JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Immunology and Infection

In Vitro ELISA test til vurdering af rabiesvaccine potens

Published: May 11, 2020
doi:
10.3791/59641
,
1Unit Antiviral Strategies, OIE Reference Laboratories for Rift Valley Fever Virus & Crimean Congo Hemorrhagic Fever Virus,Institut Pasteur, 2Institut Pasteur de Guinée, Conakry

Summary

Her beskriver vi en indirekte ELISA sandwich immunfangst til bestemmelse af det immunogene glycoprotein indhold i rabiesvacciner. Denne test bruger en neutraliserende Monoklonal Antistof (mAb-D1) genkende glycoprotein trimers. Det er et alternativ til in vivo NIH-testen for at følge konsistensen af vaccinestyrken under produktionen.

Abstract

Den voksende globale bekymring for dyrevelfærden tilskynder fabrikanter og de nationale kontrollaboratorier til at følge 3Rs-strategien for erstatning, reduktion og forbedring af laboratoriedyreforsøg. Det anbefales at udvikle in vitro-tilgange på WHO-plan og på europæisk plan som alternativer til NIH-testen til vurdering af rabiesvaccinestyrken. På overfladen af rabiesvirus (RABV) partikel, trimningaf glycoprotein udgør den største immunogen til at fremkalde Viral Neutraliserende Antistoffer (VNAbs). En ELISA-test, hvor neutraliserende monoklonale antistoffer (mAb-D1) genkender glycoproteinets trimeriske form, er blevet udviklet til at bestemme indholdet af det oprindelige foldede trimeric glycoprotein sammen med produktionen af vaccinebatcherne. Denne in vitro-styrketest viste en god overensstemmelse med NIH-testen og er fundet egnet i kollaborative forsøg udført af RABV-vaccineproducenter og OMCL’er. Undgåelse af anvendelse af dyr er et opnåeligt mål i den nærmeste fremtid.

Den præsenterede metode er baseret på en indirekte ELISA-sandwichimmunfangst ved hjælp af mAb-D1, som genkender de antigene steder III (aa 330 til 338) af det trimeriske RABV glycoprotein, dvs. mAb-D1 anvendes til både overfladebehandling og påvisning af glycoproteintrimere, der findes i vaccinebatchen. Da epitop er anerkendt på grund af dens konformationelle egenskaber, den potentielt denatureret glycoprotein (mindre immunogenic) kan ikke tilfangetages og detekteres af mAb-D1. Den vaccine, der skal testes, inkuberes i en plade, der er sensibiliseret med mAb-D1. Bundne trimeric RABV glycoproteiner identificeres ved at tilføje mAb-D1 igen, mærket med peroxidase og derefter afsløret i nærvær af substrat og kromogen. Sammenligning af den målte absorbans for den testede vaccine og referencevaccinen gør det muligt at bestemme indholdet af immunogene glycoprotein.

Introduction

Siden mere end 50 år, nih test1 bruges som en guld standard metode til at vurdere rabies vaccine potens før batch frigivelse. Denne test består af en intraperitoneal immunisering af grupper af mus med den vaccine, der skal testes efterfulgt af en intracerebral (IC) udfordring 14 dage senere med Challenge Virus Standard (CVS) stamme af rabiesvirus (RABV). Styrken vurderes ud fra andelen af mus, der overlever IC-udfordringen. Selv om WHO2 og European Pharmacopeia3 stadig kræver NIH-testen til vurdering af vaccinens styrke, lider denne test under flere forhindringer: resultaterne er meget variable4; infektiøs RABV anvendes under udfordringen, og dette kræver både tekniske færdigheder og strenge biosikkerhedsforanstaltninger; der anvendes et stort antal dyr, og udfordringens alvor giver anledning til alvorlige etiske betænkeligheder5. En mindre alvorlig variation af denne test er blevet udviklet: to uger efter intra-peritoneal immunisering, mus er ikke udfordret af IC, men blødte og testet for tilstedeværelsen af specifikke RABV neutraliserende antistoffer (VNAbs) i deres serum ved hjælp af en in vitro-neutralisering test. Denne test kræver dog stadig at ofre et stort antal laboratoriemus, selv om den allerede er i brug for veterinærvaccinerne6,7 og er blevet overvejet til humane vacciner8.

