الفيزيولوجيالمريض المستمدة 3D Spheroids لفحص المخدرات المضادة للأورام لاستهداف الخلايا الجذعية السرطان
Summary
يصف هذا البروتوكول توليد الـ spheroids المشتقة من المريض، والتحليل في المراحل النهائية بما في ذلك القياس الكمي للانتشار، واختبار السمية الخلوية، وقياس التدفق الخلوي، وتلطيخ الفلورة المناعية والتصوير البؤري، من أجل تقييم الدواء إمكانات المرشحين كعلاجات مضادة للأورام. يدعم هذا البروتوكول الطب الدقيق مع تحديد أدوية محددة لكل مريض ومرحلة المرض.
Abstract
في هذا البروتوكول، نحدد الإجراء لتوليد الأورام في غضون 384 جيدا قطرات معلقة للسماح لفحص عالية الإنتاجية من العلاجات المضادة للسرطان في بيئة صغيرة تمثيلية من الناحية الفسيولوجية. نحن الخطوط العريضة لتشكيل المريض المستمدة من السرطان الخلايا الجذعية spheroids، فضلا عن، والتلاعب من هذه spheroids لتحليل شامل بعد العلاج من المخدرات. وعلى وجه التحديد، فإننا نصف جمع مورفولوجيا السفيرويد، والانتشار، والقدرة على البقاء، وسمية المخدرات، والنمط الظاهري للخلايا، وبيانات توطين الخلايا. يركز هذا البروتوكول بشكل كبير على تقنيات التحليل التي يتم تنفيذها بسهولة باستخدام منصة إسقاط معلقة 384 بئر، مما يجعلها مثالية لفحص المخدرات الإنتاجية العالية. في حين أننا نؤكد على أهمية هذا النموذج في دراسات سرطان المبيض وأبحاث الخلايا الجذعية السرطان، منصة 384 جيدا قابلة للبحث من أنواع السرطان الأخرى ونماذج المرض، وتوسيع فائدة المنصة إلى العديد من المجالات. من خلال تحسين سرعة فحص المخدرات الشخصية ونوعية نتائج الفحص من خلال تنفيذها بسهولة الثقافات 3D التمثيلية الفسيولوجية، ومن المتوقع أن تساعد هذه المنصة في تطوير علاجات جديدة والمريض محددة استراتيجيات العلاج، وبالتالي لها تأثير سريري واسع النطاق.
Introduction
بلغت الوفيات المرتبطة بالسرطان في جميع أنحاء العالم 9.8مليون حالة وفاة في عام 2018 1، مما يبرز الحاجة إلى تطوير علاجات محسنة. ولسوء الحظ، فإن تكلفة تطوير أدوية السرطان آخذة في الازدياد، مع استحداث دواء واحد يكلف حوالي 650 مليون دولار أمريكي2 مما يشير إلى الحاجة إلى استراتيجيات محسنة لتطوير أدوية جديدة لمكافحة السرطان. الخلايا الجذعية السرطانية (CSCs)، والتيتتميز بزيادة المقاومة الكيميائية 3، والقدرة على التجديد الذاتي، والقدرة على زرع أورام جديدة4 ويعتقد أن تكون مسؤولة عن تكرار الورم4،الانبثاث5،و المقاومة الكيميائية4،6، والتي تسهم جميعها في القدرة الخبيثة للورم وبالتالي ارتفاع عدد الوفيات. في سرطان المبيض ، يتم العثور على هذه الخلايا المخصب في السائل الاستسقاء الخبيث في تجويف البريكوني ، وهي حالة مرتبطة بضعف النتائج السريرية1. ونتيجة للقدرات الخبيثة لـ CSCs، كان هناك دافع لتطوير أدوية جديدة تستهدف CSC لاستخدامها بالاقتران مع العلاج الكيميائي التقليدي. وهناك العديد من التحديات التي تصاحب تطوير العقاقير التي تستهدف العقاقير التي تستهدف الـ CSC، بما في ذلك: (1) صعوبة توسيع نطاق مراكز الخدمات المجتمعية وصيانتها في المختبر؛ (2) صعوبة توسيع نطاق العقاقير الأساسية في المختبر؛ (2) عدم وجود أي تحديات في مجال التعاطي مع العقاقير الأساسية؛ (3) وضع وتنفيذ برامج لمكافحة العقاقير 2) ندرة عينات المرضى؛ 3) الأهمية الفسيولوجية للمنصة الثقافية؛ و4) عدم التجانس في حساسية المخدرات بين المرضى. يحدد هذا البروتوكول تنفيذ منصة ثقافة ثلاثية الجوانب عالية الإنتاجية يمكنها التغلب على كل من هذه التحديات. وعلى وجه الخصوص، يسمح هذا النظام بإجراء فحص سريع للأدوية باستخدام أعداد صغيرة من مراكز المباسيد اتّصال المبيضية المستمدة من المرضى، وهو قابل إلى حد كبير لتقنيات التحليل في المراحل النهائية. في حين مثالية لدراسة سرطان المبيض وCSCs، منصتنا هي أيضا قيمة في دراسة السرطانات الأخرى وأنواع الخلايا المتمايزة في البيئات المعقدة 3D.
