إعداد المقطعين الماهيينيات في شبكية العين للكيمياء المناعية
Summary
يصف هذا التقرير الطرق الشاملة لإعداد أقسام شبكية العين المجمدة للكيمياء المناعية (IHC). وتشمل الأساليب الموصوفة تشريح كوب العين الخلفي، تثبيت البارافورمالديهايد، وتضمينها في درجة الحرارة القطع الأمثل (OCT) وسائل الإعلام واتجاه الأنسجة، وتقسيم ومناعة.
Abstract
يعد إعداد أقسام عين الفأر عالية الجودة للكيمياء المناعية (IHC) أمرًا بالغ الأهمية لتقييم بنية شبكية العين ووظيفتها وتحديد الآليات الكامنة وراء أمراض الشبكية. الحفاظ على السلامة الهيكلية في جميع أنحاء إعداد الأنسجة أمر حيوي للحصول على بيانات IHC الشبكية القابلة للاستنساخ ولكن يمكن أن يكون تحديا بسبب هشاشة وتعقيد الهندسة الشبكية السيتوالية. المثبتات قوية مثل 10% formalin أو محلول Bouin الحفاظ على الأمثل بنية الشبكية, أنها غالباً ما تعوق تحليل IHC عن طريق تعزيز الفلورسنت الخلفية و / أو تقليل التفاعلات الأجسام المضادة-epitope, عملية تعرف باسم تجسيد اخفاء. المثبتات أكثر اعتدالا، من ناحية أخرى، مثل 4٪ بارافورمالديهايد، ويقلل من الفلورسنت الخلفية ومثال اخفاء، يجب استخدام تقنيات التشريح الدقيق للحفاظ على بنية الشبكية. في هذه المقالة، نقدم طريقة شاملة لإعداد أكواب خلفية العين الماوس لIHC التي هي كافية للحفاظ على معظم التفاعلات الأجسام المضادة-الشبه دون فقدان السلامة الهيكلية الشبكية. نحن تشمل IHC تمثيلية مع الأجسام المضادة لمختلف علامات نوع الخلية الشبكية لتوضيح الحفاظ على الأنسجة والتوجه في ظل الظروف المثلى ودون الأمثل. هدفنا هو تحسين الدراسات IHC من شبكية العين من خلال توفير بروتوكول كامل من تشريح الكأس الخلفي العين يالأيه.
Introduction
الكيمياء المناعية (IHC) هي تقنية قوية لتوطين بروتينات محددة والهياكل الخلوية في الأنسجة في الموقع1،2،3. طرق التثبيت غير المناسبة وتقسيم دون الأمثل من الأنسجة المعقدة يمكن أن تعطل بنية الأنسجة، وتوليد تلطيخ الخلفية العالية أو يقلل من التفاعلات الأجسام المضادة- الشبه، مما يؤدي إلى تلطيخ القطع الأثرية وما يترتب على ذلك من سوء تفسير بيانات IHC4. كما شبكية العين الفقارية هو جهاز عصبي معقد ومنظم للغاية تتألف من طبقات من مستقبلات ضوئية مترابطة، interneurons والخلايا العقدية، فهي هشة جدا ويمكن أن تتعطل بسهولة أثناء التشريح والقسم. وهناك بروتوكول مفصل وموحد ومصدق عليه من تشريح العين الماوس والتوجه إلى المناعية سوف تساعد على الحد بشكل كبير من التحف IHC، وبالتالي، زيادة موثوقية النتائج والسماح لبيانات مقارنة أكثر دقة تحليل.