Fra nu af opfordrer både internationale9 og europæiske10-anbefalinger fabrikanter og nationale kontrollaboratorier (officielle lægemiddelkontrollaboratorier – OMCL’er) til at gennemføre erstatning, reduktion og forbedring af laboratoriedyreforsøg, der kaldes 3Rs-strategien. Det europæiske direktiv 2010/63/EU (gældende siden 2013/01/01) vedrørende beskyttelse og velfærd for dyr har også skærpet begrænsningerne for vaccineproducenter og -laboratorier, der er involveret i kvalitetskontrol af rabiesvacciner samt rabiesforskning11. Som følge heraf er udvikling, validering og anvendelse af alternative in vitro-tilgange nu blevet en prioritet. Disse er ikke kun etisk forsvarlige, men kan også reducere batchtestomkostningerne og forkorte tiden for resultater til timer i stedet for uge3.

På overfladen af RABV-partiklen, glycoprotein vedtager en trimeric form12,13,14,15,16. I rabiesvaccine udgør denne oprindelige trimeriske form den vigtigste immunogeninducerende VNAbs17, mens monomeriske, opløselige eller denaturerede glycoproteiner er dårligt immunogene18,19. Således er bevarelsen af glycoproteinafet langs vaccineproduktionsprocessen en god indikator for bevarelsen af et optimalt immungent potentiale. Flere immunokemiske metoder, såsom antistofbindingstest20,21, enkeltradial immundiffusion (SRD) test22 og ELISA-test23,,24,,25,26,27, anbefales af WHO’s tekniske rapport serie2 og den europæiske monografi3 for at kvantificere antigenindholdet i rabiesvacciner. Disse anvendes af producenterne til at overvåge sammenhængen i vaccineproduktionen og af OMCL til at vurdere den konsekvente formulering af partier af humane vacciner28, selv om NIH-testen stadig tages i betragtning til styrken.

Men alle disse immunokemiske metoder er ikke ækvivalente. SRD-testen kræver en forbehandling , som kan ændre de membranforankrede trimler og resultere i en opløselig eller denatureret form af glycoprotein22,29. Derfor er SRD ikke meget effektiv til at diskriminere mellem immungene og ikke-immungene glycoproteiner, hvilket resulterer i en ufuldstændig vurdering af immunogeniciteten af et vaccineparti. I modsætning hertil er ELISA-testen mere følsom22, bevarer glycoproteinets oprindelige struktur og er mere hensigtsmæssigt at bestemme indholdet af de oprindeligt foldede trimmere af glycoprotein. ELISA-testen kan anvende enten kaninpolyklonale eller mus monoklonale anti-glycoprotein antistoffer renset eller koncentreret med ammoniumsulfat. Undersøgelser har vist god overensstemmelse mellem NIH-testen og det antigenindhold, som ELISA har evalueret i vacciner, og konkluderet, at ELISA-metoder er egnede til in vitro-styrketesten. Dette slår til lyd for , at ELISA-test i det mindste kan supplere eller endog erstatte NIH-test4,26,27,30,31,32,33. I dag anbefaler Den Europæiske Farmakopé, at der anvendes validerede serologiske eller immunokemiske analyser som alternativer til NIH-test3. Den fuldstændige undgåelse af dyrs anvendelse til vaccinepotens er blevet et realistisk perspektiv.

Metoden nedenfor er baseret på en indirekte ELISA-sandwichimmunfangst ved hjælp af en monoklonal antistofkloning af mus (mAb-D1 ), som genkender de antigene steder III (aa 330 til 338) af det trimeriske RABV glycoprotein15,34. Denne metode blev oprindeligt udviklet på Institut Pasteur26,30 ogderefter optimeret og valideret af Agence Nationale de Sécurité du Médicament et des produits de santé (ANSM) laboratoriet,dvs.4, MAb-D1 anvendes både til sensibilisering af pladen og efterfølgende til detektering af det tilfangetagne antigen. Dette giver mulighed for specifik kvantificering af glycoproteintrimere, dvs. Den mAb-D1, der anvendes til påvisning, er mærket med peroxidase, som afsløres ved tilstedeværelse af substrat og kromogen. Sammenligning af den målte absorbans for den testede vaccine og referencevaccinen gør det muligt at bestemme indholdet af immunogene glycoprotein. Det skal bemærkes, at den samme type analyse kan anvendes til forskellige mAbs, der genkender forskellige antigene steder af RABV glycoprotein35. Metoden til at opnå og rense eller koncentrere sig med ammoniumsulfat anti-glycoprotein polyklonale kanin immunglobuliner G (IgG) eller monoklonale mus globuliner er blevet udførligt beskrevet tidligere36 sammen med metoden til at konjugere antistoffer med peroxidase37.

