JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Immunology and Infection

In Vitro ELISA Test for å evaluere Rabies vaksine styrke

Published: May 11, 2020
doi:
10.3791/59641
,
1Unit Antiviral Strategies, OIE Reference Laboratories for Rift Valley Fever Virus & Crimean Congo Hemorrhagic Fever Virus,Institut Pasteur, 2Institut Pasteur de Guinée, Conakry

Summary

Her beskriver vi en indirekte ELISA sandwich immunocapture for å bestemme immungen glykoprotein innholdet i rabies vaksiner. Denne testen bruker et nøytraliserende monoklonalt antistoff (mAb-D1) som gjenkjenner glykoproteintrimmere. Det er et alternativ til in vivo NIH-testen for å følge konsistensen av vaksinepotens under produksjonen.

Abstract

Den økende globale bekymringen for dyrevelferden oppmuntrer produsenter og National Control Laboratories (OMCLs) til å følge 3Rs-strategien for erstatning, reduksjon og raffinement av laboratoriedyrtestingen. Utviklingen av in vitro tilnærminger anbefales på WHO og europeiske nivåer som alternativer til NIH-testen for evaluering av rabies vaksine styrke. Ved overflaten av rabiesviruset (RABV) partikkel utgjør trimmere av glykoprotein det store immunogen for å indusere Viral Neutralizing Antibodies (VNAbs). En ELISA-test, hvor nøytraliserende monoklonale antistoffer (mAb-D1) gjenkjenner den trimeric formen av glykoproteinet, er utviklet for å bestemme innholdet i det innfødte trimericglykoproteinet sammen med produksjonen av vaksinebatchene. Denne in vitro potenstesten viste en god konkordans med NIH-testen og har blitt funnet egnet i samarbeidsstudier av RABV-vaksineprodusenter og OMCLer. Unngåelse av dyrebruk er et oppnåelig mål i nær fremtid.

Metoden som presenteres er basert på en indirekte ELISA sandwich immunocapture ved hjelp av mAb-D1 som gjenkjenner de antigene stedene III (aa 330 til 338) av trimeric RABV glykoprotein, det vil si det genene immun RABV antigen. mAb-D1 brukes til både belegg og påvisning av glykoproteintrimmer ei vaksinebatch. Siden epitopen gjenkjennes på grunn av konformasjonsegenskapene, kan det potensielt denaturert glykoprotein (mindre immunogent) ikke fanges opp og oppdages av mAb-D1. Vaksinen som skal testes inkuberes i en plate sensibilisert med mAb-D1. Bundet trimeric RABV glykoproteiner identifiseres ved å legge til mAb-D1 igjen, merket med peroksidase og deretter avslørt i nærvær av substrat og krom. Sammenligning av absorbansen målt for den testede vaksinen og referansevaksinen gjør det mulig å bestemme det immunogene glykoproteininnholdet.

Introduction

Siden mer enn 50 år brukes NIH-testen1 som en gullstandardmetode for å evaluere rabiesvaksinens styrke før batchutgivelsen. Denne testen består av en intraperitoneal immunisering av grupper av mus med vaksinen som skal testes etterfulgt av en intra-cerebral (IC) utfordring 14 dager senere med Challenge Virus Standard (CVS) stamme av rabies virus (RABV). Styrken evalueres fra andelen mus som overlever IC-utfordringen. Selv om WHO2 og European Pharmacopeia3 fortsatt krever NIH-testen for å vurdere vaksinens styrke, lider denne testen flere hindringer: resultatene er svært variable4; smittsomme RABV brukes under utfordringen, og dette krever både tekniske ferdigheter og strenge biosikkerhetstiltak; et stort antall dyr brukes, og alvorlighetsgraden av utfordringen reiser alvorlige etiske bekymringer5. En mindre alvorlig variant av denne testen er utviklet: to uker etter intra-peritoneal immunisering, mus er ikke utfordret av IC, men blødde og testet for tilstedeværelse av spesifikke RABV nøytraliserende antistoffer (VNAbs) i deres serum ved hjelp av en in vitro nøytralisering test. Denne testen krever imidlertid fortsatt å ofre et stort antall laboratoriemus, selv om den allerede er i bruk for veterinærvaksinene6,7 og har blitt vurdert for humane vaksiner8.

