Summary
Hier presenteren we atomaire kracht microscopie (AFM), die wordt gebruikt als een nano-en micro-indentatie tool op cellen en weefsels. Het instrument maakt gelijktijdige verwerving van 3D-oppervlaktetopografie van het monster en de mechanische eigenschappen mogelijk, met inbegrip van de modulus van de celwand Young en de turgor-druk.
Abstract
We presenteren hier het gebruik van atoom kracht microscopie om plantenweefsels te laten inspringen en de mechanische eigenschappen ervan te herstellen. Met behulp van twee verschillende microscopen in de indentatie modus laten we zien hoe u een elastische modulus meet en gebruikt om de mechanische eigenschappen van de celwand te evalueren. Daarnaast leggen we ook uit hoe turgor druk moet worden geëvalueerd. De belangrijkste voordelen van atoom kracht microscopie zijn dat het niet-invasieve, relatief snelle (5 ~ 20 min), en dat vrijwel elk type levend plantenweefsel dat oppervlakkig plat is kan worden geanalyseerd zonder de noodzaak voor behandeling. De resolutie kan zeer goed zijn, afhankelijk van de tip grootte en het aantal metingen per eenheid gebied. Een beperking van deze methode is dat het alleen directe toegang tot de oppervlakkige cellaag geeft.
Introduction
Atomaire kracht microscopie (AFM) behoort tot de Scanning probe microscopie (SPM) familie, waarbij een tip met een straal van meestal een paar nanometers het oppervlak van een monster scant. De detectie van een oppervlak wordt niet bereikt via optische of elektron-gebaseerde methoden, maar via de interactie krachten tussen de punt en het monster oppervlak. Deze techniek is dus niet beperkt tot topografische karakterisering van een monster oppervlak (3D-resolutie die naar een paar nanometers kan gaan), maar maakt het ook mogelijk om elk type interactie krachten zoals elektrostatische, van der Waals of contactkrachten te meten. Bovendien kan de tip worden gebruikt om krachten aan het oppervlak van een biologisch monster toe te passen en de resulterende vervorming, de zogenaamde "Inkeping", te meten om de mechanische eigenschappen ervan te bepalen (bv., jonge modulus, visco-elastische eigenschappen).
Mechanische eigenschappen van planten celwanden zijn essentieel om in aanmerking te worden genomen bij het proberen te begrijpen van mechanismen die onderliggende ontwikkelingsprocessen1,2,3. Inderdaad, deze eigenschappen worden strak gecontroleerd tijdens de ontwikkeling, in het bijzonder omdat de celwand verzachting nodig is om cellen te laten groeien. De AFM kan worden gebruikt om deze eigenschappen te meten en de manier te bestuderen waarop ze veranderen tussen organen, weefsels of ontwikkelingsstadia.
In dit artikel beschrijven we hoe we de AFM gebruiken om zowel de mechanische eigenschappen van de celwand als de turgor-druk te meten. Deze twee toepassingen worden gedemonstreerd op twee verschillende AFM microscopen en zijn hier gedetailleerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. meting van de mechanische eigenschappen van de celwand
Opmerking: Voorbeeld van de ontwikkeling van het tweezijdig van Arabidopsis wordt gepresenteerd.
- Bereiding van de biologische monsters
- Verzamel een gesloten bloem knop in fase 9 tot 10 (ongeveer 0,5 mm lang) volgens gepubliceerde stadia bepaling voor Arabidopsis4. Onder een verrekijker, met behulp van fijne pincet, open voorzichtig de knop om het stadium van de ontwikkeling te controleren en verzamelen van de tweezijdig gelegen in het midden van de bloem.
- Zet de tweezijdig op dubbele kant tape geplaatst in het midden van de cover van een kleine Petri schaal (diameter van 5 cm).
Opmerking: Als alternatief kan biocompatibele lijm ook worden gebruikt voor een efficiëntere immobilisatie van het monster bij inspringingen. - Voeg snel water toe totdat het monster volledig bedekt is. Dit voorkomt uitdroging en vermindert de hechting van de punt aan het monster. U het monster ook onderdompelen in vloeibaar medium, zoals een Arabidopsis Apex Culture medium5.
- Kalibratie AFM
- Stel de vrijdragende veerconstante k hoog genoeg zodat de vervorming van het monster oppervlak tot de gewenste inkeping, maar niet te hoog om verlies van gevoeligheid te voorkomen.
Opmerking: Als een ruwe vuistregel, als jonge modulus van het monster bekend is, kan de orde van grootte van de veerconstante worden gekozen als k≈E * δ, waarbij δ de gewenste inkeping is. - Gebruik een R = 400 nm sferische uiteinde met 15 μm Tip-Cantilever afstand.
Opmerking: De punt straal is direct gerelateerd aan laterale resolutie. In het algemeen, voor inspringingen op biologische materialen, kies afgeronde toppen (R groter dan 10-20 nm) of colloïdale sondes. Kleine colloïdale sondes kunnen lastig te gebruiken zijn vanwege de kleine afstand tussen het uiteinde van de tip en de cantilever die het monster oppervlak kunnen aanraken. - Schakel de software in en plaats het hoofd horizontaal ten minste 2-3 uur vóór het experiment: dit zal het hoofd in staat stellen te thermalize en zal thermisch geïnduceerde Cantilever-Laser relatieve bewegingen voorkomen. Als de Microscoop is uitgerust met een CellHesion-module (uitbreiding van het beschikbare Z-piëzo-bereik tot 100 μm in plaats van 15 μm), schakelt u eerst de controller in en selecteert u vervolgens CellHesion-modus bij het starten van de software.
- Monteer de cantilever op het glazen blok en monteer het blok op het hoofd. Plaats een druppel van een paar micro liters ultrapuur water op de punt om de vorming van luchtbellen te voorkomen wanneer de punt in het water wordt gedompeld.
- Plaats een hard monster (gereinigde glazen glijbaan of saffier) en Voeg 30-50 μL ultrazuiver water toe.
Opmerking: De kalibratieprocedure die hier wordt beschreven, is de soms opgeroepen contact kalibratie. Ten eerste wordt een krachtcurve gemaakt op een stijf en plat oppervlak en dan wordt het oscillatie spectrum van de thermisch opgewonden Cantilever geregistreerd om de veerconstante te berekenen. Er bestaan andere kalibratie protocollen en deze worden in het kort beschreven in de discussie paragraaf. - Plaats het hoofd op het podium (wees voorzichtig om de Z-motoren hoog genoeg op te tillen). Gebruik de optische afbeelding om de laser op de cantilever ruwweg te plaatsen.