Protocol

1. Sikkerhedsforanstaltninger BEMÆRK: Denne metode gælder for både levende RABV og inaktiveret vaccine. Brug gode laboratoriepraksis- og sikkerhedsprocedurer. Bær passende personligt beskyttelsesudstyr (PPE), herunder engangscoat, handsker, maske, briller osv. Når den levende virus titreres, skal du bruge et biologisk sikkerhedsskab i klasse II. Betragt ethvert materiale, der er i kontakt med prøverne (reagenser, vaskeopløsninger osv.), som infekti?…

Representative Results

I følgende eksempel anvendes referencevaccinen Lot 09, der består af renset inaktiverede rabiesviruspartikler (PV vaccine stamme). Glycoproteintrimersindholdet (10 μg/ml) i dette er blevet fastlagt efter bestemmelse af den samlede mængde virale proteiner (BCA-test) og vurdering af procentdelen af glycoprotein ved SDS-polyacrylamid gel elektroforese. Alternativt kan der anvendes en kalibreret referencevaccine,th f.eks. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page…

Discussion

Den epitop, der genkendes af mAb-D1, er placeret på det antigene sted III i RABV glycoprotein, som ikke kun er immunodominerende for induktion af VNAbs, men også involveret i neurovirulence, patogenicitet40,41 og receptorgenkendelse42. Der er en anden vigtig antigen site langs glycoprotein, site II43, mod hvilken flere MAbs er blevet isoleret såsom mAb-WI-111235. Disse kan også bruges i d…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dr. Sylvie Morgeaux og Dr. Jean-Michel Chapsal skal anerkendes for deres centrale deltagelse for at etablere ELISA-analysen om vaccinepartier og for at organisere internationale workshops og samarbejdsstudier. Vi takker Sabrina Kali for kritisk læsning af manuskriptet. Dr. Pierre Perrin var ansvarlig for isolering og karakterisering af mAb-D1. Dette arbejde er hovedsagelig blevet støttet af Institut Pasteur finansiering.