Per nå oppfordrer både International9 og European10 anbefalinger produsenter og nasjonale kontrolllaboratorier (Official Medicine Control Laboratories – OMCLs) til å implementere erstatning, reduksjon og raffinement av laboratoriedyrtesting, referert til 3Rs strategi. Eu-direktiv 2010/63/EU (gjelder siden 2013/01/01) knyttet til beskyttelse og velferd for dyr har også forsterket begrensningene for vaksineprodusenter og laboratorier som er involvert i kvalitetskontroll av rabiesvaksiner samt i rabiesforskning11. Som et resultat har utvikling, validering og bruk av alternative in vitro tilnærminger nå blitt en prioritet. Dette er ikke bare etisk forsvarlig, men kan også redusere batch testing kostnader og forkorte tiden for resultater til timer i stedet for uker3.

På overflaten av RABV partikkel, glykoprotein vedtar en trimeric form12,13,14,15,16. I rabiesvaksine utgjør denne innfødte trimeric formen den store immunogen indusere VNAbs17 mens monomeriske, oppløselige eller denaturertglykoproteiner er dårlig immungene18,19. Dermed er bevaring av trimmere av glykoproteinet langs vaksineproduksjonsprosessen en god indikator for bevaring av et optimalt immungenpotensial. Flere immunkjemiske metoder, som antistoffbindende test20,21, den enkle radiale immundiffusjonen (SRD) test22 og ELISA-testen23,24,25,26,27 anbefales av WHO Technical Report Series2 og den europeiske monografien3 for å kvantifisere antigeninnholdet i rabiesvaksiner. Disse brukes av produsenter til å overvåke konsistensen av vaksineproduksjon og av OMCL for å vurdere den konsekvente formuleringen av grupper av humane vaksiner28, selv om NIH-testen fortsatt vurderes for styrken.

Alle disse immunkjemiske metodene er imidlertid ikke like. SRD-testen krever en forbehandling som kan endre membranforankret trimmere og resultere i en løselig eller denaturert form av glykoproteinet 22,29. Derfor er SRD ikke mye effektiv i diskriminering mellom immunogene og ikke-immungene glykoproteiner som resulterer i en ufullkommen vurdering av immunogenisiteten til en vaksinetomt. Derimot er ELISA-testen mer følsom22, bevarer den opprinnelige strukturen til glykoproteinet, og er mer hensiktsmessig å bestemme innholdet i de innfødte foldede trimmene av glykoprotein. ELISA-testen kan bruke enten kaninpolyklonale eller musmonoklonale antiglykoproteinantistoffer renset eller konsentrert med ammoniumsulfat. Studier har vist god konkordans mellom NIH-testen og antigeninnholdet evaluert av ELISA i vaksiner og konkludertmed at ELISA-metoder er egnet for in vitro potenstesten. Dette talsmenn som ELISA tester kan minst supplere eller erstatte NIH test4,26,27,30,31,32,33. I dag anbefaler Den europeiske pharmacopoeia bruk av validerte serologiske eller immunokjemiske analyser som alternativer til NIH-testen3. Fullstendig unngåelse av dyrebruk for vaksinestyrke har blitt et realistisk perspektiv.

Metoden nedenfor er basert på en indirekte ELISA sandwich immunocapture ved hjelp av en mus monoklonal antistoff klone (mAb-D1) som gjenkjenner antigene områder III (aa 330 til 338) av trimeric RABV glykoprotein15,34. Denne metoden ble utviklet i utgangspunktet ved Institut Pasteur26,30 deretter optimalisert og validert av Agence Nationale de Sécurité du Médicament et des produits de santé (ANSM) laboratorium, det vil si den franske OMCL4,33. MAb-D1 brukes både til å sensibilisere platen og deretter for å oppdage det fangede antigenet. Dette gjør det mulig for spesifikk kvantifisering av glykoproteintrimmerne, det vil si det immunogene RABV-antigenet. MAb-D1 som brukes til deteksjon er merket med peroksidase, som avsløres i nærvær av substrat et og krom. Sammenligning av absorbansen målt for den testede vaksinen og referansevaksinen gjør det mulig å bestemme det immunogene glykoproteininnholdet. Det er verdt å merke seg at samme type analyse kan brukes for forskjellige mAbs gjenkjenne ulike antigene steder av RABV glykoprotein35. Metoden for å skaffe og rense eller konsentrere seg med ammoniumsulfat anti-glykoprotein polyklonale kaninimmunoglobuliner G (IgG) eller monoklonale museglobuliner har blitt grundig beskrevet tidligere36 sammen med metoden for å konjugere antistoffer med peroxidase37.