- Verplaats de laser langs de hoofdas van de cantilever die het somsignaal op de fotodiode bewaakt.
Opmerking: Wanneer standaard cantihendels worden gebruikt, moet een som groter dan 0,5 V worden verkregen. - Beweeg de laser langs de andere richting en Maximaliseer het totaal signaal om de laser in het midden van de cantilever te positioneren. Dit zal de cross-talk tussen laterale en verticale afbuiging minimaliseren.
- Verplaats de laser langs de hoofdas van de cantilever die het somsignaal op de fotodiode bewaakt.
- Meting van de afbuig gevoeligheid
Opmerking: De fotodiode leest Laser verplaatsing en biedt een signaal in volt. Om afbuiging in metrische eenheid te kunnen meten, moet de afbuig gevoeligheid worden gemeten.- Stel het instrument in contact → Force spectroscopie. Stel een relatieve setpoint in op 2 V, Z lengte tot 0,5 μm, en Verleng de snelheid tot 2 μm/s (sample frequentie tot 10000 Hz) en selecteer Z closed loop.
- Open de kalibratie Manager en selecteer het contact gedeelte van de krachtcurve (dat lineair moet zijn) om een lineaire pasvorm te maken: de inverse van de helling geeft de afbuig gevoeligheid. De fotodiode lezing is nu gekalibreerd in metrische eenheid.
-
Bepaling van de veerconstante. Selecteer in kalibratie beheerde optie Spring constant om een thermische spectrum overname uit te voeren. Als u het signaal voor een langere tijd wilt gemiddelde, selecteert u het symbool ∞. Het energie spectrum van de thermisch opgewonden Cantilever kan verschillende pieken vertonen; teken een selectie rond de positie die bij de laagste frequentie is geplaatst om deze aan te passen.
Opmerking: Als Thermal Tune in vloeistof wordt uitgevoerd, zal de resonantie piek breder zijn en de frequentie ervan verlaagd ten opzichte van de nominale.
- Stel de vrijdragende veerconstante k hoog genoeg zodat de vervorming van het monster oppervlak tot de gewenste inkeping, maar niet te hoog om verlies van gevoeligheid te voorkomen.
- Force spectroscopie experiment instellen en acquisitie
- Plaats het monster op het podium van de AFM en plaats het hoofd over het monster.
Opmerking: Zorg ervoor dat de kop genoeg is ingetrokken om een hard contact tussen de punt en het monster oppervlak te voorkomen. - Laat een paar minuten de cantilever thermalize.
- In Qi -modus, aanpak met een setpoint kracht van 50 nn.
- Stel een Z-lengte van 4 μm en een scangebied in op 80 x 80 μm2 met een aantal pixels van 40 x 40. Stel in het deelvenster Geavanceerde beeldvormings instellingen de modus in op constante snelheid. Stel de snelheid uit en trek deze uit tot 200 μm/s en sample frequenties tot 25 kHz.
- Begin met scannen en gebruik deze snelle scan van lage kracht om te controleren of het monster beweegt. Controleer of het gescande gebied vrij is van puin of gedeflecteerde cellen en zoek een regio van belang zo plat mogelijk om de metingen uit te voeren.
Opmerking: Om de echte sample-Tilt te waarderen, moet de lijn nivellering worden ingesteld op uit of constant. Een overmatige kantelhoek tussen de inspring-as en het oppervlak zal een effect hebben op de gemeten Young modulus5. - Zodra een gebied van belang is gevestigd, selecteert u een gebied van 40 x 40 tot 60 x 60 μm2 eromheen en verhoogt u het pixel nummer tot 2 pixels/μm. Verhoog het instelpunt tot 500 nm om 100-200 nm inspringingen te verkrijgen. Pas deze waarde, indien nodig, aan het begin van het experiment aan. Verlaag de Z-lengte tot 2 μm. Verlaag de snelheid tot 100 μm/s en verhoog de sample frequentie tot 50 kHz.
- Start het scannen en sla de uitvoer op (meestal samengesteld door een afbeelding en een gegevensbestand).
- Verwijder de punt houder aan het einde van de meetdag en spoel het voorzichtig af met ultrapuur water en 70% EtOH.
- Droog en verwijder de Cantilever. Voor verdere experimenten met dezelfde tip, overweeg het schoonmaken met een NAT reinigings protocol en, indien mogelijk, een follow-up plasma O2 behandeling. Laat het water niet drogen op de cantilever en/of de punt houder om zout kristallisatie te voorkomen.
- Plaats het monster op het podium van de AFM en plaats het hoofd over het monster.
- Data-analyse (voor 6. x gegevensverwerking softwareversie)
- Open gegevensverwerkings software en laad het gegevensbestand.
- Klik op deze kaart gebruiken voor batchverwerking knop om dezelfde analyseparameters te gebruiken op alle curven van de kaart.
- Selecteer in vooraf gedefinieerde proces ladende optie Hertz fit.
- Gebruik het eerste tabblad om de kalibratie parameters te controleren of te wijzigen.
- Verwijder op het tweede tabblad een verschuiving (of een verschuiving plus een Tilt) van de basislijn om de gemiddelde waarde in te stellen op 0.
- In het derde tabblad, schat u de positie van het contactpunt (POC) door het te beschouwen als het eerste punt dat de 0 kracht oversteekt bij het neerkomen van de setpoint waarde langs de strek curve.
- De verticale positie van het tabblad berekent de beweging van de punt door de afbuiging van de cantilever af te trekken van de gemeten hoogte. Gebruik bij deze stap niet-vloeiende hoogte (onbewerkte gegevens) voor de volgende pasvorm door het bijbehorende selectievakje aan te vinken.
- Selecteer het juiste pasvorm model in het tabblad elasticiteit fit . Als er geen of zwakke hechting zichtbaar is op de afstel Curves (overeenkomend met minder dan 10% van de setpoint-kracht of op de maximale gemiddelde kracht bij de geselecteerde inspring diepte), moet het model type worden ingesteld op Hertz/Sneddon en moet de curve uitbreiden worden gebruikt. In het geval van een sterkere hechting, moet het DMT-model, dat staat voor het model Derjaguin-Muller-Toporov, de voorkeur krijgen en moet de pasvorm worden uitgevoerd op het intrekken van curven (Raadpleeg handleiding voor meer informatie over de beschikbare contact modellen en bijbehorende formules).
