In Vitro ELISA Test för att utvärdera rabiesvaccin potens
Summary
Här beskriver vi en indirekt ELISA sandwich immunocapture att bestämma immunogenic glykoprotein innehållet i rabies vacciner. Detta test använder en neutraliserande monoklonal antikropp (mAb-D1) som känner igen glykoproteintrimmers. Det är ett alternativ till in vivo NIH-testet att följa konsistensen av vaccinpotens under produktionen.
Abstract
Den växande globala oron för djurens välbefinnande uppmuntrar tillverkare och nationella kontrolllaboratorier att följa 3R-strategin för ersättning, minskning och förfining av laboratoriedjursförsök. Utveckling av in vitro-metoder rekommenderas på WHO-nivå och europeisk nivå som alternativ till NIH-testet för utvärdering av rabiesvaccinpotensen. På ytan av rabiesvirus (RABV) partikel, trimers av glykoprotein utgör de viktigaste immunogen att inducera viral neutraliserande antikroppar (VNAbs). Ett ELISA-test, där neutraliserande monoklonala antikroppar (mAb-D1) känner igen den trimeriska formen av glykoproteinet, har utvecklats för att bestämma innehållet i det inbyggda vikta trimeric glykoproteinet tillsammans med produktionen av vaccinsatserna. Detta in vitro-potenstest visade en god överensstämmelse med NIH-testet och har befunnits lämpligt i samarbetsstudier av RABV vaccintillverkare och OMCLs. Undvikande av djuranvändning är ett uppnåeligt mål inom en snar framtid.
Den metod som presenteras är baserad på en indirekt ELISA sandwich immunocapture med hjälp av mAb-D1 som erkänner antigena platser III (aa 330 till 338) av trimeric RABV glykoprotein, dvs immunogenic RABV antigen. mAb-D1 används för både beläggning och detektion av glykoproteintrimmer som finns i vaccinpartiet. Eftersom epitopet är erkänt på grund av dess konformationsegenskaper, kan det potentiellt denaturerade glykoproteinet (mindre immunogent) inte fångas upp och detekteras av mAb-D1. Vaccinet som ska testas inkuberas i en plattsensibiliserad med mAb-D1. Bundna trimeric RABV glykoproteiner identifieras genom att lägga till mAb-D1 igen, märkt med peroxidas och sedan avslöjas i närvaro av substrat och chromogen. En jämförelse av den absorbans som uppmätts för det testade vaccinet och referensvaccinet gör det möjligt att fastställa den immunogena glykoproteinhalten.
Introduction
Sedan mer än 50 år används NIH-testet1 som en guldstandardmetod för att utvärdera rabiesvaccinpotensen innan partiet släpps ut. Detta test består av en intraperitoneal immunisering av grupper av möss med det vaccin som ska testas följt av en intra-cerebral (IC) utmaning 14 dagar senare med Challenge Virus Standard (CVS) stam av rabiesvirus (RABV). Styrkan utvärderas från andelen möss som överlever IC-utmaningen. Även om WHO2 och European Pharmacopeia3 fortfarande kräver NIH-testet för att bedöma vaccinets styrka, lider detta test av flera hinder: resultaten är mycket varierande4; Infektiös RABV används under utmaningen och detta kräver både teknisk skicklighet och stränga åtgärder för biosäkerhet. ett stort antal djur används, och utmaningens allvar ger upphov till allvarliga etiska betänkligheter5. En mindre allvarlig variation av detta test har utvecklats: två veckor efter den intra peritoneala immuniseringen utmanas möss inte av IC utan avblodas och testas för förekomst av specifika RABV-neutraliserande antikroppar (VNAbs) i serumet med hjälp av ett in vitro-neutraliseringstest. Detta test kräver dock fortfarande att man offrar ett stort antal laboratoriemöss även om det redan används för veterinärmedicinskavaccinerna 6,,7 och har övervägts för humanvaccin8.