Protocol

1. Sikkerhetsforanstaltninger MERK: Denne metoden gjelder for både levende RABV og inaktivert vaksine. Bruk gode prosedyrer for laboratoriepraksis og sikkerhet. Bruk tilstrekkelig personlig beskyttelsesutstyr (PVU), inkludert engangsfrakk, hansker, maske, briller osv. Når det levende viruset er titrerat, bruk et klasse II biologisk sikkerhetsskap. Vurder materiale i kontakt med prøvene (reagenser, vaskeløsninger osv.) som smittsomt materiale. <l…

Representative Results

I følgende eksempel brukes referansevaksinen Lot 09, bestående av rensede inaktiverte rabiesviruspartikler (PV-vaksinestamme). Glykoproteintrimmerne (10 μg/ml) innholdet i dette er etablert etter bestemmelse av den totale mengden virusproteiner (BCA-test) og evaluering av prosentandelen av glykoproteinet ved SDS-polyakrylamidgelelektroforese. Alternativt kan en kalibrert referansevaksine, for eksempel WHO 6th International Standard (IS) for Rabies Vaccine (NIBSC-kode: 07/162…

Discussion

Epitopen anerkjent av mAb-D1 ligger i det antigene området III av RABV glykoprotein som ikke bare er immunodominerende for induksjon av VNAbs, men også involvert i nevrovirulens, patogene40,41 og reseptorgjenkjenning42. Det er et annet viktig antigent sted langs glykoprotein, sted II43, mot hvilke flere MAbs har blitt isolert som mAb-WI-111235. Disse kan også brukes i lignende type eksperi…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dr. Sylvie Morgeaux og Dr. Jean-Michel Chapsal må anerkjennes for deres viktigste deltakelse for å etablere ELISA-analysen om vaksinegrupper og for å organisere internasjonale workshops og samarbeidsstudier. Vi takker Sabrina Kali for kritisk lesning av manuskriptet. Dr. Pierre Perrin var ansvarlig for isolasjon og karakterisering av mAb-D1. Dette arbeidet har i hovedsak blitt støttet av Institut Pasteur-finansiering.