- Stel de geometrische parameters van de punt in op basis van de nominale puntvorm. Hier, Tip vorm is bol en tip straal is 400 nm.
- Stel de Poisson-ratio in op 0,5 omdat deze conventioneel wordt gedaan voor biologisch materiaal (overeenkomend met niet-comprimeerbaar materiaal).
-
Aanpassen aan specifieke inspringing. Standaard wordt de pasvorm uitgevoerd over de hele curve. Als de pasvorm tot een specifieke inspringing moet worden uitgevoerd, vinkt u eerst het selectievakje verschuiving curve aan; Dit zal de oorsprong van de curve verschuiven op basis van nieuw vastgestelde baseline-en POC-waarden.
- Voeg een tweede elasticiteit pasvorm routine door te klikken op het pictogram in het hoofdvenster.
- Stel opnieuw alle fitte parameters in en specificeer in X min de gewenste inspringing. Voeg zo veel stappen als nodig (2 tot 3 stappen moeten voldoende zijn) om de bepaling van de POC positie en vervolgens de berekende inspringing diepte te verfijnen. Het proces kan op dit moment worden opgeslagen.
- Klik op Keep en toepassen op alle om de vorige stappen op alle curven van de kaart te herhalen.
- Sla de resultaten op. Er wordt een afbeelding en een. TSV-bestand verkregen.
2. meting van de turgor druk
Opmerking: Een voorbeeld van de oryzalin-behandelde bloeiwijze meristam van Arabidopsis wordt gepresenteerd.
- Bereiding van biologisch monster
- Verzamel Arabidopsis bloeiwijze meristam (IM) behandeld met de microtubulus depolymerizing drug oryzalin uit in vitro plantlet geteeld op medium met de Polar auxin Surgery transport inhibitor 1-N-Naphthylftalaminezuur (NPA) volgende gepubliceerde methode 6.
- Montage IM sample na een van de twee opties
- Voor lange termijn bewaking: Monteer het monster in een Petri schaaltje met Arabidopsis Apex Culture medium (ACM)7,8 en 0,1% planten conserverings mengsel (ppm), om verontreiniging te voorkomen. Onderbreek de IM-Tip boven het ACM-oppervlak en ondersteun de basis van IM met een druppel van 2% agarose.
- Voor meting met snelle oplossing veranderingen: Monteer het monster in een Petri schaaltje met een klein stukje lijm mastiek, en dicht snel de kloof tussen de mastiek en de sample basis met bio-compatibele lijm. Wacht tot de lijm stollen (minder dan 2 min) en dompel het monster vervolgens in vloeibare ACM met 0,1% PPM.
Opmerking: Zorg ervoor dat het monster oppervlak niet is bekleed met agarose of lijm bij het fixeren van de monster basis. AFM meting van de turgor druk moet het monster stabiel worden gemonteerd, en de vorige montagemethoden zorgen voor een aanvaardbare stabiliteit. Afhankelijk van het monster kunnen andere montagemethoden worden gebruikt, zoals dubbelzijdige tape, poly-lysine, enz.
- Kalibratie AFM
- Schakel de AFM-acquisitie software in en kies de Peakforce QNM (grote amplitude) meetmodus.
- Voer de kalibratie uit volgens hetzelfde principe als beschreven in de stappen 2,1 tot en met 2,6.
- Stel in het venster parameters controleren de Scan grootte in op 0. Stel in het venster helling helling grootte tussen 200 nm en 500 nm, trig drempel tussen 2 v en 5 v en aantal monsters tot 2048 of hoger.
- Lijn de cantilever tip uit met het kalibratiemonster en klik op approach.
- Bij contact, ga naar ramp Window en klik op de knop doorlopende helling. Bepaal op de lineaire regeling van de curve de helling door op de knop gevoeligheid bijwerken te klikken. Herhaal de afbuig gevoeligheids meting meerdere malen en werk de kalibratie handmatig bij met het meet gemiddelde door de tab detector te openen via de menu kalibratie.
- Trek de AFM-kop uit en verwijder het kalibratiemonster.
Opmerking: Het wordt voorgesteld om de hoofd van de AFM volledig in te trekken door tab- fase → initialiseren te kiezen om onbedoeld moeilijk contact te voorkomen bij het wijzigen van het monster.
- Force spectroscopie experiment instellen en acquisitie
- Als het monster nog niet is ondergedompeld, dompel het dan onder in de vloeibare ACM met PPM.
- Geef in de verwervings software de volgende Meetparameters op:
- Stel in het venster parametercontrole de veerconstante in op de gefabriceerde veerconstante van de cantilever of de vastgestelde veerconstante zoals in stap 2,8. In dit voorbeeld is het ingesteld op 42 N/m.
- Stel de punt straal in op 400 nm in dit voorbeeld.
- Stel de monster Poisson-verhouding in op 0,5, aangezien water voornamelijk bijdraagt aan de turgor-druk.
- Stel sample/line in op 128 om een snelle acquisitie te garanderen.
- Stel de scan snelheid in op 0,2 Hz.
- Stel de Scan grootte in op 1 μm.
Opmerking: Instellen scansnelheid en scan grootte klein kan effectief voorkomen dat AFM scan-geactiveerde monster schade. Het wordt aanbevolen om deze twee parameters bij elke monster wijziging te verminderen. - In ramp Window, stel helling grootte op 5 μm.
Opmerking: Het is beter instellen van de helling groter is dan de beoogde inspringing diepte voor betere basislijn verwerving. - Stel de trig-drempel in op maximum.
- Stel het aantal samples in op 4608.
- (Optioneel) in Microscoop → engagement parameters tab, verminder de volgende parameters om sterke contact-geïnduceerde monster schade te voorkomen. Stel piekkracht Engage setpoint in op 0,3 v (standaard 0,5 v). Stel betrokkenheid int. Gain in op 0,5 (standaard 0,75). Set SPM Engage stap tot 4 μm (standaard 15 μm).
- Plaats het monster onder de AFM-kop en lijn het uit totdat de cantilever wordt ondergedompeld, maar niet in aanraking komt met het monster oppervlak.
