Utarbeidelse av Mouse retinal fryse-seksjoner for immunhistokjemi

Summary

Denne rapporten beskriver omfattende metoder for å forberede frosne mus Retina seksjoner for immunhistokjemi (IHC). Metodene som er beskrevet inkluderer Disseksjon av øye bakre kopp, paraformaldehyde fiksering, innebygging i optimal skjæring temperatur (OCT) Media og vev orientering, snitting og immunostaining.

Abstract

Utarbeidelse av høy kvalitet muse øye seksjoner for immunhistokjemi (IHC) er avgjørende for å vurdere retinal struktur og funksjon og for å bestemme mekanismene underliggende retinal sykdommer. Opprettholde strukturelle integritet gjennom hele vevet forberedelse er avgjørende for å oppnå reproduserbar retinal IHC data, men kan være utfordrende på grunn av skjørhet og kompleksiteten i retinal cytoarchitecture. Sterk fiksativene som 10% formalin eller Bouin løsning optimalt bevare retinal struktur, de ofte hemme IHC analyse ved å forbedre bakgrunnen fluorescens og/eller avtagende antistoff-epitope interaksjoner, en prosess som kalles epitope maskering. Mildere fiksativene, på den annen side, som 4% paraformaldehyde, reduserer bakgrunnen fluorescens og epitope-maskering, grundige disseksjon teknikker må benyttes for å bevare retinal struktur. I denne artikkelen presenterer vi en omfattende metode for å forberede musen øye bakre kopper for IHC som er tilstrekkelig til å bevare de fleste antistoff-epitope interaksjoner uten tap av retinal strukturelle integritet. Vi inkluderer representative IHC med antistoffer mot ulike typer Netthinne celle markører for å illustrere vevs bevaring og-orientering under optimale og under optimale forhold. Vårt mål er å optimalisere IHC studier av netthinnen ved å tilby en komplett protokoll fra disseksjon til IHC.

Introduction

Immunhistokjemi (IHC) er en kraftig teknikk for lokalisere av spesifikke proteiner og cellulære strukturer i vev i situ^1,2,3. Upassende fiksering metoder og sub-optimal snitting av komplekse vev kan forstyrre vev struktur, generere høy bakgrunn farging eller redusere antistoff-epitope interaksjoner, noe som resulterer i flekker gjenstander og påfølgende feil tolkning av IHC data⁴. Som virveldyr Retina er et komplekst og svært organisert neural organ bestående av lag av sammenkoblede fotoreseptorene, interneurons og Ganglion celler, er det svært skjøre og kan lett forstyrres under disseksjon og snitting. En detaljert, standardisert og validert protokoll fra mus øye disseksjon og orientering til immunostaining vil bidra til å redusere IHC-artefakter betraktelig, og dermed øke påliteligheten til resultatene og gi mer nøyaktige sammenlignings data Analyse.

Det er mange protokoller for vev forberedelse for IHC, men ikke alle er egnet for retinal vev. Sterk fiksativene som 10% formalin eller Bouin ‘ s løsning bevare retinal struktur under disseksjon og skjæring⁵. Beklageligvis, kraftig fiksativene ofte føre til det forsterket miljøet fluorescens og epitope maske på grunn av det kjemikalie modifisering av epitopes⁶. På den annen side, mildere fiksativene, som 4% paraformaldehyde (PFA) kan lindre noen av disse gjenstandene, men krever grundige disseksjon og snitting for å bevare den optimale retinal struktur. PFA penetrerer raskt vev, men kryss-koblinger proteiner svært langsomt, redusere risikoen for epitope maskering. Siden kort tid PFA inkubasjons er en relativt mild fiksering, vev ofte krever rask frysing å bevare antigener. Det er viktig å unngå iskrystall formasjon under vev frysing som de forvrenge og skade integriteten av celler og vev⁷.

Her beskriver vi detaljerte og standardiserte protokoller for disseksjon, fiksering, og fryse beskyttelse av musen øye bakre kopper som gir konsistente og pålitelige IHC data.

