Renal subkapsulär transplantation av 2 '-Deoxyguanosinbehandlade murina embryonala bräss hos nakna möss
Summary
Vi erbjuder en enkel och effektiv metod för att transplantera 2 ‘-deoxyguanosine behandlade e 18,5 tymus i njur kapseln av en naken mus. Denna metod bör medhjälpare i studien av både thymic epitelceller funktion och T-celler mognad.
Abstract
Brässen är en viktig central immun organ, som spelar en viktig roll i utvecklingen och differentieringen av T-celler. Thymus transplantation är en viktig metod för att undersöka thymic epitelcells funktion och T-cells mognad in vivo. Här kommer vi att beskriva de experimentella metoder som används inom vårt laboratorium för att transplantera 2 ‘-deoxyguanosin (att tömma givarens lymfocyter) behandlade embryonala tymus i njur kapseln av en atymiska naken mus. Denna metod är både enkel och effektiv och kräver inte särskilda kunskaper eller enheter. De resultat som erhållits via denna enkla metod visade att transplanterade bräss effektivt kan stödja mottagarens T cells produktion. Dessutom kommer flera viktiga punkter när det gäller protokollet att ytterligare klarläggas.
Introduction
Brässen är det centrala immun organet, inom brässen tymocyter genomgå positiva och negativa val, och bli mogna T-celler1,2. Onormalt positivt eller negativt val resulterar i immunbrist eller autoimmuna sjukdomar respektive3,4. Därför är tymus organtransplantation en viktig metod för att studera processen med T-celler val i givarens bräss. Denna metod är särskilt viktigt när man analyserar thymic epitelfunktion medierad av genmutationer som orsakar embryonala dödliga fenotyp när muterade5.
För att studera mogningen av en mottagares T-celler i det transplanterade tymus är utarmning av givarens lymfocyter inom brässen nödvändig. För detta ändamål, embryonala 14-, 15-eller 16-dagars (E14, E15, E16) tymus är oftast utvalda6,7. Bräss från mer mogna stadier kan också vara framgångsrikt utarmat givarens lymfocyter genom att behandla med 2 ‘-deoxyguanosine. Ett detaljerat protokoll för att tömma lymfocyter och använda äldre tymus-kulturer har dock inte tidigare beskrivits8,9. Även om transplantation protokoll har införts genom flera studier10,11, ytterligare modifiering och förbättring av dessa protokoll är nödvändigt.
Vårt protokoll är uppdelat i två delar: (i) utarmning av T-lymfocyter från sent utvecklingsstadium e 18.5 tymus av kultur i 2 ‘-deoxyguanosininnehållande media. II transplantation av odlade bräss till mottagare. I detta förfarande utvecklade vi ett enkelt sätt att leverera den stora vävnaden (E 18.5 Thymus) till njur kapseln med minskad risk för njurskada. Med fokus på senare skede tymus, kan vårt protokoll också användas direkt eller med modifieringar för transplantation av bräss vid olika utvecklingsstadier eller andra liknande stora vävnader.
Protocol
Representative Results
Discussion
Renal subkapsulär transplantation av embryonala tymus är en viktig metod för att studera thymic epitelceller funktion och processen för T-celler mognad in vivo. Även om det finns flera experimentella studier på embryonal tymus orgel kultur och transplantation6,7, vårt protokoll ger ett enkelt alternativ förfarande på murina embryonal tymus kultur och renal subkapsulär transplantation för äldre tymus vävnad.
Vårt protokoll…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av start paketet av Jinan University till S.J. och av vetenskap och teknik program i Guangzhou Kina (Grant nr 201704020209 till S.J.). Vi tackar Amy Botta (Institutionen för biologi, York University, Toronto, på M3J 1P3, Kanada) för korrekturläsning och redigering av manuskriptet.