Opmerking: Tijdens het naderen licht blazen op het oppervlak van vloeibare ACM totdat een vloeistof brug wordt gevormd tussen de cantilever en het vloeistofoppervlak. Dit voorkomt meestal moeilijk contact. - Met zorg, handmatig benaderen naar het monster. Wanneer de sonde relatief dicht bij het monster oppervlak ligt, klikt u op approach.
- Bij contact, verhoog geleidelijk de Scan grootte en/of scansnelheid tot een gewenst evenwicht zonder beschadiging van het monster en/of de Cantilever.
Opmerking: De scan grootte wordt beperkt door de oppervlakte kromming en ruwheid van het voorbeeld. In het geval van oryzalin-behandelde IM, kan 50 x 50 μm2 scangebied worden bereikt met een scansnelheid van 0,3 Hz. - Bepaal tijdens het scannen of het meetgebied naar wens is. Verplaats indien nodig. Als u tevreden bent, klikt u op de knop punt en schiet om het venster punt en schieten te starten.
- Voordat u de scan opneemt, kiest u een geschikt beeld kanaal dat een duidelijke identificatie van celcontouren mogelijk kan maken. Vaak is piekkracht fout, DMT modulus, LogDMT modulus of dissipatie geschikt. Geef de map voor opslaan en de bestandsnaam op. Klik vervolgens op oprit bij volgende scan om de opname te starten.
Opmerking: Een tekenreeks van een punt en drie getallen worden automatisch toegevoegd na de opgegeven bestandsnaam (zoals. 000). Dit aantal wordt automatisch verhoogd met 1 bij elke opgeslagen scan herhaling. - Wanneer het scannen is voltooid, wordt de software-interface automatisch omgeleid naar het venster van de helling . Klik op de gescande afbeelding om de posities op te geven die u wilt laten inspringen.
Opmerking: Voordat u inspringingen opneemt, is het beter om verschillende bezienswaardigheden te kiezen voor het uitvoeren van test inspringen door alleen op hellingte klikken, in het geval dat parameter afwisseling vereist is (voor helling grootte, piëzo-positie, enz.). De diepte van de inspringing moet groter zijn dan de dikte van de celwand (bij voorkeur afzonderlijk bepaald door transmissie-elektronenmicroscopie). - Kies ten minste drie inspring sites per cel in de buurt van het barycenter en herhaal de inspringing drie keer per site. Dit zou ten minste negen kracht curves per cel opleveren voor verdere analyse. Wanneer u tevreden bent met de plaatsing van de inspringing site, klikt u op helling en vastleggen. De kracht-indentatie curven worden automatisch opgeslagen in de aangewezen map.
- Wanneer de hellingen zijn voltooid, verplaatst u naar een andere positie voor tegel meting of neemt u de scan kop over en wijzigt u het monster.
- Als u klaar bent, reinig de cantilever zoals in stappen 1.3.8 en 1.3.9.
- Data-analyse
- Open het *. MCA-bestand in de analyse software. Hiermee wordt de positie van elke krachtcurve op de gescande afbeelding weergegeven. Indien gewenst, vooraf selecteren kracht curven voor analyse.
- Open een krachtcurve die moet worden geanalyseerd, meestal in de indeling van x0000y. 00Z, waarbij x de opgegeven bestandsnaam is in de opslag directory, terwijl y en z automatisch geregistreerde nummers zijn die de inspring volgorde en het Scan nummer aangeeft.
- Klik op de knop basislijn correctie en sleep de blauwe streepjeslijnen op de krachtcurve totdat bron basislijn start uitbreiden en bron basislijn stop uitbreiden op respectievelijk 0% en 80% zijn. Klik op uitvoeren.
Opmerking: U ook uitbreiden bron basislijn stop kan worden ingesteld op verschillende waarden, zolang deze nog binnen de basislijn en niet buiten het contactpunt. - Klik op de knop Boxcar filter en klik op uitvoeren om de boog vloeiend te maken.
- Klik op de knop inspringen .
- Stel in het invoer venster de actieve curve in om uit te breiden.
- Stel de pasvorm methode in op Linearized model en Neem de adhesie kracht op Ja.
- Stel Max Force fit grens in op 99% en min Force fit grens tot 75%.
- Stel pasvorm model in op stijfheid (lineair).
Opmerking: Deze Setup zal de schijnbare stijfheid k berekenen voor turgor druk aftrek. In dit voorbeeld reflecteren de pasvorm grenzen met een stijfheid van ongeveer 1,5 μm diepte van de inspringing.
- Forceer curven kunnen in batch worden geanalyseerd. Klik op de knop historie uitvoeren , geef rapportmap op en voeg alle andere kracht curven toe die dezelfde behandeling vereisen. Wanneer u tevreden bent, klikt u op uitvoeren. Standaard wordt de pasvorm opgeslagen als een *. txt bestand.
- Wanneer k batch is aangebracht, klikt u op historie → 5 inspringen om terug te keren naar het venster inspringen.
- Wijzig de begrenzing van de maximale kracht grens in 10% en de minimumgrens van de Force fit naar 0%.
- Set fit model naar hertzian (sferisch).
Let op: dit zal de celwand van de jonge modulus E voor turgor druk aftrek berekenen. In dit voorbeeld reflecteren de grenzen van de pasvorm een Hertzian fit (met behulp van sferische sonde) van ongeveer 0,4 μm inspring diepte.
- Herhaal stap 2.4.6 voor batch fit voor E.
- Open het *. 00Z-bestand (z is het automatisch geregistreerde scan nummer) om de verschillende scan kanalen weer te geven. In hoogte kanaal venster, Klik sectie knop. Hierdoor kan de oppervlakte kromming van het monster worden gemeten die vereist is voor de aftrek van turgor druk.
- Teken een lijn over de lange as van één cel, verplaats de grenzen van de streepjeslijn naar de celranden en noteer de RADIUS -waarde r1. Herhaal dit voor de korte as om RADIUS r2op te halen. Bereken de oppervlakte van de cel gemiddelde kromming κM en Gaussiaanse kromming κG met behulp van de twee radii meting als volgt:
En
- Teken een lijn over de lange as van één cel, verplaats de grenzen van de streepjeslijn naar de celranden en noteer de RADIUS -waarde r1. Herhaal dit voor de korte as om RADIUS r2op te halen. Bereken de oppervlakte van de cel gemiddelde kromming κM en Gaussiaanse kromming κG met behulp van de twee radii meting als volgt:
- Deduce turgor druk P met behulp van het model van de dunne schelp gepubliceerd9 als volgt:
Met
waarbij t de celwand dikte is, bepaald door bijvoorbeeld elektronenmicroscopie.