Från och med nu, både International9 och Europeiska10 rekommendationer uppmuntra tillverkare och nationella kontrolllaboratorier (officiella laboratorier för medicin kontroll – OMCLs) att genomföra ersättning, minskning och förfining av laboratoriedjur testning, kallad 3Rs strategi. Eu-direktiv 2010/63/EU (som varit i kraft sedan 2013/01/01) om djurskydd och djurskydd har också förstärkt de begränsningar för vaccintillverkare och laboratorier som deltar i kvalitetskontrollen av rabiesvacciner samt rabiesforskning11. Som ett resultat av detta har utvecklingen, valideringen och användningen av alternativa in vitro-metoder nu blivit en prioritet. Dessa är inte bara etiskt sunda men kan också minska partiets testkostnader och förkorta tiden för resultat till timmar istället för vecka3.
På ytan av RABV partikel, glykoprotein antar en trimeric form12,13,14,15,16. I rabies vaccin, denna inhemska trimeric form utgör de viktigaste immunogen inducera VNAbs17 medan monomeric, lösliga eller denaturerade glykoproteiner är dåligt immunogenic18,19. Således är bevarandet av trimers av glykoproteinet längs vaccinproduktionsprocessen en bra indikator för bevarandet av en optimal immunogen potential. Flera immunokemiska metoder, såsom antikroppsbindningstestet20,21, test22 av en radiell immundiffusion (SRD) och ELISA-testet23,,24,,25,26,27 rekommenderas av WHO:s tekniska rapport serie2 och den europeiska monografin3 för att kvantifiera antigenhalten i rabiesvacciner. Dessa används av tillverkarna för att övervaka konsekvensen i vaccinproduktionen och av OMCL för att bedöma den konsekventa formuleringen av partier avhumanvacciner 28, även om NIH-testet fortfarande övervägs för styrkan.
Emellertid, alla dessa immunokemiska metoder är inte likvärdiga. SRD-testet kräver en förbehandling som kan förändra de membranförankrade trimers och resultera i en löslig eller denaturerad form av glykoproteinet22,29. Därför är SRD inte mycket effektivt när det gäller att diskriminera mellan immunogena och icke-immunogena glykoproteiner som resulterar i en ofullständig bedömning av immunogeniciteten hos ett vaccinparti. Däremot är ELISA-testet känsligare22, bevarar glykoproteinets ursprungliga struktur och är lämpligare för att bestämma innehållet i de inbyggda vikta trimersna av glykoprotein. ELISA-testet kan använda antingen kaninpolyklonala eller mus monoklonala anti-glykoproteinantikroppar som renats eller koncentrerats med ammoniumsulfat. Studier har visat god överensstämmelse mellan NIH-testet och det antigeninnehåll som utvärderats av ELISA i vacciner och kommit fram till att ELISA-metoderna är lämpliga för in vitro-potenstestet. Detta förespråkar att ELISA-tester åtminstone kan komplettera eller till och med ersätta NIH-testet4,,26,,27,,30,,31,,32,33. I dag rekommenderar Europeiska farmakopén användning av validerade serologiska eller immunokemiska analyser som alternativ till NIH-testet3. Det fullständiga undvikandet av djuranvändning för vaccinpotens har blivit ett realistiskt perspektiv.
Den metod som presenteras nedan är baserad på en indirekt ELISA sandwich immunocapture med hjälp av en mus monoklonal antikropp klon (mAb-D1) som känner igen antigena platser III (aa 330 till 338) av trimeric RABV glykoprotein15,34. Denna metod utvecklades ursprungligen vid Institut Pasteur26,30 sedan optimeras och valideras av Agence Nationale de Sécurité du Médicament et des produits de santé (ANSM) laboratorium, dvs den franska OMCL4,33. MAb-D1 används både för att sensibilisera plattan och därefter för att upptäcka det fångade antigenet. Detta möjliggör specifik kvantifiering av glykoproteintrimmarna, dvs det immunogena RABV-antigenet. Den mAb-D1 som används för detektion är märkt med peroxidas, vilket avslöjas i närvaro av substratet och chromogen. En jämförelse av den absorbans som uppmätts för det testade vaccinet och referensvaccinet gör det möjligt att fastställa den immunogena glykoproteinhalten. Det är att notera att samma typ av analys kan tillämpas för olika mAbs erkänner olika antigena platser av RABV glykoprotein35. Metoden för att erhålla och rena eller koncentrera med ammoniumsulfat anti-glykoprotein polyklonanal kanin immunglobuliner G (IgG) eller monoklonala musglobuliner har beskrivits utförligt tidigare36 tillsammans med metoden att konjugate antikroppar med peroxidas37.
