Trapianto di subcapsulare renale di 2'-Deoxyguanosine-Treated Murine Embryonic Thymus in Topi Nudi
Summary
Forniamo un metodo semplice ed efficiente per trapiantare 2′-deossiguanosina trattata E18.5 tiromusnella capsula renale di un topo nudo. Questo metodo dovrebbe aiutare nello studio sia della funzione epiteliale timica che della maturazione delle cellule T.
Abstract
Il timo è un importante organo immunitario centrale, che svolge un ruolo essenziale nello sviluppo e nella differenziazione delle cellule T. Il trapianto di timo è un metodo importante per studiare la funzione delle cellule epiteliali timiche e la maturazione delle cellule T in vivo. Qui descriveremo i metodi sperimentali utilizzati all’interno del nostro laboratorio per trapiantare 2′-deossiguanosina (per esaurire i linfociti del donatore) trattati tiromo embrionale nella capsula renale di un topo nudo alatico. Questo metodo è semplice ed efficiente e non richiede abilità o dispositivi speciali. I risultati ottenuti con questo semplice metodo hanno mostrato che il timo trapiantato può sostenere efficacemente la produzione di cellule T del ricevente. Inoltre, diversi punti chiave per quanto riguarda il protocollo saranno ulteriormente chiariti.
Introduction
Il timo è l’organo immunitario centrale, all’interno dei timociti sottoposti a selezione positiva e negativa, e diventano cellule T mature1,2. La selezione positiva o negativa anomala provoca immunodeficienza o patologie autoimmuni rispettivamente3,4. Pertanto, il trapianto di organo timo è un approccio importante per studiare il processo di selezione delle cellule T nel timo del donatore. Questo metodo è particolarmente importante quando si analizza la funzione epiteliale timica mediata da mutazioni genetiche che causano fenotipo letale embrionale quando mutato5.
Per studiare la maturazione delle cellule T di un ricevente nel timo trapiantato, è necessario ridurre i linfociti del donatore all’interno del timo. A questo scopo, il timo embrionale di 14, 15 o 16 giorni (E14, E15, E16) viene solitamente selezionato6,7. Il timo da stadi più maturi può anche essere esaurito con successo dei linfociti del donatore trattando con 2′-deossiaguanosina. Tuttavia, un protocollo dettagliato per esaurire i linfociti e l’uso della vecchia coltura del timo non è stato descritto in precedenza8,9. Mentre i protocolli di trapianto sono stati introdotti da diversi studi10,11, ulteriore modifica e miglioramento di questi protocolli è necessario.
Il nostro protocollo è diviso in due parti: (i) Depletion of T lymphocites from late developmental stage E18.5 thymus by culture in 2′-deoxyguanosine-containing media. ii) Trapianto del timo colto in destinatari. In questa procedura, abbiamo sviluppato un modo semplice per fornire il grande tessuto (E18.5 timo) nella capsula renale con ridotta probabilità di lesioni renali. Mentre ci si concentra sul timo dello stadio successivo, il nostro protocollo può anche essere utilizzato direttamente o con modifiche per il trapianto di timo in varie fasi di sviluppo o altri tessuti di dimensioni simili.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il trapianto di subcapsulare renale del timo embrionale è un metodo importante per studiare la funzione delle cellule epiteliali timiche e il processo di maturazione delle cellule T in vivo. Anche se ci sono diversi studi sperimentali sulla coltura embrionale dell’organo timo e il trapianto6,7, il nostro protocollo fornisce una semplice procedura alternativa sulla coltura del timo embrionale murino e subcapsulare renale trapianto per timo più vecchio.
<p cl…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dal pacchetto iniziale della Jinan University a S.J. e dal programma di scienza e tecnologia di Guangzhou Cina (Grant No. 201704020209 a S.J.). Ringraziamo Amy Botta (Dipartimento di Biologia, Università di York, Toronto, ON M3J 1P3, Canada) per la revisione e la modifica del manoscritto.