Opmerking: De aftrek van turgor druk is een passend proces, waarbij iteraties nodig zijn. Vier iteraties zijn over het algemeen in staat om stabiel product te reproduceren, maar meer iteraties kunnen worden gedaan (bijvoorbeeld 100 keer). - Bereken gemiddelde E, k en P per cel. Registreer ook de intracellulaire variabiliteit (bijv. standaarddeviatie) voor documentatie.
En
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1a en Figuur 1b tonen een screenshot ter illustratie van het resultaat van de stappen 1.3.4 tot 1.3.6 van het Protocol, gebruikt om een regio van belang te lokaliseren waar de Qi-kaart moet worden verworven. Het is vermeldenswaard dat de regio van belang is gekozen om niet te worden op een gekanteld oppervlak (dat wil zeggen, zo plat mogelijk). In feite kan, zoals opgemerkt door Routier et al.5, als de inspring-as niet loodrecht op het oppervlak staat, de jonge modulus gemeten worden onderschat. Dit effect is zichtbaar in de rechterbovenhoek van de C-of D-panelen van Figuur 1, waarbij een deel van de rand van de cellen zachter oogt dan de rest van de cel. De artefacten geïnduceerd door dit effect zullen veel sterker in het geval van meristems, waar de lokale kantelhoek gemakkelijk kan overwinnen 40 ° over 50 x 50 μm2 scangebieden. In ons laboratorium ontwikkelen we momenteel een algoritme, gebaseerd op de aanpak beschreven door Routier et al.5, om die artefacten te corrigeren (papier in voorbereiding). Figuur 1c en figuur 1d tonen de modulus-kaarten van Young die zijn verkregen na de analyse die in de vierde alinea van het protocol is beschreven. In het bijzonder vertegenwoordigt panel C de jonge modulus verkregen analyse van de hele inkeping, tot aan de gebruiker gedefinieerde kracht setpoint, terwijl panel D toont het resultaat van de analyse van de eerste 100 nm van inspringen (zoals beschreven in stap 1.4.9). Hier zien de 2 kaarten er zeer gelijkaardig uit, omdat tijdens het experiment opgezet, het setpoint is gekozen om gemiddelde inkepingen rond 100 nm te verkrijgen. De variatie van de geanalyseerde inkeping kan soms leiden tot een betere Highlight voorbeeld heterogeneities, dat kan nuttig zijn voor het identificeren van de locatie of voor het verstrekken van informatie over het gedrag van interne structuren (bijvoorbeeld Costa et al.10)
De krachtcurve in Figuur 2 toont twee effecten die het vermelden waard zijn. In de eerste plaats kan worden opgemerkt dat als het approach deel van de krachtcurve daadwerkelijk eindigt bij de setpoint kracht van 500 nN, de neerwaartse beweging blijft doorgaan, wat betekent dat de laatste kracht die door de tip wordt uitgeoefend hoger is dan verwacht (hier 1.000 nN). Dit is te wijten aan het feit dat de feedback lus bewaking van de cantilever afbuiging niet ogenblikkelijk optreedt, dus de eindige reactietijd introduceert een lag tussen afbuiging drempel detectie en piëzo beweging stop. Bovendien, vooral bij het gebruik van CellHesion die de monsterhouder beweegt, de traagheid van de bewegende delen komt in het spel, waardoor deze tijd langer lag. Dit probleem kan worden beperkt door het gebruik van het hoofd piëzo, in welk geval de gebruiker moet echt voorzichtig zijn in het geval van metingen op zeer ruwe of gekantelde monsters, of door het verminderen van de helling snelheid, die toch beperkt de resolutie en/of het aantal monsters gescand ( Bovendien kan de groei van het monster voor te trage kaarten een probleem worden. In het algemeen, als de kracht curven ver genoeg zijn van elkaar (op basis van het inspringingsmodel van keuze, kan de straal van het ingesprongen gebied worden berekend gezien de diepte van de inspringing en gebruikt als minimale scheidingsafstand), de metingen uitgevoerd in verschillende posities langs het monster moeten niet worden gecorreleerd en als de analyse wordt uitgevoerd op de benaderings curve, moet het overwinnen van de kracht drempel geen probleem zijn. Hoe dan ook, als het monster delicaat is of als herhaalde scans worden uitgevoerd op hetzelfde gebied, kan de wetenschapper proberen om deze Overshoot te minimaliseren. Helaas is er geen vuistregel om het bedrag van deze Overshoot te bepalen, omdat het afhangt van de gebruikte piëzo, op de helling snelheden, maar ook op materiaaleigenschappen: het stijvere van het materiaal, hoe sneller de variatie van het afbuig signaal in de tijd en , gezien een eindige feedback responstijd, hoe hoger de Overshoot.
Het tweede ding om op te merken is de zwaaiende op intrekken curve gemarkeerd door de ellips. Dergelijke zwaaiende kan een indicator van het monster bewegen/trillen onder de actie van de tip. In dit geval kan de gebruiker proberen om het gescande gebied te veranderen (soms ander deel van de Microscoop, maar de tip kan het monster aanraken, of het monster kan onvoldoende goed worden bevestigd aan zijn steun) of het monster als verschillende van hen zijn voorbereid op dezelfde steun. Als de functie er altijd is, is het beter om de fixatie methode te wijzigen, in dit geval overschakelen van de dubbelzijdige tape fixatie naar biocompatibele lijmen.
Figuur 3 toont de bepaling van de belangrijkste parameters voor de aftrek van turgor druk. Elke parameter, met uitzondering van celwand dikte11 die afzonderlijk werd bepaald door elektronenmicroscopie te zijn ~ 740 nm, kan worden opgehaald uit de AFM scans en inkepingen. Na het aanpassingsproces in stap 2.4.10 wordt de turgor-druk afgeleid als 1,50 MPa voor deze krachtcurve. Het bundelen van alle achttien kracht curven in deze cel levert gemiddelde waarden van E = 6,77 ± 1,02 MPA, k = 14,18 ± 2,45 N/m en P = 1,45 ± 0,29 MPA (gemiddelde ± standaarddeviatie).