Protocol
Representative Results
Discussion
Epitopet som erkänns av mAb-D1 ligger i det antigena området III av RABV glykoprotein som inte bara är immun-dominerande för induktion av VNAbs men också deltar i neurovirulens, patogenicitet40,41 och receptorerkännande42. Det finns en annan viktig antigen plats längs glykoprotein, plats II43, mot vilken flera MAbs har isolerats såsom mAb-WI-111235. Dessa kan också användas i liknan…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr Sylvie Morgeaux och Dr Jean-Michel Chapsal måste erkännas för deras viktigaste deltagande för att upprätta ELISA analys på vaccin partier och att organisera internationella workshops och samarbetsstudier. Vi tackar Sabrina Kali för kritisk läsning av manuskriptet. Dr Pierre Perrin var ansvarig för isolering och karakterisering av mAb-D1. Detta arbete har huvudsakligen fått stöd av Institut Pasteur-finansieringen.
Materials
| Class II Biological Safety Cabinet | ThermoFisher Scientific | 10445753 | if titrating live virus |
| Clear Flat-Bottom Immuno Nonsterile 96-Well Plates, 400 µL, MAXISORP | ThermoFisher Scientific | 439454 | good for binding to the loaded antibody |
| Equip Labo Polypropylene Laboratory Fume Hood | ThermoFisher Scientific | 12576606 | for the preparation of sulfuric acid |
| Immunology Plate Strong Adsorption MAXISORP Flat Bottom Well F96 |
Dutscher | 55303 | good for binding to the loaded antibody |
| Microplate Sealing Tape(100 sheets) | ThermoFisher Scientific | 15036 | |
| Microplate single mode reader Sunrise | TECAN | ||
| Microplate shaker-incubator | Dutscher | 441504 | |
| Microplate washer Wellwash | ThermoFisher Scientific | 5165000 | |
| Multichannel pipette (30-300 µL) 12 channels | ThermoFisher Scientific | 4661180N | |
| Single Channel pipettes (Kit 2 : Finnpipettes F2 0.2-2 μL micro, 2-20 μL, 20-200 μL & 100-1000 μL) | ThermoFisher Scientific | 4700880 |
References
- Seligmann, E. B. The NIH test for potency. Laboratory Techniques in Rabies. , 279-286 (1973).
- Annex 2. Recommendations for inactivated rabies vaccine for human use produced in cell substrates and embryonated eggs. WHO Technical Report Series. 941, 83-132 (2007).
- . Rabies vaccine for human use prepared in cell cultures. European Pharmacopoeia. , (2008).
- Gibert, R., Alberti, M., Poirier, B., Jallet, C., Tordo, N., Morgeaux, S. A relevant in vitro ELISA test in alternative to the in vivo NIH test for human rabies vaccine batch release. Vaccine. 31, 6022-6029 (2013).
- Stokes, W., et al. Report on the international workshop on alternative methods for human and veterinary rabies vaccine testing: state of the science and planning the way forward. Biologicals. 40 (5), 369-381 (2012).
- Krämer, B., Bruckner, L., Daas, A., Milne, C. Collaborative study for validation of a serological potency assay for rabies vaccine (inactivated) for veterinary use. Pharmeuropa Bio & Scientific Notes. 2, 37-55 (2010).
- Krämer, B., Kamphuis, E., Hanschmann, K. M., Milne, C., Daas, A., Duchow, K. A multi-dose serological assay suitable to quantify the potency of inactivated rabies vaccines for veterinary use. Biologicals. 41, 400-406 (2013).