Materials
| 0.5% Povidone iodine | Shanghai Likang Distinfectant Hi-Tech Co.Ltd | 20171113 | |
| 0.9% Sodium Chloride Injection | Shandong Qilu Pharmaceuyical Co.Ltd | 2C17112101 | |
| 1 mL Sterile syringe | Solarbio | YA1090 | |
| 2’-Deoxyguanosine | MEC | HY-17563 | 1M in DMSO, 1:800 using (final 1.25mM) |
| 24 Well Plate | Corning Incorporated | Costar 3524 | |
| 4-0 Surgical suture needles with thread | NingBo Cheng-He Microsurgical Instruments Factory China | YY0166-2002 | |
| 60mm Cell Culture Dish | Corning Incorporated | 430166 | |
| 70% ETOH | LIRCON | 20181221 | |
| APC anti-mouse CD8a antibodies | Biolegend | 100711 | 1:100 |
| Bent-tip fine forceps, JZ 10 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | JD1060 | To sterilize before use |
| Cefmetazole Sodium for Injection | Sichuan Hexin Pharmaceutical co,Ltd | 17062111 079 | 6mg in 0.5ml 0.9% NaCl solution, 7.5ul/g body weight |
| Dissecting scissors, JZ 10 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | JC2303 | To sterilize before use |
| Fetal bovine serum (FBS） | GIBCO | 10270-106 | |
| Fine forceps, JZ 10 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | JD1050 | To sterilize before use |
| Flow cytometry | BD | FACSCanto II | |
| Flunixin meglumine | MACLIN | F810147 | 1mg in 1ml 0.9% NaCl solution,2ul/g body weight |
| Forceps, Dumont#5 | World Precision Instruments | 14098 | To sterilize before use |
| Infrared lamp | OTLAN | MT-810 | |
| Needle holder, JZ 14 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | J32010 | To sterilize before use |
| PE anti-mouse CD4 | Biolegend | 100511 | 1:100 |
| Penicillin-Streptomycin mixture | GIBCO | 15140122 | 1:100 |
| Pentobarbital sodium salt | Sigma | P3761 | 1.5% solution in PBS, 75ug/g body weight |
| RPMI1640 Medium | GIBCO | C14-11875-093 | |
| Scalp vein needle | Shanghai Kindly Medical Instruments Co., Ltd | XC001 | |
| Spring scissors | VANNAS | S11014-12 | To sterilize before use |
| stereomicroscope | OLYMPUS | SZ61 | |
| Sterile 15cm cotton swab | Guangzhou Haozheng | 20150014 | |
| Sterile gauze 5 cm x 7 cm-8P | Guangzhou Haozheng | 20172640868 | |
| Sterile PBS (1x) | GENOM | GNM20012 | |
| Tissue forceps, JZ 12.5 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | J41010 | To sterilize before use |
References
- Klein, L., Kyewski, B., Allen, P. M., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of the T cell repertoire: what thymocytes see (and don’t see). Nature Reviews Immunology. 14, 377-391 (2014).
- Hogquist, K. A., Baldwin, T. A., Jameson, S. C. Central tolerance: learning self-control in the thymus. Nature Reviews Immunology. 5, 772-782 (2005).
- Spits, H., Touraine, J. L., Yssel, H., de Vries, J. E., Roncarolo, M. G. Presence of host-reactive and MHC-restricted T cells in a transplanted severe combined immunodeficient (SCID) patient suggest positive selection and absence of clonal deletion. Immunological Reviews. 116, 101-116 (1990).
- Nagamine, K., et al. Positional cloning of the APECED gene. Nature Genetics. 17, 393-398 (1997).
- Yanagihara, T., et al. Intronic regulation of Aire expression by Jmjd6 for self-tolerance induction in the thymus. Nature Communications. 6 (8820), (2015).
- Jenkinson, W., Jenkinson, E., Anderson, G. Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures. Journal of Visualized Experiments. (18), (2008).
- Bosselut, R., Vacchio, M. S. . T-Cell Development: Methods and Protocols. , (2016).
- Anderson, M. S., et al. Projection of an immunological self shadow within the thymus by the aire protein. Science. 298 (5597), 1395-1401 (2002).
- Takaba, H., et al. Fezf2 Orchestrates a Thymic Program of Self-Antigen Expression for Immune Tolerance. Cell. 163 (4), 975-987 (2015).
- Morillon, Y. M. 2. n. d., Manzoor, F., Wang, B., Tisch, R. Isolation and transplantation of different aged murine thymic grafts. Journal of Visualized Experiments. (99), e52709 (2015).
- Caetano, S. S., Teixeira, T., Tadokoro, C. E. Intravital imaging of the mouse thymus using 2-photon Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (59), e3504 (2012).
- JoVE Science Education Database. Blood Withdrawal I. Lab Animal Research. , (2019).
- Gierl, M. S., Karoulias, N., Wende, H., Strehle, M., Birchmeier, C. The zinc-finger factor Insm1 (IA-1) is essential for the development of pancreatic beta cells and intestinal endocrine cells. Genes & Development. 20 (17), 2465-2478 (2006).
- Tao, W., et al. Haploinsufficiency of Insm1 Impairs Postnatal Baseline β-Cell Mass. Diabetes. 67 (12), 2615-2625 (2018).