Figuur 1 : Topografische kaarten (hoogte gemeten) meestal verworven tijdens een experiment. A) een eerste lage resolutie/Low Force map wordt geregistreerd om een geschikte regio te vinden om te scannen. (B) een kleinere hoge resolutie/hogere Forceer kaart wordt verkregen voor de berekening van Young ' modulus (op het gebied gemarkeerd door het zwarte gestippelde vierkant). (C) Young 's modulus kaarten, berekend op basis van de B-kaart, zoals beschreven in stap 1,4. Hier is de Young modulus kaart verkregen door het analyseren van de hele inkeping op elke krachtcurve. (D) de ' Young modulus map ' heeft alleen de eerste 100 nm inspringingen geanalyseerd. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2 : Voorbeeld van een krachtcurve. In het blauw de aanpak, in het rood het intrekken segment. Kracht maximum (gelegen op de terugtrek curve) verschilt van de kracht setpoint vanwege de eindige feedback loop reactietijd en vanwege de traagheid. De zwaaiende in intrekken curve kan representatief zijn voor een tekort in de monster fixatie op zijn steun. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3 : AFM metingen voor turgor druk aftrek. (A) de DMT-modulus-kaart toont een duidelijke celcontour om de positionering van diepinspringings plaatsen in de buurt van Cell barycenter te begeleiden. Indentatie sites worden gemarkeerd doorkruisen. B) Forceer curve van diepe inkeping op de Rode Kruis positie in A. Cell Wall Young modulus E (groen) en sample schijnbare stijfheid k (rood) zijn gemonteerd in verschillende regimes van de curve zoals beschreven in stap 2,4. R 2 geeft de determinatiecoëfficiënt van de passingen aan. (C) hoogtekaart met handmatig bepaalde lange en korte assen van a, afgebeeld met witte lijnen, van dezelfde cel die is geanalyseerd in panelen a en B.D) hoogteprofiel van de lange en korte assen van de cel in paneel C (blauw, lange as rood, korte as) en de fitte d radii van kromming (r1 en r2). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De opkomst van vormen in planten wordt voornamelijk bepaald door de gecoördineerde snelheid en richting van de groei tijdens tijd en ruimte. Plantencellen zijn omhuld in een rigide celwand gemaakt van een polysaccharidische matrix, die ze samen lijmen. Als gevolg hiervan wordt de celexpansie bestuurd door het evenwicht tussen turgor-druk trekken op de celwand en de stijfheid van de celwand die weerstand bieden aan deze druk. Om de mechanismen van de onderliggende ontwikkeling te begrijpen, is het belangrijk om zowel de mechanische eigenschappen van de celwand als de turgor-druk in verschillende weefsels of cellen van een bepaald orgaan te kunnen meten. Zoals in dit artikel wordt aangetoond, is de AFM in dit verband de keuze methode.
Er zijn verschillende kritieke stappen in het protocol. De eerste is de weefsel bereiding die snel genoeg moet zijn om uitdroging te voorkomen. Dit kan met name kritisch zijn als we de turgor druk willen meten. Zeer belangrijk is ook een correcte fixatie van het monster op zijn substraat: een onstabiel monster kan leiden tot zeer duidelijke effecten zoals een macroscopische beweging die optisch gemakkelijk kan worden gedetecteerd, of een sterke vervorming van kracht curven. Hoe dan ook, monster trilling of buigen kan subtiel zijn om te detecteren, het introduceren van artefacten in de resultaten. Tot slot, een andere kritieke stap betreft de keuze van de parameters voor inspringen. Dit is bepalend voor de kwaliteit van de resultaten.
Bij het meten van mechanische eigenschappen op grote gebieden (meer dan 40-50 μm scan maten), hoogteverschillen kunnen hoog zijn, waardoor het moeilijk is om het oppervlak goed te volgen en het realiseren van kracht curven zonder de grenzen van Z piezo bereik te bereiken. Om dit probleem te verhelpen, is een CellHesion-module gebruikt. Deze module voegt een extra Z piëzo, gelegen in het monster stadium, met een 100 μm bereik, waardoor grote gebieden verwerving zonder gevaarlijk Z piezo grenzen.
De eerste beperking van de methode is dat we alleen oppervlakkige cellagen kunnen meten. Onlangs hebben auteurs echter de AFM gebruikt op weefsel secties12,13,14. Hoewel dit moet worden gedaan op vast materiaal, het kan toegang geven tot mechanische eigenschappen van diepe cellagen. Als alternatief zijn ook diepere inkepingen uitgevoerd om mechanische eigenschappen van interne weefsels op levende monsters af te leiden, zij het met een groter offer op ruimtelijke resolutie15. Een tweede beperking kan worden gekoppeld aan de geometrie van het monster, omdat een oppervlak met een steile helling problematisch kan zijn, omdat de punt niet meer loodrecht op het monster staat. We moeten het bereik van de hoeken waarbinnen de maatregelen betrouwbaar zijn, beperken en we ontwikkelen momenteel een algoritme om mogelijke artefacten in verband met dit fenomeen te corrigeren. Ook zijn sommige weefsels bedekt met trichomen die de metingen kunnen blokkeren. Tot slot meet indentatie mechanische eigenschappen in een loodrechte richting met betrekking tot het celoppervlak en we kunnen ons afvragen of dit gemakkelijk kan worden gekoppeld aan de uitbreidbaarheid van de celwand die is gekoppeld aan de groeicapaciteit. Verschillende studies suggereren dat het het geval is15,16.
