Micromanipolazione delle cellule tumorali circolanti per l'analisi molecolare a valle e la valutazione del potenziale metastatico
Summary
Qui, presentiamo un flusso di lavoro integrato per identificare le caratteristiche fenotipiche e molecolari che caratterizzano le cellule tumorali circolanti (CTC). Combiniamo l’immunocolorazione dal vivo e la micromanipolazione robotica di CTC singoli e cluster con tecniche a singola cellula per l’analisi a valle e la valutazione dell’abilità di metastasi-semina.
Abstract
La metastasi ematica rappresenta la maggior parte dei decessi correlati al cancro e coinvolge le cellule tumorali circolanti (CTC) che hanno successo nella creazione di nuovi tumori in siti lontani. I CTC si trovano nel flusso sanguigno dei pazienti come cellule singole (CTC singole) o come aggregati multicellulari (cluster CTC e cluster di globuli bianchi CTC), con questi ultimi che mostrano una maggiore capacità metastatica. Oltre all’enumerazione, l’analisi fenotipica e molecolare è straordinariamente importante per dissezionare la biologia CTC e per identificare le vulnerabilità perseguibili. Qui, forniamo una descrizione dettagliata di un flusso di lavoro che include l’immunocolorazione CTC e la micromanipolazione, la cultura ex vivo per valutare le capacità proliferativa e di sopravvivenza delle singole cellule e i saggi in vivo di formazione di metastasi. Inoltre, forniamo un protocollo per raggiungere la dissociazione dei cluster CTC in singole celle e l’analisi dell’eterogeneità intra-cluster. Con questi approcci, per esempio, quantifichiamo con precisione la sopravvivenza e il potenziale proliferativo dei singoli CTC e delle singole cellule all’interno dei cluster CTC, che ci portano all’osservazione che le cellule all’interno dei cluster mostrano una migliore sopravvivenza e proliferazione in ex rispetto ai singoli CTC. nel complesso, il nostro flusso di lavoro offre una piattaforma per dissezionare le caratteristiche dei CTC a livello di singola cellula, puntando all’identificazione di percorsi rilevanti per la metastasi e a una migliore comprensione della biologia CTC.
Introduction
La manifestazione clinica della metastasi negli organi distanti rappresenta la fase finale della progressione del cancro e costituisce oltre il 90% dei decessi correlati al cancro1. La transizione dalla malattia localizzata a quella metastatica è un processo a più fasi, spesso mediato da cellule tumorali circolanti (CTCs)2,3,4. Queste cellule sono sparate dal tumore primario nella circolazione sanguigna e vengono trasportate in organi distanti, dove possono stravasare e stabilire lesioni metastatiche5,6. Anche se i tumori solidi possono rilasciare un numero relativamente elevato di CTC, la maggior parte dei CTC sono destinate a morire, a causa di forze di taglio elevate in circolazione, morte cellulare mediata da anoikis, attacco immunitario o capacità limitate di adattarsi a un microambiente straniero7. Pertanto, è fondamentale stabilire strumenti che consentano la dissezione delle caratteristiche molecolari di quei CTC che sono dotati di capacità di semina metastasi. Recenti studi preclinici e clinici suggeriscono che la presenza e la quantità di singoli cluster CTCs e CTC è associata a un risultato peggiore in pazienti con vari tipi di tumori solidi8,9,10 , 11 il , 12 anni di , 13 anni di , 14 anni di . I cluster CTC sono gruppi di due o più ctc collegati tra loro durante la circolazione e sono più efficienti nella formazione delle metastasi rispetto ai singoli CTCs3,15,16. Le cellule all’interno di un cluster mantengono una forte adesione delle cellule cellulari attraverso i desmosomi e gli incroci aderenti, che possono aiutare a superare gli anoikis17,18. Recentemente, abbiamo osservato che il clustering dei CTC è legato all’ipometilazione dei siti di legame per i fattori di trascrizione associati a stemosi e proliferazione, portando ad una maggiore capacità di avviare con successo la metastasi19. La dissociazione del cluster CTC provoca il rimodellamento dei siti di legame chiave e, di conseguenza, la soppressione del loro potenziale metastatico19. Inoltre ai gruppi di cellule tumorali, i CTC possono anche associarsi al globulo bianco (più frequentemente neutrofili) per mantenere alti livelli di proliferazione in circolazione e aumentare la loro capacità metastatica20. Tuttavia, la biologia dei CTC è intesa solo in parte e restano aperte diverse domande, tra cui le caratteristiche molecolari sottostanti e le vulnerabilità delle cellule singole e del cluster.