Materials

Class II Biological Safety Cabinet ThermoFisher Scientific 10445753 if titrating live virus
Clear Flat-Bottom Immuno Nonsterile 96-Well Plates, 400 µL, MAXISORP ThermoFisher Scientific 439454 good for binding to the loaded antibody
Equip Labo Polypropylene Laboratory Fume Hood ThermoFisher Scientific 12576606 for the preparation of sulfuric acid
Immunology Plate Strong
Adsorption MAXISORP Flat Bottom
Well F96		 Dutscher 55303 good for binding to the loaded antibody
Microplate Sealing Tape(100 sheets) ThermoFisher Scientific 15036
Microplate  single mode reader Sunrise TECAN
Microplate shaker-incubator Dutscher 441504
Microplate washer Wellwash ThermoFisher Scientific 5165000
Multichannel pipette (30-300 µL) 12 channels ThermoFisher Scientific 4661180N
Single Channel pipettes (Kit 2 : Finnpipettes F2 0.2-2 μL micro, 2-20 μL, 20-200 μL & 100-1000 μL) ThermoFisher Scientific 4700880
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Seligmann, E. B. The NIH test for potency. Laboratory Techniques in Rabies. , 279-286 (1973).
  2. Annex 2. Recommendations for inactivated rabies vaccine for human use produced in cell substrates and embryonated eggs. WHO Technical Report Series. 941, 83-132 (2007).
  3. . Rabies vaccine for human use prepared in cell cultures. European Pharmacopoeia. , (2008).
  4. Gibert, R., Alberti, M., Poirier, B., Jallet, C., Tordo, N., Morgeaux, S. A relevant in vitro ELISA test in alternative to the in vivo NIH test for human rabies vaccine batch release. Vaccine. 31, 6022-6029 (2013).
  5. Stokes, W., et al. Report on the international workshop on alternative methods for human and veterinary rabies vaccine testing: state of the science and planning the way forward. Biologicals. 40 (5), 369-381 (2012).
  6. Krämer, B., Bruckner, L., Daas, A., Milne, C. Collaborative study for validation of a serological potency assay for rabies vaccine (inactivated) for veterinary use. Pharmeuropa Bio & Scientific Notes. 2, 37-55 (2010).
  7. Krämer, B., Kamphuis, E., Hanschmann, K. M., Milne, C., Daas, A., Duchow, K. A multi-dose serological assay suitable to quantify the potency of inactivated rabies vaccines for veterinary use. Biologicals. 41, 400-406 (2013).
  8. Fitzgerald, E. A., Gallagher, M., Hunter, W. S., Seligmann, E. B. Use of the antibody assay in immunized mice for the determination of rabies vaccine potency. Developments in Biological Standardization. 40, 183-186 (1978).
  9. Milstien, J., Grachev, V., Padilla, A., Griffiths, E., Brown, F., Cussler, K., Hendriksen, C. WHO activities towards the three Rs in the development and control of biological products. Replacement, reduction and refinement of animal experiments in the development and control of biological products. , 31-39 (1996).
  10. Behr-Gross, M. E., Spieser, J. M. Contributions of the European OMCL Network and Biological Standardisation Programme to animal Welfare. ALTEX-Alternatives to Animal Experimentation. 23, 21-28 (2006).
  11. . Directive 2010/63/EU of the European Parliament and the Council of 22 September 2010 on the protection of animals used for scientific purposes. Official Journal of European Union. L276, 33-79 (2010).
  12. Whitt, M. A., Buonocore, L., Prehaud, C., Rose, J. K. Membrane fusion activity, oligomerization and assembly of the rabies virus glycoprotein. Virology. 185 (2), 681-688 (1991).
  13. Gaudin, Y., Ruigrok, R. W., Tuffereau, C., Knossow, M., Flamand, A. Rabies virus glycoprotein is a trimer. Virology. 187, 627-632 (1992).
  14. Roche, S., Gaudin, Y. Characterization of the equilibrium between the native and fusion-inactive conformation of rabies virus glycoprotein indicates that the fusion complex is made of several trimers. Virology. 297 (1), 128-135 (2002).
  15. Desmézières, E., Maillard, A. P., Gaudin, Y., Tordo, N., Perrin, P. Differential stability and fusion activity of Lyssavirus glycoprotein trimers. Virus Research. 91 (2), 181-187 (2003).
  16. Koraka, P., et al. A recombinant rabies vaccine expressing the trimeric form of the glycoprotein confers enhanced immunogenicity and protection in outbred mice. Vaccine. 32 (36), 4644-4650 (2014).
  17. Wiktor, T., Gyorgy, E., Schlumberger, D., Sokol, F., Koprowski, H. Antigenic properties of rabies virus components. Journal of Immunology. 110, 269-276 (1973).
  18. Gamoh, K., Senda, M., Itoh, O., Muramatsu, M., Hirayama, N., Koike, R., et al. Use of ELISA for in vitro potency test of rabies vaccines for animal use. Biologicals. 24, 95-101 (1996).
  19. Dietzschold, B., Wiktor, T., Wunner, W., Varrichio, A. Chemical and immunological analysis of the rabies soluble glycoprotein. Virology. 124, 330-337 (1983).
  20. Fitzgerald, E., Green, O., Seligmann, E. Rabies vaccine potency testing: a comparison between the antibody-binding test and the NIH test. Symposia Series in Immunobiological Standard. 21, 300-307 (1974).
  21. Barth, R., Groβ-Albenhausen, E., Jaeger, O., Milcke, L. The antibody-binding test, a useful method for quantitative determination of inactivated rabies virus antigen. Journal of Biological Standardization. 9, 81-89 (1981).