نماذج 3-الأبعاد المعقدة (3D) حاسمة في دراسة البيئة الدقيقة الورم (TME)، وهو محراب 3D تتكون من الخلايا السرطانية، والخلايا الداعمة غير السرطانية، والبروتينات مصفوفة خارج الخلية (ECM)4. هذه البيئة ثلاثية الأبعاد تؤدي إلى مورفولوجيا الخلية الفريدة، وتفاعلات الخلايا ومصفوفة الخلايا، وتمايز الخلايا، وهجرةالخلايا، وكثافة الخلايا، وتدرجات الانتشار مقارنة بثقافة الخلايا ثنائية الأبعاد التقليدية في المختبر 4. كل هذه العوامل تتوج في الاستجابة التفاضلية للمخدرات داخل الثقافات 3D، مما يظهر زيادة مقاومة المخدرات والأهمية الفسيولوجية7،8. نظرا لدور TME 3D في CSC التمايز والمقاومة الكيميائية، فمن الحيوي لفحص CSC استهداف المخدرات في البيئات الدقيقة الفسيولوجية. تحسين الأهمية الفسيولوجية لمنصات فحص المخدرات CSC لديه القدرة على تحسين فحص المخدرات المريض محددة، وتطوير المخدرات، وصياغة استراتيجيات العلاج، والنتائج السريرية في نهاية المطاف. ومن المهم بنفس القدر أن تكون المنصة المستخدمة لفحص الأدوية عالية الإنتاجية ومتوافقة مع أساليب التحليل النهائية لتقليل التكلفة والوقت ووقت الترجمة السريرية للأدوية الواعدة9.
حاليا، يتم الحفاظ على TME المعقدة أفضل لتطبيقات فحص المخدرات من خلال في نماذج الجسم الحي مثل نماذج الورم الجينوجيني ة، والخلايا المستمدة من خط xenografts، ونموذج xenograft المستمدة من المريض (PDX)12، كما أنها توفر الفيزيولوجيا الظروف. ومع ذلك، فإن طبيعة الإنتاجية المنخفضة لهذه النماذج، فضلا عن التكلفة والوقت ومجموعات المهارات التقنية التي تتطلبها تحد من فائدتها في تطبيقات فحص المخدرات السريعة والعالية الإنتاجية13. كبدائل لهذه في نماذج الجسم الحي، العديد منالنماذج في المختبر 3D باستخدام هيدروجيلس 8، والثقافة داخل الأجهزة microfluidic أو ‘الجهاز على رقاقة’ الأجهزة10،14،والثقافات غير الملتصقة3،8 كما تم تطويرها، بسبب انخفاض حاجز الدخول من حيث التكلفة والوقت ومجموعة المهارات المطلوبة.