هناك العديد من البروتوكولات لإعداد الأنسجة لIHC، ومع ذلك، ليست كلها مناسبة للأنسجة الشبكية. المثبتات قوية مثل 10٪ الرسمية أو محلول Bouin للحفاظ على بنية الشبكية خلال تشريح وتقسيم5. لسوء الحظ، المثبتات قوية غالبا ما يؤدي إلى الفلورسنت الخلفية المحسنة وتجسد اخفاء بسبب التعديل الكيميائي لepitopes6. من ناحية أخرى، يمكن للمثبتات الأكثر اعتدالا، مثل 4% بارافورمالديهايد (PFA) تخفيف بعض هذه القطع الأثرية ولكن تتطلب تشريح دقيق وتقسيم للحفاظ على بنية شبكية العين الأمثل. PFA يخترق الأنسجة بسرعة، ولكن عبر الروابط البروتينات ببطء شديد، والحد من خطر اخفاء مثال. منذ وقت قصير PFA الحضانة هو تثبيت معتدل نسبيا، والأنسجة غالبا ما تتطلب تجميد سريع للحفاظ على المستضدات. من المهم تجنب تشكيل الكريستال الجليدي أثناء تجميد الأنسجة لأنها تشوه وتضر بسلامة الخلايا والأنسجة7.
هنا نحن نوصف بروتوكولات مفصلة وموحدة للتشريح، والتثبيت، والحماية من البرد من الكؤوس الخلفية العين الماوس التي تسفر عن بيانات IHC متسقة وموثوق بها.
Protocol
Representative Results
Discussion
إن ّ تَتَحَيَمُل شبكية العين بالفأرة عملية دقيقة بسبب صغر حجم وشكل عيون الفأر وهشاشة نسيج الشبكية. على الرغم من أن إجراء تشريح عالي الجودة هو مسألة ممارسة، وجود بروتوكول مفصل، وتوفير طرق فعالة ونصائح هو ضرورة للحصول على أقسام الشبكية وIHC. بالإضافة إلى البروتوكولات الموصوفة هنا، هناك العد?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم هذا العمل من خلال أموال من المعاهد القومية للصحة (RO1-GMO97327) ومؤسسة البحوث الجامعية (UPenn). نشكر سفيتلانا سافينا بشكل خاص على مساعدتها في تطوير بروتوكول الكيمياء المناعية، وغوردون روثل (جامعة بنسلفانيا) وجامعة بن فيت للتصوير الأساسي للمساعدة في الفحص المجهري وليزلي كينغ، دكتوراه للقراءة الحرجة لهذه المخطوطة .
Materials
| 6qt. Stainless Steel Beaker (185 x 218mm) | Gilson | #MA-48 | For liquid nitrogen (Figure 1E) |
| Aluminum foil | |||
| Cauterizer | Bovie | #AA01 | To mark eye orientation (Figure 1A) |
| Curved forceps, Dumont #5/45 tweezers, 45-degrees bent | Electron Microscopy Sciences | #72703-D | For mouse eye enucleation and maintenance (Figure 1A) |
| Curved scissors, Vannas Spring Scissors – 2.5mm Cutting Edge | Fine Science Tools | #15002-08 | To circumferentially cut the cornea (Figure 1B) |
| Dental wax-coated 35mm dissection dish | For eye cup dissection (Figure 1C) | ||
| Dissecting microscope | Leica, Houston, USA | MZ12.5 High-performance stereomicroscope | |
| Micro Knives – Plastic Handle | Fine Science Tools | #10315-12 | To make a small incision at the burn mark (Figure 1A) |
| Pink dental wax | Electron Microscopy Sciences | #72660 | For coating dissection dish |
| Slide Rack and Coverplate | Ted Pella | #36107 | For retinal IHC (Figure 1G) |
| Stainless Steel Beaker (89 x 114mm) | Gilson | #MA-40 | For isopentane bath (Figure 1E) |
| Styrofoam box | For insulated cooler | ||
| Thin forceps Dumont #5 | Fine Science Tools | #11254-20 | To remove the cornea and extract the lens (Figure 1B) |
| Tissue-Tek cryomold (10mm x 10mm x 5mm) | Electron Miscroscopy Sciences | #62534-10 | Mold for OCT embedding |
| Buffers and Reagents | Company | Catalog Number | Comments |
| Blocking solution | 2% Normal Horse Serum, 1.5% Cold Fish skin Gelatin (at 40-50% in H2O, cat #G7765), 5% bovine serum albumin (cat #AK1391-0100) in permeabilization buffer. | ||
