Klargøring af muse retinale Cryo-sektioner til immun histokemi

Summary

Denne rapport beskriver omfattende metoder til at forberede frosne mus nethinden sektioner for Immunhistokemi (IHC). Beskrevne metoder omfatter dissektion af okulær posterior kop, PARAFORMALDEHYD fiksering, indlejring i optimal skæring temperatur (OCT) medier og vævs orientering, skæring og immun farvning.

Abstract

Forberedelse af høj kvalitet muse øje sektioner for Immunhistokemi (IHC) er afgørende for at vurdere den retinale struktur og funktion og til bestemmelse af de mekanismer, der underliggende retinale sygdomme. Opretholdelse af strukturel integritet i hele vævs præparatet er afgørende for at opnå reproducerbare retinale IHC-data, men kan være udfordrende på grund af den skrøbelige og komplekse nethinde cytoarkitektur. Stærke fiktioner som 10% formalin eller Bouin løsning optimalt bevare den retinale struktur, de ofte hæmmer IHC analyse ved at øge baggrunden fluorescens og/eller aftagende antistof-epitop interaktioner, en proces kendt som epitop maskering. Mildere fikser, på den anden side, som 4% PARAFORMALDEHYD, reducerer baggrunds fluorescens og epitope-maskering, omhyggelig dissektions teknikker skal udnyttes til at bevare den retinale struktur. I denne artikel præsenterer vi en omfattende metode til at forberede muse okulære posterior kopper til IHC, der er tilstrækkelig til at bevare de fleste antistof-epitope interaktioner uden tab af retinal strukturel integritet. Vi medtager repræsentative IHC med antistoffer mod forskellige retinale celletype markører for at illustrere vævs konservering og-orientering under optimale og suboptimale forhold. Vores mål er at optimere IHC undersøgelser af nethinden ved at give en komplet protokol fra okulær posterior kop dissektion til IHC.

Introduction

Immunohistochemistry (IHC) er en kraftfuld teknik til lokalisering af specifikke proteiner og cellulære strukturer i væv in situ^1,2,3. Uhensigtsmæssige fikserings metoder og sub-optimale sektionering af komplekst væv kan forstyrre vævs strukturen, generere høj baggrunds farvning eller mindske antistof-epitope interaktioner, hvilket resulterer i farvning artefakter og deraf følgende fejlfortolkning af IHC-data⁴. Som hvirveldyr nethinden er en kompleks og meget organiseret neurale organ bestående af lag af indbyrdes forbundne fotoceller, interneuroner og ganglion cells, det er meget skrøbelig og kan let afbrydes under dissektion og skæring. En detaljeret, standardiseret og valideret protokol fra muse øje dissektion og orientering til immun farvning vil bidrage til at reducere IHC artefakter, derved øge pålideligheden af resultaterne og giver mulighed for mere præcise sammenlignende data Analyse.

Der er mange protokoller for vævs forberedelse til IHC, men ikke alle er egnet til retinale væv. Stærke fixativer som 10% formalin eller Bouin opløsning bevare retinale struktur under dissektion og skæring⁵. Desværre fører stærke fiktioner ofte til den forbedrede baggrunds fluorescens og epitop maskering på grund af den kemiske modifikation af epitoper⁶. På den anden side, mildere fixatives, ligesom 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) kan lindre nogle af disse artefakter, men kræver omhyggelig dissektion og skæring for at bevare den optimale retinale struktur. PFA trænger hurtigt ind i vævet, men cross-links proteiner meget langsomt, hvilket reducerer risikoen for epitop maskering. Da kort tid PFA inkubation er en relativt mild fiksering, væv ofte kræver hurtig frysning for at bevare antigener. Det er vigtigt at undgå iskrystal dannelse under vævs frysning, da de forvrænger og skader integriteten af celler og væv⁷.

Her beskriver vi detaljerede og standardiserede protokoller for dissektion, fiksering, og Cryo-beskyttelse af mus okulære posterior kopper, der giver konsistente og pålidelige IHC data.