- Fitzgerald, E. A., Gallagher, M., Hunter, W. S., Seligmann, E. B. Use of the antibody assay in immunized mice for the determination of rabies vaccine potency. Developments in Biological Standardization. 40, 183-186 (1978).
- Milstien, J., Grachev, V., Padilla, A., Griffiths, E., Brown, F., Cussler, K., Hendriksen, C. WHO activities towards the three Rs in the development and control of biological products. Replacement, reduction and refinement of animal experiments in the development and control of biological products. , 31-39 (1996).
- Behr-Gross, M. E., Spieser, J. M. Contributions of the European OMCL Network and Biological Standardisation Programme to animal Welfare. ALTEX-Alternatives to Animal Experimentation. 23, 21-28 (2006).
- . Directive 2010/63/EU of the European Parliament and the Council of 22 September 2010 on the protection of animals used for scientific purposes. Official Journal of European Union. L276, 33-79 (2010).
- Whitt, M. A., Buonocore, L., Prehaud, C., Rose, J. K. Membrane fusion activity, oligomerization and assembly of the rabies virus glycoprotein. Virology. 185 (2), 681-688 (1991).
- Gaudin, Y., Ruigrok, R. W., Tuffereau, C., Knossow, M., Flamand, A. Rabies virus glycoprotein is a trimer. Virology. 187, 627-632 (1992).
- Roche, S., Gaudin, Y. Characterization of the equilibrium between the native and fusion-inactive conformation of rabies virus glycoprotein indicates that the fusion complex is made of several trimers. Virology. 297 (1), 128-135 (2002).
- Desmézières, E., Maillard, A. P., Gaudin, Y., Tordo, N., Perrin, P. Differential stability and fusion activity of Lyssavirus glycoprotein trimers. Virus Research. 91 (2), 181-187 (2003).
- Koraka, P., et al. A recombinant rabies vaccine expressing the trimeric form of the glycoprotein confers enhanced immunogenicity and protection in outbred mice. Vaccine. 32 (36), 4644-4650 (2014).
- Wiktor, T., Gyorgy, E., Schlumberger, D., Sokol, F., Koprowski, H. Antigenic properties of rabies virus components. Journal of Immunology. 110, 269-276 (1973).
- Gamoh, K., Senda, M., Itoh, O., Muramatsu, M., Hirayama, N., Koike, R., et al. Use of ELISA for in vitro potency test of rabies vaccines for animal use. Biologicals. 24, 95-101 (1996).
- Dietzschold, B., Wiktor, T., Wunner, W., Varrichio, A. Chemical and immunological analysis of the rabies soluble glycoprotein. Virology. 124, 330-337 (1983).
- Fitzgerald, E., Green, O., Seligmann, E. Rabies vaccine potency testing: a comparison between the antibody-binding test and the NIH test. Symposia Series in Immunobiological Standard. 21, 300-307 (1974).
- Barth, R., Groβ-Albenhausen, E., Jaeger, O., Milcke, L. The antibody-binding test, a useful method for quantitative determination of inactivated rabies virus antigen. Journal of Biological Standardization. 9, 81-89 (1981).
- Ferguson, M., Schild, G. A single-radial-immunodiffusion technique for the assay of rabies glycoprotein antigen: application for the potency tests of vaccines against rabies. Journal of General Virology. 59, 197-201 (1982).
- Atanasiu, P., Perrin, P., Delagneau, J. F. Use of an enzyme immunoassay with protein A for rabies antigen and antibody determination. Developments in Biological Standardization. 46, 207-215 (1980).
- van der Marel, P., van Wezel, A. Quantitative determination of rabies antigen by ELISA. Developments in Biological Standardization. 50, 267-275 (1981).
- Adamovicz, P., Aguillon, F., David, A., Le Fur, R., Mazert, M. C., Perrin, P., et al. The use of various immunochemical, biochemical and biological methods for the analysis of rabies virus production in tissue cultures. Developments in Biological Standardization. 55, 191-197 (1984).