Het is de moeite waard om hier een algemenere observatie te maken over de meting/toepassing van krachten door AFM. Zoals beschreven in het protocol sectie, om laser verplaatsingen op de fotodiode te kunnen transformeren naar krachten, moet een kalibratie worden uitgevoerd. In deze kalibratie één parameter, de afbuiging gevoeligheid, maakt het mogelijk om laser verplaatsingen te converteren naar werkelijke Cantilever afbuiging (over het algemeen gemeten in nm), dus deze factor kalibreert fotodiode uitgangsspanningen (langs de verticale assen) om verplaatsingen in Nm. De tweede factor is de veerconstante K, gemeten in N/m, die verticale Cantilever afbuigingen in kracht eenheden (over het algemeen nN) converteert, omdat de flexibele cantihefbomen zich gedragen als veren. Zelfs als de procedure eenvoudig lijkt, is een robuuste en reproduceerbare kalibratie van K voor AFM-kracht spectroscopie-metingen nog steeds een probleem, vanwege verschillende foutbronnen die de verschillende stappen van de procedure kunnen beïnvloeden. Bijvoorbeeld, de meting van de afbuigings gevoeligheid die een krachtcurve op een stijf oppervlak realiseert, kan leiden tot onjuiste waarden als de tip op het oppervlak glijdt, of als het oppervlak niet perfect wordt gereinigd of ook als de oppervlakte lading elektrostatische repulsie induceert. In alle vorige gevallen zal het contact gedeelte van de krachtcurve vervormd worden (verder gekanteld of gebogen in plaats van lineair).
De in de protocol sectie beschreven contactprocedure is slechts een van de verschillende bestaande kalibratieprocedures. Er zijn ten minste 2 andere methoden die op een relatief eenvoudige en goedkope manier kunnen worden gebruikt: de Sader-methode (ook wel non-contact genoemd bij uitvoering in sommige AFM-software) of de referentie-Cantilever methode. Sader Method17 is oorspronkelijk ontwikkeld door John Sader voor V-vormige cantihefbomen en vervolgens voor rechthoekige degenen18 en heeft geen behoefte aan de verwerving van een krachtcurve op een stijf substraat. In plaats daarvan moet de gebruiker (uit de temperatuur zoals in de contactmethode), de lengte en breedte van de cantilever en de dichtheid en viscositeit van de vloeistof waar de cantilever is (over het algemeen lucht, water of water-achtige vloeistoffen) opgeven. Vervolgens wordt een thermisch spectrum verworven en worden zowel de afbuig gevoeligheid als de veerconstante gemeten. Deze methode is voordelig bij het gebruik van zeer scherpe of Gefunctionaliseerde tips die mogelijk beschadigd raken door een krachtcurve op een stijf substraat.
Beide voorgaande methoden hebben betrekking op de overname van het oscillatie spectrum van een thermisch opgewonden Cantilever. Wanneer stijve cantihefbomen bij kamertemperatuur worden gebruikt, kan de gemiddelde oscillatie amplitude lager zijn dan 0,1 nm, waardoor de resonantie piek kleiner en moeilijker te detecteren is. Hoe dan ook, ten minste voor beide instrumenten die in dit papier worden gebruikt, kan de resonantie piek daadwerkelijk worden gedetecteerd in lucht en in water en worden gemonteerd voor het meten van de veerconstante (gezien het feit dat wanneer de meting in vloeistof wordt gedaan, de resonantie frequentie verschuift naar lagere waarden en de piek verbreedt).
Een derde methode gebruikt geen thermische melodie, maar in plaats daarvan een referentie-Cantilever of een referentie-elastische structuur, met een bekende veerconstante (meestal met een onzekerheid rond of onder 5%), om de cantilever Kte bepalen. In dit geval moet een eerste krachtcurve worden verworven op een stijf substraat om de afbuig gevoeligheid te meten (die weer komt samen met alle mogelijke artefacten die de vorm van de curve beïnvloeden). Vervolgens wordt het stijve substraat vervangen door de referentie-Cantilever (in het algemeen een tip-less Cantilever met een gekalibreerde veerconstante) en een andere (of enkele andere) krachtcurve wordt uitgevoerd, waarbij de waarde van de afbuig gevoeligheid opnieuw wordt opgenomen. De constante van de vrijdragende veer wordt dan berekend als:
waar KRef de veerconstante is van de referentie Cantilever, SRef de afbuig gevoeligheid gemeten op het, L is de lengte en Sstijf is de afbuig gevoeligheid gemeten op de stijve Substraat. Δl is de offset tussen de punt en het uiteinde van de referentie-Cantilever en is afhankelijk van de uitlijning die door de gebruiker wordt uitgevoerd en ten slotte is α de kantelhoek van de Cantilever, gespecificeerd door de AFM-fabrikant. Dezelfde methode kan worden gebruikt op elastische constructies speciaal ontworpen voor Cantilever of indenteerder kalibratie. Het voordeel van die structuren (die over het algemeen circulair zijn) is dat K in hun centrum constant is en niet afhankelijk is van een meetkundige parameter of van de precieze positionering van de AFM tip op hen, dus het verwijderen van l en Δl uit de vorige formule.
De AFM-gebruiker moet in gedachten houden dat al die kalibratie methoden worden beïnvloed door verschillende foutbronnen (afbuig gevoeligheids bepaling in eerste en derde, het gebruik van thermische melodie in het geval van stijve cantihefbomen voor de eerste en tweede en geometrische parameters en uitlijning voor de derde en kalibratie nauwkeurigheid van KRef in het geval referentie-Cantilever wordt gebruikt) en dat de contactmethoden potentieel schadelijk zijn voor de tip (vooral de derde, waarbij kalibratie het gebruik van twee verschillende monsters). Dit impliceert dat de veerconstante altijd tot een bepaalde precisie zal worden bepaald en dus de gemeten/toegepaste krachten zullen zijn (Zie Sikora19 voor een uitgebreid overzicht van verschillende kalibratie methoden en hun precisie. Dit betekent dat de moduli en turgor drukken van Young ook zullen worden beïnvloed door de kalibratie van de Cantilever. Hoe dan ook, andere nog belangrijke foutbronnen zijn betrokken bij de berekening van die hoeveelheden (zoals het gebruik van vereenvoudigde modellen voor de bepaling van jonge modulus), dus het zal altijd een uitdaging zijn om absolute waarden te verkrijgen uit dit soort metingen. Belangrijk is het verkrijgen van waarden die van de juiste orde van grootte en die coherent met elkaar zijn, wat betekent dat als het experiment wordt herhaald door dezelfde gebruiker op hetzelfde voorbeeld, de waarden moeten compatibel zijn. Om het te verkrijgen, moet de kalibratie zorgvuldig worden uitgevoerd en moeten foutbronnen worden geminimaliseerd (bijvoorbeeld door zoveel mogelijk akoestische ruis/trillingen te beperken). Een mogelijke strategie die gericht is op het vergroten van de samenhang van herhaalde kalibraties is onlangs voorgesteld in een document van Schillers et al.20, waar dankzij de samenwerking van 11 Europese Labs, een protocol (genaamd snap) om fouten te compenseren in Er is een afbuig gevoeligheids bepaling ontwikkeld. In dit document gebruiken de auteurs direct gekalibreerde cantihefbomen voor hun metingen, hoe dan ook kan hetzelfde protocol worden toegepast op niet-gekalibreerde cantihefbomen, gewoon kalibreren ze de eerste keer met de methode van keuze en dan rekening houdend met de eerste lente constante als de referentiewaarde ("gekalibreerd").