Protocol

Alle metodene som er beskrevet her ble utført i nøye samsvar med anbefalingene i National Institutes of Health guide for omsorg og bruk av Laboratoriedyr levert av Institutt for laboratorium Animal Resources og ble godkjent av Institusjonelle Animal Care og bruk komité ved University of Pennsylvania. Alle verktøy og utstyr for metodene er vist i figur 1 og listet i materialfortegnelsen. 1. Mus øye utskraping, Eye Cup…

Representative Results

For å illustrere hvordan disse protokollene, sikre optimal Netthinne bevaring for IHC, analysert vi Netthinne seksjoner fra P28 WT mus (C57BL/6N) med antistoffer mot rhodopsin (en foto reseptoren markør)8, Glutaminsyre acid decarboksilaza 65 (Gad65, en amacrine celle merke)9, glutamin SYNTETASE (GS, en Müller celle markør)10, og calbindin (en horisontal celle markør)11 (<strong class="xfig…

Discussion

Mouse Retina disseksjon er en delikat prosess på grunn av den lille størrelsen og formen på musen øyne og skjørhet av retinal vev. Selv om utføring av høy kvalitet disseksjon er et spørsmål om praksis, har en detaljert protokoll, som gir effektive metoder og tips er en nødvendighet for å få tak i Netthinne seksjoner og IHC. I tillegg til protokollene beskrevet her, er det flere tips som gir konsistent høy kvalitet retinal seksjoner som er egnet for reproduserbar IHC.

Før starter …

Materials

6qt. Stainless Steel Beaker (185 x 218mm)	Gilson	#MA-48	For liquid nitrogen (Figure 1E)
Aluminum foil
Cauterizer	Bovie	#AA01	To mark eye orientation (Figure 1A)
Curved forceps, Dumont #5/45 tweezers, 45-degrees bent	Electron Microscopy Sciences	#72703-D	For mouse eye enucleation and maintenance (Figure 1A)
Curved scissors, Vannas Spring Scissors – 2.5mm Cutting Edge	Fine Science Tools	#15002-08	To circumferentially cut the cornea (Figure 1B)
Dental wax-coated 35mm dissection dish			For eye cup dissection (Figure 1C)
Dissecting microscope	Leica, Houston, USA	MZ12.5 High-performance stereomicroscope
Micro Knives – Plastic Handle	Fine Science Tools	#10315-12	To make a small incision at the burn mark (Figure 1A)
Pink dental wax	Electron Microscopy Sciences	#72660	For coating dissection dish
Slide Rack and Coverplate	Ted Pella	#36107	For retinal IHC (Figure 1G)
Stainless Steel Beaker (89 x 114mm)	Gilson	#MA-40	For isopentane bath (Figure 1E)
Styrofoam box			For insulated cooler
Thin forceps Dumont #5	Fine Science Tools	#11254-20	To remove the cornea and extract the lens (Figure 1B)
Tissue-Tek cryomold  (10mm x 10mm x 5mm)	Electron Miscroscopy Sciences	#62534-10	Mold for OCT embedding
Buffers and Reagents	Company	Catalog Number	Comments
Blocking solution			2% Normal Horse Serum, 1.5% Cold Fish skin Gelatin (at 40-50% in H2O, cat #G7765), 5% bovine serum albumin (cat #AK1391-0100) in permeabilization buffer.
Gelvatol (anti-fading mounting media)			Under the fume hood, dissolve 0.337g DABCO (Sigma cat #D2522-25G) in 10mL Fluoromount G (Fisher cat #OB100-01).  Adjust to pH 8-8.5 with 12N HCl (~ 5 drops).  Store in amber drop bottle at 4°C  (8).
Hoechst 33342 1000x Stock	Thermo Scientific	#62249	1 mg/ml in PBS (1000x). Aliquot and store in dark, at 4°C for up to 1 year or at -20°C for long term storage. Prepare fresh  at 1 ug/mL (1x)
Isopentane, 99%	GFS Chemicals	#2961
Liquid Nitrogen
Paraformaldehyde (PFA) in PBS	Electron Microscopy Sciences	#15710	Prepared fresh 4% PFA from 16% PFA stock. Store the remaining 16% PFA at 4°C in the dark.
Permeabilization solution			PBS + 0.25% Triton-X (AMRESCO cat #0694-1L) + 0.05% NaN3.  Prepare fresh.
Phosphate-buffered saline (PBS)	Bioworld	#41620015-20	0.02 g/L KCl, 0.02 g/L KH2PO4, 0.8 g/L NaCl, 0.216 g/L Na2HPO4 , pH 7.4.  Prepared from 10x stock
Sucrose solutions	Fisher Scientific	#S-5-500	Dissolve the appropriate amount of sucrose in  37°C PBS (takes ~15 min to dissolve). May be stored for a few days at 4°C.
Tissue-Tek OCT-compound	Sakura	#4583
Antibodies	Company	Catalog Number	Comments
anti-calbindin	Sigma-Aldrich	C8666	To label horinzotal cells
anti-GAD65	Chemicon	AB5082	To label GABAergic amacrine cells
anti-GS	BD Transduction	610517	To label Müller cells
anti-rhodopsin	Millipore	MAB5316	To label rods