- Lafon, M., Perrin, P., Versmisse, P., Sureau, P. Use of monoclonal antibody for quantification of rabies vaccine glycoprotein by enzyme immunoassay. Journal of Biological Standardization. 13, 295-301 (1985).
- Thraenhart, O., Ramakrishnan, K. Standardization of an enzyme immunoassay for the in vitro potency assay of inactivated tissue culture rabies vaccines: determination of the rabies virus glycoprotein with polyclonal antisera. Journal of Biological Standardization. 17, 291-309 (1989).
- Council of Europe. . Official Authority Batch release of Rabies vaccines Guideline. , (2019).
- Ferguson, M., Seagroatt, V., Schild, G. A collaborative study on the use of single radial immunodiffusion for the assay of rabies virus glycoprotein. Developments in Biological Standards. 12, 283-294 (1984).
- Perrin, P., Morgeaux, S., Sureau, P. In vitro rabies vaccine potency appraisal by ELISA: advantages of the immunocapture method with a neutralizing anti-glycoprotein monoclonal antibody. Biologicals. 18, 321-330 (1990).
- Rooijakkers, E. J., Uittenbogaard, J. P., Groen, J., Osterhaus, A. D. Rabies vaccine potency control: comparison of ELISA systems for antigenicity testing. Journal of Virological Methods. 58, 111-119 (1996).
- Rooijakkers, E. J., Uittenbogaard, J. P., Groen, J., van Herwijnen, J., Osterhaus, A. D., Brown, F., Cussler, K., Hendriksen, C. . Development and evaluation of alternative testing methods for the in vivo NIH potency test used for the quality control of inactivated rabies vaccines. , 137-145 (1996).
- Fournier-Caruana, J., et al. Inactivated rabies vaccine control and release: use of an ELISA method. Biologicals. 31, 9-16 (2003).
- Sissoëff, L., Mousli, M., England, P., Tuffereau, C. Stable trimerization of recombinant rabies virus glycoprotein ectodomain is required for interaction with the p75NTR receptor. Journal of General Virology. 86, 2543-2552 (2005).
- Morgeaux, S., et al. Replacement of in vivo human rabies vaccine potency testing by in vitro glycoprotein quantification using ELISA – Results of an international collaborative study. Vaccine. 35 (6), 966-971 (2017).
- Lafon, M., Meslin, F. X., Kaplan, M. N., Kopowski, H. Techniques for the production, screening and characterisation of monoclonal antibodies. Laboratory techniques in rabies, 4th Edition. , 133-144 (1996).
- Perrin, P., Meslin, F. X., Kaplan, M. N., Kopowski, H. Techniques for the preparation of rabies confugates. Laboratory techniques in rabies, 4th Edition. , 433-444 (1996).
- Barth, R., Diderrich, G., Weinmann, E. NIH test, a problematic method for testing potency of inactivated rabies vaccine. Vaccine. 6, 369-377 (1988).
- Jallet, C., et al. Chimeric lyssavirus glycoproteins with increased immunological potential. Journal of Virology. 73, 225-233 (1999).
- Dietzschold, B., et al. Characterization of an antigenic determinant of the glycoprotein that correlates with pathogenicity of rabies virus. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 80, 70-74 (1983).
- Seif, L., Coulon, P., Rollin, P., Flamand, A. Rabies virulence: effect on pathogenicity and sequence characterization of rabies virus mutations affecting antigenic site III of the glycoprotein. Journal of Virology. 53, 926-934 (1985).
- Lafon, M. Rabies virus receptors. Journal of Neurovirology. 11, 82-87 (2005).
- Benmansour, A., Leblois, H., Coulon, P., Tuffereau, C., Gaudin, Y., Flamand, Y., Lafay, A. Antigenicity of the rabies virus glycoprotein. Journal of Virology. 65, 4198-4203 (1991).
- . . Rabies Vaccine Workshop Summary. , (2011).
- De Mattia, F., et al. The Vaccines Consistency Approach Project: an EPAA initiative. Pharmeuropa Bio & Scientific Notes. 2015, 30-56 (2015).