Protocol

Alle metoder, der er beskrevet her, blev udført i nøje overensstemmelse med anbefalingerne i National Institutes of Health guide for pleje og brug af forsøgsdyr fra Instituttet for Laboratoriedyrs ressourcer og blev godkendt af Institutionel dyrepleje og brug udvalg ved University of Pennsylvania. Alle værktøjer og udstyr til metoderne er vist i figur 1 og opført i tabellen over materialer. 1. Mus øje enucleation, …

Representative Results

For at illustrere, hvordan disse protokoller, sikre optimal retinal konservering for IHC, vi probed nethinde sektioner fra P28 WT mus (C57BL/6N) med antistoffer til rhodopsin (en fotocelle markør)8, glutaminsyre decarboxylase 65 (Gad65, en amacrine celler markør)9, Glutamin SYNTETASE (GS, en Müller cellemarkør)10, og calbindin (en vandret cellemarkør)11 (figur 4</stron…

Discussion

Mus nethinde dissektion er en delikat proces på grund af den lille størrelse og form af mus øjne og skrøbelighed af retinale væv. Selv om udførelsen af høj kvalitet dissektion er et spørgsmål om praksis, at have en detaljeret protokol, der giver effektive metoder og tips er en nødvendighed for at få nethinde sektioner og IHC. Ud over de protokoller, der er beskrevet her, er der flere tips, der giver mulighed for ensartede retinal sektioner af høj kvalitet, der egner sig til reproducerbare IHC.

<p class="j…

Materials

6qt. Stainless Steel Beaker (185 x 218mm)	Gilson	#MA-48	For liquid nitrogen (Figure 1E)
Aluminum foil
Cauterizer	Bovie	#AA01	To mark eye orientation (Figure 1A)
Curved forceps, Dumont #5/45 tweezers, 45-degrees bent	Electron Microscopy Sciences	#72703-D	For mouse eye enucleation and maintenance (Figure 1A)
Curved scissors, Vannas Spring Scissors – 2.5mm Cutting Edge	Fine Science Tools	#15002-08	To circumferentially cut the cornea (Figure 1B)
Dental wax-coated 35mm dissection dish			For eye cup dissection (Figure 1C)
Dissecting microscope	Leica, Houston, USA	MZ12.5 High-performance stereomicroscope
Micro Knives – Plastic Handle	Fine Science Tools	#10315-12	To make a small incision at the burn mark (Figure 1A)
Pink dental wax	Electron Microscopy Sciences	#72660	For coating dissection dish
Slide Rack and Coverplate	Ted Pella	#36107	For retinal IHC (Figure 1G)
Stainless Steel Beaker (89 x 114mm)	Gilson	#MA-40	For isopentane bath (Figure 1E)
Styrofoam box			For insulated cooler
Thin forceps Dumont #5	Fine Science Tools	#11254-20	To remove the cornea and extract the lens (Figure 1B)
Tissue-Tek cryomold  (10mm x 10mm x 5mm)	Electron Miscroscopy Sciences	#62534-10	Mold for OCT embedding
Buffers and Reagents	Company	Catalog Number	Comments
Blocking solution			2% Normal Horse Serum, 1.5% Cold Fish skin Gelatin (at 40-50% in H2O, cat #G7765), 5% bovine serum albumin (cat #AK1391-0100) in permeabilization buffer.
Gelvatol (anti-fading mounting media)			Under the fume hood, dissolve 0.337g DABCO (Sigma cat #D2522-25G) in 10mL Fluoromount G (Fisher cat #OB100-01).  Adjust to pH 8-8.5 with 12N HCl (~ 5 drops).  Store in amber drop bottle at 4°C  (8).
Hoechst 33342 1000x Stock	Thermo Scientific	#62249	1 mg/ml in PBS (1000x). Aliquot and store in dark, at 4°C for up to 1 year or at -20°C for long term storage. Prepare fresh  at 1 ug/mL (1x)
Isopentane, 99%	GFS Chemicals	#2961
Liquid Nitrogen
Paraformaldehyde (PFA) in PBS	Electron Microscopy Sciences	#15710	Prepared fresh 4% PFA from 16% PFA stock. Store the remaining 16% PFA at 4°C in the dark.
Permeabilization solution			PBS + 0.25% Triton-X (AMRESCO cat #0694-1L) + 0.05% NaN3.  Prepare fresh.
Phosphate-buffered saline (PBS)	Bioworld	#41620015-20	0.02 g/L KCl, 0.02 g/L KH2PO4, 0.8 g/L NaCl, 0.216 g/L Na2HPO4 , pH 7.4.  Prepared from 10x stock
Sucrose solutions	Fisher Scientific	#S-5-500	Dissolve the appropriate amount of sucrose in  37°C PBS (takes ~15 min to dissolve). May be stored for a few days at 4°C.
Tissue-Tek OCT-compound	Sakura	#4583
Antibodies	Company	Catalog Number	Comments
anti-calbindin	Sigma-Aldrich	C8666	To label horinzotal cells
anti-GAD65	Chemicon	AB5082	To label GABAergic amacrine cells
anti-GS	BD Transduction	610517	To label Müller cells
anti-rhodopsin	Millipore	MAB5316	To label rods