Materials
| 0.5% Povidone iodine | Shanghai Likang Distinfectant Hi-Tech Co.Ltd | 20171113 | |
| 0.9% Sodium Chloride Injection | Shandong Qilu Pharmaceuyical Co.Ltd | 2C17112101 | |
| 1 mL Sterile syringe | Solarbio | YA1090 | |
| 2’-Deoxyguanosine | MEC | HY-17563 | 1M in DMSO, 1:800 using (final 1.25mM) |
| 24 Well Plate | Corning Incorporated | Costar 3524 | |
| 4-0 Surgical suture needles with thread | NingBo Cheng-He Microsurgical Instruments Factory China | YY0166-2002 | |
| 60mm Cell Culture Dish | Corning Incorporated | 430166 | |
| 70% ETOH | LIRCON | 20181221 | |
| APC anti-mouse CD8a antibodies | Biolegend | 100711 | 1:100 |
| Bent-tip fine forceps, JZ 10 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | JD1060 | To sterilize before use |
| Cefmetazole Sodium for Injection | Sichuan Hexin Pharmaceutical co,Ltd | 17062111 079 | 6mg in 0.5ml 0.9% NaCl solution, 7.5ul/g body weight |
| Dissecting scissors, JZ 10 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | JC2303 | To sterilize before use |
| Fetal bovine serum (FBS） | GIBCO | 10270-106 | |
| Fine forceps, JZ 10 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | JD1050 | To sterilize before use |
| Flow cytometry | BD | FACSCanto II | |
| Flunixin meglumine | MACLIN | F810147 | 1mg in 1ml 0.9% NaCl solution,2ul/g body weight |
| Forceps, Dumont#5 | World Precision Instruments | 14098 | To sterilize before use |
| Infrared lamp | OTLAN | MT-810 | |
| Needle holder, JZ 14 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | J32010 | To sterilize before use |
| PE anti-mouse CD4 | Biolegend | 100511 | 1:100 |
| Penicillin-Streptomycin mixture | GIBCO | 15140122 | 1:100 |
| Pentobarbital sodium salt | Sigma | P3761 | 1.5% solution in PBS, 75ug/g body weight |
| RPMI1640 Medium | GIBCO | C14-11875-093 | |
| Scalp vein needle | Shanghai Kindly Medical Instruments Co., Ltd | XC001 | |
| Spring scissors | VANNAS | S11014-12 | To sterilize before use |
| stereomicroscope | OLYMPUS | SZ61 | |
| Sterile 15cm cotton swab | Guangzhou Haozheng | 20150014 | |
| Sterile gauze 5 cm x 7 cm-8P | Guangzhou Haozheng | 20172640868 | |
| Sterile PBS (1x) | GENOM | GNM20012 | |
| Tissue forceps, JZ 12.5 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | J41010 | To sterilize before use |
References
- Klein, L., Kyewski, B., Allen, P. M., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of the T cell repertoire: what thymocytes see (and don’t see). Nature Reviews Immunology. 14, 377-391 (2014).
- Hogquist, K. A., Baldwin, T. A., Jameson, S. C. Central tolerance: learning self-control in the thymus. Nature Reviews Immunology. 5, 772-782 (2005).
- Spits, H., Touraine, J. L., Yssel, H., de Vries, J. E., Roncarolo, M. G. Presence of host-reactive and MHC-restricted T cells in a transplanted severe combined immunodeficient (SCID) patient suggest positive selection and absence of clonal deletion. Immunological Reviews. 116, 101-116 (1990).
- Nagamine, K., et al. Positional cloning of the APECED gene. Nature Genetics. 17, 393-398 (1997).
- Yanagihara, T., et al. Intronic regulation of Aire expression by Jmjd6 for self-tolerance induction in the thymus. Nature Communications. 6 (8820), (2015).
- Jenkinson, W., Jenkinson, E., Anderson, G. Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures. Journal of Visualized Experiments. (18), (2008).
- Bosselut, R., Vacchio, M. S. . T-Cell Development: Methods and Protocols. , (2016).
- Anderson, M. S., et al. Projection of an immunological self shadow within the thymus by the aire protein. Science. 298 (5597), 1395-1401 (2002).
- Takaba, H., et al. Fezf2 Orchestrates a Thymic Program of Self-Antigen Expression for Immune Tolerance. Cell. 163 (4), 975-987 (2015).
- Morillon, Y. M. 2. n. d., Manzoor, F., Wang, B., Tisch, R. Isolation and transplantation of different aged murine thymic grafts. Journal of Visualized Experiments. (99), e52709 (2015).
- Caetano, S. S., Teixeira, T., Tadokoro, C. E. Intravital imaging of the mouse thymus using 2-photon Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (59), e3504 (2012).
- JoVE Science Education Database. Blood Withdrawal I. Lab Animal Research. , (2019).
- Gierl, M. S., Karoulias, N., Wende, H., Strehle, M., Birchmeier, C. The zinc-finger factor Insm1 (IA-1) is essential for the development of pancreatic beta cells and intestinal endocrine cells. Genes & Development. 20 (17), 2465-2478 (2006).
- Tao, W., et al. Haploinsufficiency of Insm1 Impairs Postnatal Baseline β-Cell Mass. Diabetes. 67 (12), 2615-2625 (2018).