| Gelvatol (anti-fading mounting media) | Under the fume hood, dissolve 0.337g DABCO (Sigma cat #D2522-25G) in 10mL Fluoromount G (Fisher cat #OB100-01). Adjust to pH 8-8.5 with 12N HCl (~ 5 drops). Store in amber drop bottle at 4°C (8). | ||
| Hoechst 33342 1000x Stock | Thermo Scientific | #62249 | 1 mg/ml in PBS (1000x). Aliquot and store in dark, at 4°C for up to 1 year or at -20°C for long term storage. Prepare fresh at 1 ug/mL (1x) |
| Isopentane, 99% | GFS Chemicals | #2961 | |
| Liquid Nitrogen | |||
| Paraformaldehyde (PFA) in PBS | Electron Microscopy Sciences | #15710 | Prepared fresh 4% PFA from 16% PFA stock. Store the remaining 16% PFA at 4°C in the dark. |
| Permeabilization solution | PBS + 0.25% Triton-X (AMRESCO cat #0694-1L) + 0.05% NaN3. Prepare fresh. | ||
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Bioworld | #41620015-20 | 0.02 g/L KCl, 0.02 g/L KH2PO4, 0.8 g/L NaCl, 0.216 g/L Na2HPO4 , pH 7.4. Prepared from 10x stock |
| Sucrose solutions | Fisher Scientific | #S-5-500 | Dissolve the appropriate amount of sucrose in 37°C PBS (takes ~15 min to dissolve). May be stored for a few days at 4°C. |
| Tissue-Tek OCT-compound | Sakura | #4583 | |
| Antibodies | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-calbindin | Sigma-Aldrich | C8666 | To label horinzotal cells |
| anti-GAD65 | Chemicon | AB5082 | To label GABAergic amacrine cells |
| anti-GS | BD Transduction | 610517 | To label Müller cells |
| anti-rhodopsin | Millipore | MAB5316 | To label rods |
References
- Coons, A. H. Labelled antigens and antibodies. Annual Review of Microbiology. 8, 333-352 (1954).
- Coons, A. H. Fluorescent antibodies as histochemical tools. Federation Proceedings. 10 (2), 558-559 (1951).
- Coons, A. H., Kaplan, M. H. Localization of antigen in tissue cells; improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody. Journal of Experimental Medicine. 91 (1), 1-13 (1950).
- Chatterjee, S. Artefacts in histopathology. Journal of Oral Maxillofacial Pathology. 18 (Suppl 1), S111-S116 (2014).
- Hartz, P. H. Frozen sections from Bouin-fixed material in histopathology. Stain Technology. 20, 113 (1945).
- Benerini Gatta, L., et al. Application of alternative fixatives to formalin in diagnostic pathology. European Journal of Histochemistry. 56 (2), e12 (2012).
- Tokuyasu, K. T. Application of cryoultramicrotomy to immunocytochemistry. Journal of Microscopy. 143 (Pt 2), 139-149 (1986).
- Imai, H., et al. Molecular properties of rhodopsin and rod function. Journal of Biological Chemistry. 282 (9), 6677-6684 (2007).
- Lee, J. W., Lim, M. Y., Park, Y. S., Park, S. J., Kim, I. B. Reexamination of Dopaminergic Amacrine Cells in the Rabbit Retina: Confocal Analysis with Double- and Triple-labeling Immunohistochemistry. Experimental Neurobiology. 26 (6), 329-338 (2017).
- Bringmann, A., Grosche, A., Pannicke, T., Reichenbach, A. GABA and Glutamate Uptake and Metabolism in Retinal Glial (Muller) Cells. Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 4, 48 (2013).
- Nakhai, H., et al. Ptf1a is essential for the differentiation of GABAergic and glycinergic amacrine cells and horizontal cells in the mouse retina. Development. 134 (6), 1151-1160 (2007).
- Applebury, M. L., et al. The murine cone photoreceptor: a single cone type expresses both S and M opsins with retinal spatial patterning. Neuron. 27 (3), 513-523 (2000).