منصات ثقافة هيدروجيل مفيدة في السيطرة الدقيقة الممنوحة على تكوين المصفوفة، والخصائص الميكانيكية، وهيكل المصفوفة15؛ ومع ذلك، فإنها يمكن أن تمنع ثقافة الخلية عالية الكثافة14. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يؤدي حصاد الخلايا من المواد المائية إلى تعقيد التحليل في المصب، وذلك بسبب الآثار الضارة المحتملة لطرق الحصاد15. الأجهزة الميكروفلويدية، من ناحية أخرى، هي أجهزة صغيرة النطاق تسمح بالكشف عن الإخراج داخل نفس الجهاز ولثقافة الخلايا على نطاقات ذات صلة من الناحية الفسيولوجية مع الحد الأدنى من استهلاك الكواشف، وانخفاض وقت التفاعل، وتقليل النفايات، و انتشار سريع14. هذه الخصائص تجعلها منصات واعدة للتحقيق سمية المخدرات, فعالية, والدوائية. ومع ذلك، فإن تحديات ثقافة الخلايا ثلاثية الدفتقنية الفعالة والقابلة للقياس الكمي والقابلة للاستنساخ وسهلة الاستخدام، فضلاً عن أنظمة الضخ الضخمة والمكلفة قد قيدت تطبيقات السوائل الدقيقة في البحوث عالية الإنتاجية10. كما أن عمليات الكشف الفعالة والتنفيذ الصعب المحتمل في جميع المجالات قد أعاقت أيضاً اعتماد النظم الدقيقة السوائل على نطاق واسع10.
على العكس من ذلك، لا تتضمن الـ spheroids التي يتم إنشاؤها في ظروف غير مرتبطة في خلاطات دوارة (nutators)، ولوحات المرفقات منخفضة للغاية، وقطرات معلقة مكونات مصفوفة محددة من قبل المستخدم. هذه المنهجيات ذات الصلة خاصة لدراسة سرطان المبيض حيث أن الظروف غير الملتصقة تمثل الظروفالتي تنمو فيها النفيض داخل التجويف العبي 5. ضمن هذه الأساليب الثقافة غير الملتصقة، وقد ثبت أن nutator وشنقا المتدلية إسقاط spheroids لإظهار ضغط أعلى، وإعادة عرض، ومقاومة كيميائية بالمقارنة مع spheroids ولدت في لوحات المرفقات منخفضة جدا، مما يشير إلى زيادة الفسيولوجية الصلة16،17،18،19. بسبب زيادة القدرة على فحص عالية الإنتاجية من أحجام الآبار الصغيرة والحد الأدنى من أرقام الخلايا المطلوبة، توليد spheroid في لوحات قطرة معلقة هو منصة مثالية لفحص المخدرات. هنا، نقدم منصة فيزيولوجية ثلاثية المدة قابلة للضبط في لوحات إسقاط معلقة 384-well، والتي هي سهلة التنفيذ وقابلة للغاية لتحليل المصب، مما يجعلها مثالية لفحص المخدرات الإنتاجية العالية من سرطان المبيض والمبيض CS.
لدينا منصة فيزيولوجية 3D يوفر كل من مزايا الثقافة 3D، بما في ذلك الاتصالات الخلايا الفسيولوجية، والتدرجات انتشار، كثافات الخلايا، والبروتينات ECM المنتجة بشكل طبيعي، والتي قد تسهم في استجابات المخدرات واقعية16، 17،18،19. بالإضافة إلى ذلك، من خلال توليد هذه spheroids مع CS المستمدة من المريض، ونحن قادرون على تحديد استجابات المريض محددة للأدوية1 مع العديد من تكرار التقنية في وقت واحد، للتغلب على عدم التجانس التي يمكن العثور عليها داخل ورم المريض عينات20. وعلاوة على ذلك، فقد ثبت أن الثقافة ثلاثية الجوانب تعزز الحفاظ على سكان CSC3و16، وبالتالي فهي تمثل السكان المخصب CSC في الاستسقاء7. هذا جنبا إلى جنب مع تحليل سهل المصب, بما في ذلك تحليل تدفق قياس السيتومترية من الجدوى ونسب CSC يسمح للتقييم الأمثل لCSC استهداف فعالية المخدرات. وأخيرا، هذه المنصة الفسيولوجية متوافقة مع التصوير في نقاط زمنية متعددة خلال التجربة، وتقييم موت الخلية وانتشارها، وتنظيم الخلايا ومورفولوجيا مع الكيمياء المناعية، والإشارات القابلة للذوبان مع ELISA على مشروط المتوسطة، والأنماط الظاهرية للخلايا مع قياس التدفق الخلوي، والتعبير الجيني بعد PCR.