Materials

Class II Biological Safety Cabinet ThermoFisher Scientific 10445753 if titrating live virus
Clear Flat-Bottom Immuno Nonsterile 96-Well Plates, 400 µL, MAXISORP ThermoFisher Scientific 439454 good for binding to the loaded antibody
Equip Labo Polypropylene Laboratory Fume Hood ThermoFisher Scientific 12576606 for the preparation of sulfuric acid
Immunology Plate Strong
Adsorption MAXISORP Flat Bottom
Well F96		 Dutscher 55303 good for binding to the loaded antibody
Microplate Sealing Tape(100 sheets) ThermoFisher Scientific 15036
Microplate  single mode reader Sunrise TECAN
Microplate shaker-incubator Dutscher 441504
Microplate washer Wellwash ThermoFisher Scientific 5165000
Multichannel pipette (30-300 µL) 12 channels ThermoFisher Scientific 4661180N
Single Channel pipettes (Kit 2 : Finnpipettes F2 0.2-2 μL micro, 2-20 μL, 20-200 μL & 100-1000 μL) ThermoFisher Scientific 4700880
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Seligmann, E. B. The NIH test for potency. Laboratory Techniques in Rabies. , 279-286 (1973).
  2. Annex 2. Recommendations for inactivated rabies vaccine for human use produced in cell substrates and embryonated eggs. WHO Technical Report Series. 941, 83-132 (2007).
  3. . Rabies vaccine for human use prepared in cell cultures. European Pharmacopoeia. , (2008).
  4. Gibert, R., Alberti, M., Poirier, B., Jallet, C., Tordo, N., Morgeaux, S. A relevant in vitro ELISA test in alternative to the in vivo NIH test for human rabies vaccine batch release. Vaccine. 31, 6022-6029 (2013).
  5. Stokes, W., et al. Report on the international workshop on alternative methods for human and veterinary rabies vaccine testing: state of the science and planning the way forward. Biologicals. 40 (5), 369-381 (2012).
  6. Krämer, B., Bruckner, L., Daas, A., Milne, C. Collaborative study for validation of a serological potency assay for rabies vaccine (inactivated) for veterinary use. Pharmeuropa Bio & Scientific Notes. 2, 37-55 (2010).
  7. Krämer, B., Kamphuis, E., Hanschmann, K. M., Milne, C., Daas, A., Duchow, K. A multi-dose serological assay suitable to quantify the potency of inactivated rabies vaccines for veterinary use. Biologicals. 41, 400-406 (2013).
  8. Fitzgerald, E. A., Gallagher, M., Hunter, W. S., Seligmann, E. B. Use of the antibody assay in immunized mice for the determination of rabies vaccine potency. Developments in Biological Standardization. 40, 183-186 (1978).
  9. Milstien, J., Grachev, V., Padilla, A., Griffiths, E., Brown, F., Cussler, K., Hendriksen, C. WHO activities towards the three Rs in the development and control of biological products. Replacement, reduction and refinement of animal experiments in the development and control of biological products. , 31-39 (1996).
  10. Behr-Gross, M. E., Spieser, J. M. Contributions of the European OMCL Network and Biological Standardisation Programme to animal Welfare. ALTEX-Alternatives to Animal Experimentation. 23, 21-28 (2006).
  11. . Directive 2010/63/EU of the European Parliament and the Council of 22 September 2010 on the protection of animals used for scientific purposes. Official Journal of European Union. L276, 33-79 (2010).
  12. Whitt, M. A., Buonocore, L., Prehaud, C., Rose, J. K. Membrane fusion activity, oligomerization and assembly of the rabies virus glycoprotein. Virology. 185 (2), 681-688 (1991).
  13. Gaudin, Y., Ruigrok, R. W., Tuffereau, C., Knossow, M., Flamand, A. Rabies virus glycoprotein is a trimer. Virology. 187, 627-632 (1992).
  14. Roche, S., Gaudin, Y. Characterization of the equilibrium between the native and fusion-inactive conformation of rabies virus glycoprotein indicates that the fusion complex is made of several trimers. Virology. 297 (1), 128-135 (2002).
  15. Desmézières, E., Maillard, A. P., Gaudin, Y., Tordo, N., Perrin, P. Differential stability and fusion activity of Lyssavirus glycoprotein trimers. Virus Research. 91 (2), 181-187 (2003).
  16. Koraka, P., et al. A recombinant rabies vaccine expressing the trimeric form of the glycoprotein confers enhanced immunogenicity and protection in outbred mice. Vaccine. 32 (36), 4644-4650 (2014).
  17. Wiktor, T., Gyorgy, E., Schlumberger, D., Sokol, F., Koprowski, H. Antigenic properties of rabies virus components. Journal of Immunology. 110, 269-276 (1973).
  18. Gamoh, K., Senda, M., Itoh, O., Muramatsu, M., Hirayama, N., Koike, R., et al. Use of ELISA for in vitro potency test of rabies vaccines for animal use. Biologicals. 24, 95-101 (1996).
  19. Dietzschold, B., Wiktor, T., Wunner, W., Varrichio, A. Chemical and immunological analysis of the rabies soluble glycoprotein. Virology. 124, 330-337 (1983).
  20. Fitzgerald, E., Green, O., Seligmann, E. Rabies vaccine potency testing: a comparison between the antibody-binding test and the NIH test. Symposia Series in Immunobiological Standard. 21, 300-307 (1974).
  21. Barth, R., Groβ-Albenhausen, E., Jaeger, O., Milcke, L. The antibody-binding test, a useful method for quantitative determination of inactivated rabies virus antigen. Journal of Biological Standardization. 9, 81-89 (1981).
