos con animales vivos deben llevarse a cabo de acuerdo con las pautas y regulaciones de uso y cuidado de los animales. Los procedimientos descritos en este estudio se llevaron a cabo de acuerdo con las regulaciones de los Institutos Nacionales de Salud sobre el cuidado y uso de animales experimentales y con la aprobación del Albert Einstein College of Medicine Animal Care and Use (IACUC). 1. Evaluación de la “permeabilidad de ráfaga” utilizando imágenes de animales vivos<…

Representative Results

Los procedimientos experimentales descritos en este artículo de protocolo se resumen e ilustran brevemente en la Figura 1A-C. Para medir la permeabilidad vascular mediada por TMEM (“actividad de ráfaga”) y para reducir el ruido experimental de otros modos de permeabilidad vascular (es decir, transcelular y paracelular, como se explica en la introducción), realizamos vía intravenosa (es decir, v.) inyección de sondas de alto peso molecular, co…

Discussion

Aquí, delineamos dos protocolos que se pueden aplicar para visualizar y cuantificar un tipo específico de permeabilidad vascular que está presente en las puertas de TMEM y se asocia con la interrupción de las uniones vasculares apretadas y adheridas. Este tipo de permeabilidad vascular es transitorio y controlado por el complejo de células TMEM tripartito, como se explicó anteriormente5. La capacidad de identificar y cuantificar la permeabilidad vascular asociada a TMEM es crucial para la ev…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nos gustaría agradecer al Analytical Imaging Facility (AIF) del Albert Einstein College of Medicine por su apoyo a las imágenes. Este trabajo fue apoyado por subvenciones del NCI (P30CA013330, CA150344, CA 100324 y CA216248), la SIG 1S10OD019961-01, el Centro de Biofotónica Gruss-Lipper y su Programa Integrado de Imágenes, y la Beca de Capacitación Ruth L. Kirschstein T32 de Montefiore para el Estudio del Microambiente Tumoral (CA200561).

GSK co-escribió el manuscrito, realizó imágenes para las figuras 1C y 3B, desarrolló un protocolo de análisis de tejido fijo y analizó e interpretó todos los datos; JMP co-escribió el manuscrito, y realizó la cirugía y la imagen intravital para las Figuras 1B,2C y 3A; LB & AC realizó la cirugía y la imagen intravital para la Figura 2B; RJ realizó la cirugía y la imagen intravital para la Figura 2A; JSC co-escribió el manuscrito y analizó e interpretó todos los datos; MHO co-escribió el manuscrito y analizó e interpretó todos los datos; y DE realizó la cirugía y la imagen intravital para la Figura 2D, co-escribió el manuscrito, desarrolló análisis de tejido fijo y protocolos de imágenes intravitales, y analizó e interpretó todos los datos.

Materials

Anti-rabbit IgG (Alexa 488) Life Technologies Corporation A-11034
Anti-rat IgG (Alexa 647) Life Technologies Corporation A-21247
Bovine Serum Albumin Fisher Scientific BP1600-100
Citrate Eng Scientific Inc 9770
Cover Glass Slips Electron Microscopy Sciences 72296-08
Cyanoacrylate Adhesive Henkel Adhesive 1647358
DAPI Perkin Elmer FP1490
Dextran-Tetramethyl-Rhodamine Sigma Aldrich T1287
DMEM/F12 Gibco 11320-033
Endomucin (primary antibody) Santa Cruz Biotechnology sc-65495
Enrofloxacin Bayer 84753076 v-06/2015
Fetal Bovine Serum Sigma Aldrich F2442
Fish Skin Gelatin Fisher Scientific G7765
Insulin Syringe Becton Dickinson 309659
Isofluorane Henry Schein NDC 11695-6776-2
Matrigel Corning CB40234 Artificial extracellular matrix
Needle (30 G) Becton Dickinson 305128
Phosphate Buffered Saline Life Technologies Corporation PBS
Polyethylene Tubing Scientific Commodities Inc BB31695-PE/1
Pulse Oximeter Kent Scientific MouseOx
Puralube Vet Ointment Dechra NDC 17033-211-38
Quantum Dots Life Technologies Corporation Q21561MP
Rubber McMaster Carr 1310N14
TMR (primary antibody) Invitrogen A6397
Tween-20 MP Biologicals TWEEN201
Xylene Fisher Scientific 184835
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Karagiannis, G. S., Pastoriza, J. M., Borriello, L., Jafari, R., Coste, A., Condeelis, J. S., Oktay, M. H., Entenberg, D. Assessing Tumor Microenvironment of Metastasis Doorway-Mediated Vascular Permeability Associated with Cancer Cell Dissemination using Intravital Imaging and Fixed Tissue Analysis. J. Vis. Exp. (148), e59633, doi:10.3791/59633 (2019).
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