  22. Ferguson, M., Schild, G. A single-radial-immunodiffusion technique for the assay of rabies glycoprotein antigen: application for the potency tests of vaccines against rabies. Journal of General Virology. 59, 197-201 (1982).
  23. Atanasiu, P., Perrin, P., Delagneau, J. F. Use of an enzyme immunoassay with protein A for rabies antigen and antibody determination. Developments in Biological Standardization. 46, 207-215 (1980).
  24. van der Marel, P., van Wezel, A. Quantitative determination of rabies antigen by ELISA. Developments in Biological Standardization. 50, 267-275 (1981).
  25. Adamovicz, P., Aguillon, F., David, A., Le Fur, R., Mazert, M. C., Perrin, P., et al. The use of various immunochemical, biochemical and biological methods for the analysis of rabies virus production in tissue cultures. Developments in Biological Standardization. 55, 191-197 (1984).
  26. Lafon, M., Perrin, P., Versmisse, P., Sureau, P. Use of monoclonal antibody for quantification of rabies vaccine glycoprotein by enzyme immunoassay. Journal of Biological Standardization. 13, 295-301 (1985).
  27. Thraenhart, O., Ramakrishnan, K. Standardization of an enzyme immunoassay for the in vitro potency assay of inactivated tissue culture rabies vaccines: determination of the rabies virus glycoprotein with polyclonal antisera. Journal of Biological Standardization. 17, 291-309 (1989).
  28. Council of Europe. . Official Authority Batch release of Rabies vaccines Guideline. , (2019).
  29. Ferguson, M., Seagroatt, V., Schild, G. A collaborative study on the use of single radial immunodiffusion for the assay of rabies virus glycoprotein. Developments in Biological Standards. 12, 283-294 (1984).
  30. Perrin, P., Morgeaux, S., Sureau, P. In vitro rabies vaccine potency appraisal by ELISA: advantages of the immunocapture method with a neutralizing anti-glycoprotein monoclonal antibody. Biologicals. 18, 321-330 (1990).
  31. Rooijakkers, E. J., Uittenbogaard, J. P., Groen, J., Osterhaus, A. D. Rabies vaccine potency control: comparison of ELISA systems for antigenicity testing. Journal of Virological Methods. 58, 111-119 (1996).
  32. Rooijakkers, E. J., Uittenbogaard, J. P., Groen, J., van Herwijnen, J., Osterhaus, A. D., Brown, F., Cussler, K., Hendriksen, C. . Development and evaluation of alternative testing methods for the in vivo NIH potency test used for the quality control of inactivated rabies vaccines. , 137-145 (1996).
  33. Fournier-Caruana, J., et al. Inactivated rabies vaccine control and release: use of an ELISA method. Biologicals. 31, 9-16 (2003).
  34. Sissoëff, L., Mousli, M., England, P., Tuffereau, C. Stable trimerization of recombinant rabies virus glycoprotein ectodomain is required for interaction with the p75NTR receptor. Journal of General Virology. 86, 2543-2552 (2005).
  35. Morgeaux, S., et al. Replacement of in vivo human rabies vaccine potency testing by in vitro glycoprotein quantification using ELISA – Results of an international collaborative study. Vaccine. 35 (6), 966-971 (2017).
  36. Lafon, M., Meslin, F. X., Kaplan, M. N., Kopowski, H. Techniques for the production, screening and characterisation of monoclonal antibodies. Laboratory techniques in rabies, 4th Edition. , 133-144 (1996).
  37. Perrin, P., Meslin, F. X., Kaplan, M. N., Kopowski, H. Techniques for the preparation of rabies confugates. Laboratory techniques in rabies, 4th Edition. , 433-444 (1996).
  38. Barth, R., Diderrich, G., Weinmann, E. NIH test, a problematic method for testing potency of inactivated rabies vaccine. Vaccine. 6, 369-377 (1988).
  39. Jallet, C., et al. Chimeric lyssavirus glycoproteins with increased immunological potential. Journal of Virology. 73, 225-233 (1999).
  40. Dietzschold, B., et al. Characterization of an antigenic determinant of the glycoprotein that correlates with pathogenicity of rabies virus. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 80, 70-74 (1983).
  41. Seif, L., Coulon, P., Rollin, P., Flamand, A. Rabies virulence: effect on pathogenicity and sequence characterization of rabies virus mutations affecting antigenic site III of the glycoprotein. Journal of Virology. 53, 926-934 (1985).
  42. Lafon, M. Rabies virus receptors. Journal of Neurovirology. 11, 82-87 (2005).
  43. Benmansour, A., Leblois, H., Coulon, P., Tuffereau, C., Gaudin, Y., Flamand, Y., Lafay, A. Antigenicity of the rabies virus glycoprotein. Journal of Virology. 65, 4198-4203 (1991).
  44. . . Rabies Vaccine Workshop Summary. , (2011).
  45. De Mattia, F., et al. The Vaccines Consistency Approach Project: an EPAA initiative. Pharmeuropa Bio & Scientific Notes. 2015, 30-56 (2015).

Tags

ELISARabies VaccinePotencyIn VitroAnimal TestingNH TestImmunogenic GlycoproteinSensitivityIn VivoManufacturersNational Control LaboratoriesPersonal Protective EquipmentDecontaminationMonoclonal AntibodyPassivation BufferWashing BufferReference VaccineDilution
check_url/59641?article_type=t&slug=in-vitro-elisa-test-to-evaluate-rabies-vaccine-potency

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Jallet, C., Tordo, N. In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency. J. Vis. Exp. (159), e59641, doi:10.3791/59641 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image