  22. Ferguson, M., Schild, G. A single-radial-immunodiffusion technique for the assay of rabies glycoprotein antigen: application for the potency tests of vaccines against rabies. Journal of General Virology. 59, 197-201 (1982).
  23. Atanasiu, P., Perrin, P., Delagneau, J. F. Use of an enzyme immunoassay with protein A for rabies antigen and antibody determination. Developments in Biological Standardization. 46, 207-215 (1980).
  24. van der Marel, P., van Wezel, A. Quantitative determination of rabies antigen by ELISA. Developments in Biological Standardization. 50, 267-275 (1981).
  25. Adamovicz, P., Aguillon, F., David, A., Le Fur, R., Mazert, M. C., Perrin, P., et al. The use of various immunochemical, biochemical and biological methods for the analysis of rabies virus production in tissue cultures. Developments in Biological Standardization. 55, 191-197 (1984).
  26. Lafon, M., Perrin, P., Versmisse, P., Sureau, P. Use of monoclonal antibody for quantification of rabies vaccine glycoprotein by enzyme immunoassay. Journal of Biological Standardization. 13, 295-301 (1985).
  27. Thraenhart, O., Ramakrishnan, K. Standardization of an enzyme immunoassay for the in vitro potency assay of inactivated tissue culture rabies vaccines: determination of the rabies virus glycoprotein with polyclonal antisera. Journal of Biological Standardization. 17, 291-309 (1989).
  28. Council of Europe. . Official Authority Batch release of Rabies vaccines Guideline. , (2019).
  29. Ferguson, M., Seagroatt, V., Schild, G. A collaborative study on the use of single radial immunodiffusion for the assay of rabies virus glycoprotein. Developments in Biological Standards. 12, 283-294 (1984).
  30. Perrin, P., Morgeaux, S., Sureau, P. In vitro rabies vaccine potency appraisal by ELISA: advantages of the immunocapture method with a neutralizing anti-glycoprotein monoclonal antibody. Biologicals. 18, 321-330 (1990).
  31. Rooijakkers, E. J., Uittenbogaard, J. P., Groen, J., Osterhaus, A. D. Rabies vaccine potency control: comparison of ELISA systems for antigenicity testing. Journal of Virological Methods. 58, 111-119 (1996).
  32. Rooijakkers, E. J., Uittenbogaard, J. P., Groen, J., van Herwijnen, J., Osterhaus, A. D., Brown, F., Cussler, K., Hendriksen, C. . Development and evaluation of alternative testing methods for the in vivo NIH potency test used for the quality control of inactivated rabies vaccines. , 137-145 (1996).
  33. Fournier-Caruana, J., et al. Inactivated rabies vaccine control and release: use of an ELISA method. Biologicals. 31, 9-16 (2003).
  34. Sissoëff, L., Mousli, M., England, P., Tuffereau, C. Stable trimerization of recombinant rabies virus glycoprotein ectodomain is required for interaction with the p75NTR receptor. Journal of General Virology. 86, 2543-2552 (2005).
  35. Morgeaux, S., et al. Replacement of in vivo human rabies vaccine potency testing by in vitro glycoprotein quantification using ELISA – Results of an international collaborative study. Vaccine. 35 (6), 966-971 (2017).
  36. Lafon, M., Meslin, F. X., Kaplan, M. N., Kopowski, H. Techniques for the production, screening and characterisation of monoclonal antibodies. Laboratory techniques in rabies, 4th Edition. , 133-144 (1996).
  37. Perrin, P., Meslin, F. X., Kaplan, M. N., Kopowski, H. Techniques for the preparation of rabies confugates. Laboratory techniques in rabies, 4th Edition. , 433-444 (1996).
  38. Barth, R., Diderrich, G., Weinmann, E. NIH test, a problematic method for testing potency of inactivated rabies vaccine. Vaccine. 6, 369-377 (1988).
  39. Jallet, C., et al. Chimeric lyssavirus glycoproteins with increased immunological potential. Journal of Virology. 73, 225-233 (1999).
  40. Dietzschold, B., et al. Characterization of an antigenic determinant of the glycoprotein that correlates with pathogenicity of rabies virus. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 80, 70-74 (1983).
  41. Seif, L., Coulon, P., Rollin, P., Flamand, A. Rabies virulence: effect on pathogenicity and sequence characterization of rabies virus mutations affecting antigenic site III of the glycoprotein. Journal of Virology. 53, 926-934 (1985).
  42. Lafon, M. Rabies virus receptors. Journal of Neurovirology. 11, 82-87 (2005).
  43. Benmansour, A., Leblois, H., Coulon, P., Tuffereau, C., Gaudin, Y., Flamand, Y., Lafay, A. Antigenicity of the rabies virus glycoprotein. Journal of Virology. 65, 4198-4203 (1991).
  44. . . Rabies Vaccine Workshop Summary. , (2011).
  45. De Mattia, F., et al. The Vaccines Consistency Approach Project: an EPAA initiative. Pharmeuropa Bio & Scientific Notes. 2015, 30-56 (2015).

Tags

ELISARabies VaccinePotencyIn VitroAnimal TestingNH TestImmunogenic GlycoproteinSensitivityIn VivoManufacturersNational Control LaboratoriesPersonal Protective EquipmentDecontaminationMonoclonal AntibodyPassivation BufferWashing BufferReference VaccineDilution
check_url/59641?article_type=t&slug=in-vitro-elisa-test-to-evaluate-rabies-vaccine-potency

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Jallet, C., Tordo, N. In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency. J. Vis. Exp. (159), e59641, doi:10.3791/59641 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image