Micromanipulation de cellules tumorales circulantes pour l’analyse moléculaire en aval et l’évaluation du potentiel métastatique
Summary
Ici, nous présentons un workflow intégré pour identifier les caractéristiques phénotypiques et moléculaires qui caractérisent les cellules tumorales circulantes (CTCs). Nous combinons l’immunocoloration en direct et la micromanipulation robotisée de CTCS simples et groupés avec des techniques à cellules uniques pour l’analyse en aval et l’évaluation de la capacité d’ensemencement des métastases.
Abstract
Les métastases transmises par le sang représentent la plupart des décès liés au cancer et impliquent des cellules tumorales circulantes (CTCs) qui réussissent à établir de nouvelles tumeurs dans des sites éloignés. Les CTCs se retrouvent dans la circulation sanguine des patients en tant que cellules individuelles (CTCs uniques) ou en agrégats multicellulaires (grappes de CTC et grappes de globules blancs CTC), ce dernier affichant une capacité métastatique plus élevée. Au-delà de l’énumération, l’analyse phénotypique et moléculaire est extraordinairement importante pour disséquer la biologie de la CCT et identifier les vulnérabilités exploitables. Ici, nous fournissons une description détaillée d’un workflow qui inclut l’immunocoloration et la micromanipulation de CTC, la culture ex vivo pour évaluer les capacités prolifératives et de survie des cellules individuelles, et les essais in vivo de formation de métastase. En outre, nous fournissons un protocole pour réaliser la dissociation des grappes de CTC dans les cellules individuelles et l’étude de l’hétérogénéité intra-grappe. Avec ces approches, par exemple, Nous quantifions précisément la survie et le potentiel prolifératif des CTCs uniques et des cellules individuelles dans les grappes de CTC, nous conduisant à l’observation que les cellules dans les grappes affichent une meilleure survie et prolifération dans les ex par rapport aux CTCS uniques. dans l’ensemble, notre flux de travail offre une plate-forme pour disséquer les caractéristiques des CTCS au niveau de la cellule unique, visant à identifier les voies pertinentes des métastases et à mieux comprendre la biologie de la CCT.
Introduction
La manifestation clinique des métastases dans les organes éloignés représente l’étape finale de la progression du cancer et compte pour plus de 90% des décès liés au cancer1. La transition de la maladie localisée à la métastatique est un processus à étapes multiples, souvent médiatisé par les cellules tumorales circulantes (CTCS)2,3,4. Ces cellules sont excréées de la tumeur primaire dans la circulation sanguine et sont transportées vers des organes éloignés, où elles peuvent extravasate et établir des lésions métastatiques5,6. Bien que les tumeurs solides puissent libérer un nombre relativement élevé de CTCs, la plupart des CTCs sont destinés à mourir, en raison de forces de cisaillement élevées en circulation, de la mort cellulaire induite par anoikis, d’une attaque immunitaire ou de capacités limitées pour s’adapter à un microenvironnement étranger7. Par conséquent, il est essentiel d’établir des outils qui permettent la dissection des caractéristiques moléculaires des CTCs qui sont dotés d’une capacité d’ensemencement des métastases. Des études précliniques et cliniques récentes suggèrent que la présence et la quantité de CTCS et de grappes de CTC uniques sont associées à un résultat pire chez les patients présentant divers types de tumeurs solides8,9,10 , le 11 , le 12 , le 13 , le 14 . Les grappes de CTC sont des groupes de deux ou plusieurs CTCS attachés les uns aux autres pendant la circulation et sont plus efficaces pour former des métastases comparativement aux CTCS simples3,15,16. Les cellules d’un cluster maintiennent une forte adhérence des cellules cellulaires par les desmosomes et les jonctions adhérentes, ce qui peut aider à surmonter anoikis17,18. Récemment, nous avons observé que le regroupement des CTCs est lié à l’hypométhylation des sites de liaison pour les facteurs de transcription associés à la prolifération et à la tige, conduisant à une capacité accrue à initier avec succès la métastase19. La dissociation du cluster CTC aboutit à la retouche de sites de liaison clés et, par conséquent, à la suppression de leur potentiel métastatique19. En plus des grappes de cellules cancéreuses, les CTCs peuvent également s’associer aux globules blancs (le plus souvent des neutrophiles) pour maintenir des niveaux élevés de prolifération en circulation et augmenter leur capacité métastatique20. Cependant, la biologie des CTCs n’est comprise que partiellement et plusieurs questions demeurent ouvertes, y compris les caractéristiques moléculaires sous-jacentes et les vulnérabilités des cellules individuelles et en grappes.