Negli ultimi anni, sono state stabilite diverse strategie che sfruttano i modelli di espressione della superficie cellulare e le proprietà fisiche dei CTC per il loro isolamento21,22,23,24, 25. i metodi di isolamento dipendenti dall’antigene dipendono principalmente dall’espressione della superficie cellulare molecola di adesione delle cellule epiteliali (EpCAM)26. L’unica piattaforma approvata dalla FDA per l’enumerazione CTC, la più frequentemente utilizzata e (attualmente), è il sistema CellSearch, che si basa su una procedura in due fasi per isolare i CTCs21. Nella prima fase, i componenti del plasma vengono rimossi mediante centrifugazione, mentre i CTC vengono catturati con ferrofluidi magnetici accoppiati agli anticorpi anti-EpCAM. Nella seconda fase, la soluzione arricchita con CTC è macchiata per le cellule nucleate (DAPI-positive) che esprimono la citocheratina (CK)8,18,19, mentre i globuli bianchi (WBCs) sono identificati utilizzando il marcatore Pan-leucocitario CD45. Infine, le cellule catturate vengono posizionate su una piattaforma di screening integrata e i CTC sono identificati attraverso l’espressione di EpCAM, CKs e DAPI, pur essendo negativi per CD45. Anche se questo è considerato il gold standard per l’enumerazione CTC, analisi molecolare a valle è impegnativo con questa tecnologia a causa di vincoli intrinseci nel recupero CTC. Inoltre, data la sua procedura di isolamento, CellSearch può favorire l’arricchimento dei CTC con livelli di EpCAM superiori rispetto ai CTC con un’espressione EpCAM più bassa, dovuta ad esempio all’eterogeneità del cancro27 o alla downregulation dei marcatori epiteliali 28,29. Per superare queste limitazioni, sono emerse tecnologie indipendenti dall’antigene per l’arricchimento dei CTC. Ad esempio, CTC-iChip integra la separazione idrodinamica delle cellule nucleate, compresi i CTC e i WBC dai restanti componenti del sangue, seguita da un esaurimento immunomagnetico dei WBC con tag anticorpali, che consente la purificazione di CTC senza tag e vitali in soluzione25. Inoltre, il fatto che la maggior parte dei CTC sono leggermente più grandi dei globuli rossi (RBC) o dei WBC ha portato allo sviluppo di tecnologie di arricchimento CTC basate sulle dimensioni23,30 (ad esempio, il sistema parsortix (Angle)) che fa uso di un tecnologia basata su microfluidica, comprendente un canale di restringimento attraverso la cassetta di separazione, portando le cellule a un gap terminale di 10, 8, 6,5 o 4,5 μm (sono disponibili diverse dimensioni a seconda del diametro atteso delle cellule tumorali bersaglio). La maggior parte delle cellule del sangue passano attraverso lo stretto divario, mentre i CTC vengono intrappolati a causa delle loro dimensioni (ma anche a causa della loro deformabilità inferiore) e sono, pertanto, conservati nella cassetta. Il ripristino della direzione del flusso consente il rilascio di CTC catturati, che sono in uno stato vitale e adatti per l’analisi a valle. Indipendentemente dal protocollo scelto per l’isolamento CTC, tuttavia, le procedure tipiche di post-arricchimento continuano a produrre CTC che vengono miscelate con un numero relativamente ridotto di globuli rossi e globuli bianchi, rendendo difficile l’analisi di CTCs puri singoli o sfusi. Per risolvere questo problema, abbiamo stabilito un flusso di lavoro che consente la manipolazione CTC senza potenziali pregiudizi introdotti dai contaminanti delle cellule del sangue. L’aggiunta di immunocolorazione in anticipo, con combinazioni di anticorpi variabili, distingue i CTC dalle cellule del sangue e permette anche di identificare sottogruppi CTC con profili di espressione di superficie-marcatore distinti. Questa procedura altamente personalizzabile può essere ulteriormente combinata con applicazioni downstream specifiche.