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We willen het PLATIM team bedanken voor hun technische ondersteuning, evenals Arezki Boudaoud en leden van het Biophysic team in het RDP Lab voor nuttige discussies.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Growth medium | |||
| 1,000x vimatin stock solution | used to make ACM, composition see Stanislas et al., 2017. Add to ACM after autoclaving, before pouring. | ||
| 1-N-Naphthylphthalamic acid (NPA) | Sigma-Aldrich/Merck | 132-66-1 | add to Arabidopsis medium, 10 μM. Add after autoclaving, before pouring. |
| Agar-agar | Sigma-Aldrich/Merck | 9002-18-0 | add to Arabidopsis medium, 1% w/v. |
| Agarose | Merck Millipore | 9012-36-6 | used to make solid ACM, 0.8% w/v. |
| Arabidopsis medium | Duchefa Biochimie | DU0742.0025 | For in vitro arabidopsis culture, 11.82g/L. |
| Calcium nitrate tetrahydrate | Sigma-Aldrich/Merck | 13477-34-4 | add to Arabidopsis medium, 2 mM. |
| MURASHIGE & SKOOG MEDIUM | Duchefa Biochimie | M0221.0025 | Basal salt mixture, used to make ACM, 2.2 g/ L. |
| N6-benzyladenine (BAP) | Sigma-Aldrich/Merck | 1214-39-7 | used to make ACM, 555 nM. Add to ACM after autoclaving, before pouring. |
| Oryzalin | Sigma-Aldrich/Merck | 19044-88-3 | for oryzalin treatement, 10 μg/mL. |
| Plant preservation mixture (PPM) | Plant Cell Technology | used to make ACM, 0.1% v/v. Add to ACM after autoclaving, before pouring. | |
| Potassium hydroxide | Duchefa Biochimie | 1310-58-3 | used to make Arabidopsis medium and ACM, both pH 5.8. |
| Sucrose | Duchefa Biochimie | 57-50-1 | used to make ACM, 1% w/v. |
| Tools for AFM | |||
| BioScope Catalyst BioAFM | Bruker | The AFM used for turgor pressure measurement in this protocol. | |
| Nanowizard III + CellHesion | JPK (Bruker) | The AFM used for measuring mechanical properties. | |
| Patafix | UHU | D1620 | |
| Reference elasitic structure | NanoIdea | 2Z00026 | |
| Reprorubber-Thin Pour | Flexbar | 16135 | biocompatible glue. |
| Spherical AFM tips | Nanoandmore | SD-SPHERE-NCH-S-10 | Tips used for measuring mechanical properties. |
References
- Du, F., Guan, C., Jiao, Y.
- Cosgrove, D. J.
- Dumais, J. Can mechanics control pattern formation in plants? Current Opinion in Plant Biology. 10, 58-62 (2007).
- Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M.
- Routier-Kierzkowska, A. L., et al. Cellular force microscopy for in vivo measurements of plant tissue mechanics. Plant Physiology. 158 (4), 1514-1522 (2012).
- Corson, F., et al. Turning a plant tissue into a living cell froth through isotropic growth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 8453-8458 (2009).
- Hervieux, N., et al. A mechanical feedback restricts sepal growth and shape in Arabidopsis. Current Biology. 26, 1019-1028 (2016).
- Stanislas, T., Hamant, O., Traas, J. Chapter 11 - In-vivo analysis of morphogenesis in plants. Methods in Cell. Lecuit, T. 139, Academic Press. 203-223 (2017).
- Beauzamy, L., Derr, J., Boudaoud, A. Quantifying hydrostatic pressure in plant cells using indentation with an atomic force microscope. Biophysical Journal. 108 (10), 2448-2456 (2015).
- Costa, K. D., Sim, A. J., Yin, F. C. P. Non-Hertzian Approach to Analyzing Mechanical Properties of Endothelial Cells Probed by Atomic Force Microscopy. Journal of Biomechanical Engineering. 128 (2), 176-184 (2006).
- Beauzamy, L., Louveaux, M., Hamant, O., Boudaoud, A. Mechanically, the shoot apical meristem of Arabidopsis behaves like a shell inflated by a pressure of about 1MPa. Frontiers in Plant science. 6 (1038), 1-10 (2015).
- Majda, M., et al. Mechanochemical polarization of contiguous cell walls shapes plant pavement cells. Developmental Cell. 43 (3), 290-304 (2017).
- Torode, T. A., et al. Branched pectic galactan in phloem-sieve-element cell walls: implications for cell mechanics. Plant Physiology. 176, 1547-1558 (2018).
- Farahi, R. H., et al. Plasticity, elasticity, and adhesion energy of plant cell walls: nanometrology of lignin loss using atomic force microscopy. Scientific Reports. 7, 152 (2017).
- Peaucelle, A., et al. Pectin-induced changes in cell wall mechanics underlie organ initiation in Arabidopsis. Current Biology. 21, 1720-1726 (2011).
- Cosgrove, D. J. Diffuse growth of plant cell walls. Plant Physiology. 176, 16-27 (2018).
- Sader, J. E., Larson, I., Mulvaney, P., White, L. R. Method for the calibration of atomic force microscope cantilevers. Review of Scientific Instruments. 66 (7), 3789-3798 (1995).
- Sader, J. E., Chon, J. W. M., Mulvaney, P. Calibration of rectangular atomic force microscope cantilevers. Review of Scientific Instruments. 70 (10), 3967-3969 (1999).
- Sikora, A. Quantitative Normal Force Measurements by Means of Atomic Force Microscopy Towards the Accurate and Easy Spring Constant Determination. Nanoscience and Nanometrology. 2 (1), 8-29 (2016).
- Schillers, H., et al. Standardized Nanomechanical Atomic Force Microscopy Procedure (SNAP) for Measuring Soft and Biological Samples. Scientific Reports. 7 (1), (2017).