Au cours des dernières années, plusieurs stratégies ont été établies qui exploitent les modèles d’expression de surface cellulaire ainsi que les propriétés physiques des CTCS pour leur isolement21,22,23,24, 25. les méthodes d’isolement dépendantes de l’antigène reposent principalement sur l’expression de la molécule d’adhérence des cellules épithéliales de la cellule (EpCAM)26. Le plus fréquemment utilisé et (à l’heure actuelle) la seule plate-forme approuvée par la FDA pour l’énumération CTC, est le système CellSearch, qui est basé sur une procédure en deux étapes pour isoler CTCs21. Dans la première étape, les composants plasmatiques sont éliminés par centrifugation, tandis que les CTCs sont capturés avec des ferrofluides magnétiques couplés à des anticorps anti-EpCAM. Dans la deuxième étape, la solution enrichie en CTC est colorée pour les cellules nucléées (DAPI-positives) exprimant la cytokératine (CK)8,18,19, tandis que les globules blancs (WBCs) sont identifiés à l’aide de la marqueur Pan-leukocyte CD45. Enfin, les cellules capturées sont placées sur une plate-forme de filtrage intégrée et les CTCs sont identifiés par l’expression d’EpCAM, de CKs et de DAPI tout en étant négatifs pour CD45. Bien que ce soit considéré comme la norme d’or pour l’énumération CTC, l’analyse moléculaire en aval est difficile avec cette technologie en raison des contraintes inhérentes à la récupération de CTC. En outre, compte tenu de sa procédure d’isolement, CellSearch peut favoriser l’enrichissement des CTCs avec des niveaux plus élevés d’EpCAM par rapport aux CTCs avec une expression EpCAM inférieure, due par exemple à l’hétérogénéité du cancer27 ou à la rétrorégulation des marqueurs épithéliaux 28,29. Pour surmonter ces limitations, des technologies indépendantes de l’antigène pour l’enrichissement des CTCs ont émergé. Par exemple, la CTC-iChip intègre la séparation hydrodynamique des cellules nucléées, y compris les CTCs et les globules blancs des composants sanguins restants, suivie d’une déplétion immunomagnétique des globules blancs marqués par des anticorps, permettant la purification de CTCs non marqués et viables dans la solution25. En outre, le fait que la plupart des CTCS soient légèrement plus grands que les globules rouges (RBC) ou les CSSC a entraîné le développement de technologies d’enrichissement de la CCT basées sur la taille23,30 (p. ex., le système parsortix (angle)) qui utilise un technologie à base de microfluidique, comprenant un canal rétrécissant à travers la cassette de séparation, conduisant les cellules à un écart terminal de 10, 8, 6,5 ou 4,5 μm (différentes tailles sont disponibles en fonction du diamètre attendu des cellules cancéreuses cibles). La plupart des cellules sanguines traversent l’écart étroit, tandis que les CTCs sont piégés en raison de leur taille (mais aussi en raison de leur déformabilité inférieure) et sont donc conservés dans la cassette. Le rétablissement de la direction du flux permet la libération de CTCs capturés, qui sont dans un État viable et appropriés pour l’analyse en aval. Toutefois, indépendamment du protocole choisi pour l’isolement de la CCT, les procédures de post-enrichissement typiques donnent encore des CTCs mélangés à un nombre relativement restreint de globules rouges et de globules blancs, ce qui rend difficile l’analyse des CTCs purs ou en vrac. Pour résoudre ce problème, nous avons établi un workflow qui permet la manipulation CTC sans biais potentiel introduit par les contaminants des cellules sanguines. L’addition d’immunocoloration à l’avance, avec des combinaisons d’anticorps variables, distingue les CTCS des cellules sanguines et permet même d’identifier les sous-groupes de CTC avec des profils d’expression de marqueurs de surface distincts. Cette procédure hautement personnalisable peut ensuite être combinée avec des applications en aval spécifiques.
Ici, nous décrivons un workflow qui commence à partir d’un produit enrichi de CTC (obtenu avec n’importe quelle technologie d’enrichissement de CTC de choix) et combine plusieurs approches pour obtenir un aperçu de la biologie de CTC à la résolution d’une seule cellule. En un mot, notre workflow permet d’identifier des CTCs uniques, des grappes CTC et des grappes CTC-WBC par immunostaining en direct, suivie d’une micromanipulation à une seule cellule et d’une analyse en aval à l’aide de protocoles de culturation ex vivo , d’une seule cellule tests de métastase in vivo .
Protocol
Representative Results
Discussion
La caractérisation moléculaire des CTCs tient la promesse d’améliorer notre compréhension du processus métastatique et de guider le développement de nouvelles thérapies anti-métastases. Ici, nous fournissons une description détaillée de ces protocoles qui permettent la micromanipulation de CTC et l’analyse en aval, y compris les essais fonctionnels à base de cellules uniques, l’analyse d’expression génique et la transplantation in vivo pour le potentiel métastatique l’évaluation<sup class…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions tous les patients qui ont donné du sang pour notre étude, ainsi que tous les cliniciens impliqués et les infirmières d’étude. Nous remercions Jens Eberhardt, Uwe Birke et Dr. Katharina Uhlig de la SLA Automated Lab Solutions GmbH pour leur soutien continu. Nous remercions tous les membres du laboratoire Aceto pour leurs commentaires et discussions. La recherche dans le laboratoire Aceto est soutenue par le Conseil européen de la recherche, l’Union européenne, la Fondation nationale suisse des sciences, la Ligue suisse contre le cancer, la Ligue du cancer de Bâle, les deux cantons de Bâle par l’ETH Zürich et l’Université de Bâle.
Materials
| Anti-human EpCAM-AF488 | Cell Signaling Technology | CST5198 | clone: VU1D9 |
| 1X DPBS | Invitrogen | 14190169 | no calcium, no magnisium |
| 6-wells Ultra-low attachment plate | Corning | 3471 | |
| Anti-human CD45-BV605 | Biolegend | 304041 | clone: HI30 |
| Anti-human EGFR-FITC | GeneTex | GTX11400 | clone: ICR10 |
| Anti-human HER2-AF488 | Biolegend | 324410 | clone: 24D2 |
| Anti-mouse CD45-BV605 | Biolegend | 103139 | clone: 30-F11 |
| BD Vacutainer K2EDTA | BD | 366643 | for human blood collection |
| Cell Celector | ALS | CC1001 | core unit |
| CellD software | ALS | version 3.0 | |
| Cultrex PathClear Reduced Growth Factor BME, Type 2 | R&D Systems | 3533-005-02 | |
| Micro tube 1.3 mL K3EDTA | Sarstedt | 41.3395.005 | for mouse blood collection |
| PCR tubes | Corning | PCR-02-L-C | |
| RLT Plus | Quiagen | 1053393 | |
| SUPERase In RNase Inhibitor | Thermo Fisher | AM2696 | 1 U/µL |
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