Qui, descriviamo un flusso di lavoro che parte da un prodotto arricchito con CTC (ottenuto con qualsiasi tecnologia di arricchimento CTC di scelta) e combina diversi approcci per ottenere informazioni sulla biologia CTC alla risoluzione di una singola cellula. In poche parole, il nostro flusso di lavoro consente l’identificazione di singoli CTC, cluster CTC e cluster CTC-WBC mediante immunostaining dal vivo, seguita da micromanipolazione a singola cellula e analisi a valle utilizzando protocolli di coltura ex vivo , cellule singole sequenziamento e analisi in vivo delle metastasi.
Protocol
Representative Results
Discussion
La caratterizzazione molecolare dei CTC contiene la promessa di migliorare la nostra comprensione del processo metastatico e di guidare lo sviluppo di nuove terapie anti-metastasi. Qui forniamo una descrizione dettagliata di quei protocolli che consentono la micromanipolazione CTC e l’analisi a valle, compresi i saggi funzionali basati su singola cellula, l’analisi dell’espressione genica e il trapianto in vivo per il potenziale metastatico valutazione20.
Tra l…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo tutti i pazienti che hanno donato il sangue per il nostro studio, così come tutti i medici coinvolti e gli infermieri di studio. Ringraziamo Jens Eberhardt, Uwe Birke e Dr. Katharina Uhlig di ALS Automated Lab Solutions GmbH per il supporto continuo. Ringraziamo tutti i membri del laboratorio aceto per il feedback e le discussioni. La ricerca nel laboratorio di aceto è sostenuta dal Consiglio europeo della ricerca, dall’Unione europea, dalla Fondazione Nazionale Svizzera per la scienza, dalla Lega Svizzera per il cancro, dalla lega di cancro di Basilea, dai due Cantoni di Basilea attraverso il Politecnico federale di Zurigo e dall’Università di Basilea.
Materials
| Anti-human EpCAM-AF488 | Cell Signaling Technology | CST5198 | clone: VU1D9 |
| 1X DPBS | Invitrogen | 14190169 | no calcium, no magnisium |
| 6-wells Ultra-low attachment plate | Corning | 3471 | |
| Anti-human CD45-BV605 | Biolegend | 304041 | clone: HI30 |
| Anti-human EGFR-FITC | GeneTex | GTX11400 | clone: ICR10 |
| Anti-human HER2-AF488 | Biolegend | 324410 | clone: 24D2 |
| Anti-mouse CD45-BV605 | Biolegend | 103139 | clone: 30-F11 |
| BD Vacutainer K2EDTA | BD | 366643 | for human blood collection |
| Cell Celector | ALS | CC1001 | core unit |
| CellD software | ALS | version 3.0 | |
| Cultrex PathClear Reduced Growth Factor BME, Type 2 | R&D Systems | 3533-005-02 | |
| Micro tube 1.3 mL K3EDTA | Sarstedt | 41.3395.005 | for mouse blood collection |
| PCR tubes | Corning | PCR-02-L-C | |
| RLT Plus | Quiagen | 1053393 | |
| SUPERase In RNase Inhibitor | Thermo Fisher | AM2696 | 1 U/µL |
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