Protocol
Representative Results
Discussion
منصة لوحة إسقاط معلقة 384 جيدا لتشكيل spheroid 3D هو أداة تنفذ بسهولة لأي بيولوجيا الخلية أو مختبرات بيولوجيا السرطان. هذه المنصة الفسيولوجية تمكن من دراسة خطوط الخلايا، فضلا عن عينات المرضى الأولية داخل الثقافات 3D ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية مع السماح لفحص المخدرات الإنتاجية العالية. كما…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويدعم هذا العمل في المقام الأول من قبل DOD OCRP جائزة الباحث الوظيفي المبكر W81XWH-13-1-0134 (GM)، جائزة الطيار DOD W81XWH-16-1-0426 (جنرال موتورز)، بدأت لجنة التحقيق في الدفاع عن حقوق الإنسان جائزة W81XWH-17-OCRP-IIRA (GM)، مركز ريفكين لسرطان المبيض وسرطان المبيض ميشيغان التحالف. وقد تم دعم البحوث التي وردت في هذا المنشور من قبل المعهد الوطني للسرطان من المعاهد الوطنية للصحة تحت جائزة رقم P30CA046592. وتتلقى هذه المؤسسة الدعم من زمالة بحوث الدراسات العليا التابعة للمؤسسة الوطنية للعلوم في إطار المنحة رقم 1256260. ويتلقى المكتب الدعم من وزارة التعليم في مجال مساعدة الدراسات العليا في مجالات الحاجة الوطنية.
Materials
| 0.25% trypsin-EDTA | Gibco | ILT25200056 | |
| 10 mL serological pipet | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| 10,000 cSt Si oil | Millipore Sigma | 63148-62-9 | Used to coat spheroid array mold to facilitate removal of tissue processing gels, like Histogel, from the mold. |
| 100 mm tissue culture dish | Thermo Scientific | 130182 | |
| 15 ml conical tube | Celltreat | FL4021 | |
| 1X DMEM for Serum Free Medium | Gibco | 11965-092 | |
| 1X F12 for Serum Free Medium | Gibco | 11765-054 | |
| 1X phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | ILT10010023 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher | D1306 | |
| 40 µm filter | Fisher Scientific | 22363547 | |
| 6-well plate | Fisher Scientific | 353046 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies Inc. | 1449 | A gentle cell detachment enzyme composed of proteolytic and collagenolytic enzymes. |
| ACK Lysing Buffer | Thermo Scientific | A1049201 | |
| alamarBlue | Invitrogen | DAL1025 | Resazurin dye used to measure viability and proliferation of cells based on their ability to reduce resazurin to resorufin, which is highly fluorescent. |
| ALDEFLUOR assay kit | Stem Cell Tech | 1700 | Kit to identify stem and progenitor cells that express high levels of aldehyde dehydrogenase , an indicator of cancer stem cells. The kit is composed of ALDEFLUOR Reagent, DEAB, Hydrochloric Acid, Dimethylsulphoxide, and ALDEFLUOR Assay Buffer. |
| ALDEFLUOR Diethylaminobenzaldehyde (DEAB) | Stem Cell Tech | 1705 | Diethylaminobenzaldehyde (DEAB) is an inhibitor of ALDH isozymes, used to determine non-specific ALDH staining. |
| Andor iXon x3 CCD Camera | Oxford Instruments | – | |
| Antibiotics and Antimycotics | Gibco | 15240-062 | |
| APC-isotype IgG2b | Miltenyi biotec | 130-092-217 | Isotype control to quantify non-specific staining of IgG2b antibodies. |
| B27 Supplement | Gibco | 17504044 | |
| basic Fibroblast Growth Factor | Stem Cell Technologies | 78003.1 | |
| BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes | Fisher Scientific | 14-826-79 | |
| BioTek Synergy HT Microplate Reader | BioTek | 7091000 | |
| CD133-APC | Miltenyi biotec | 130-113-184 | Fluorescent antibody targeting CD133, a cancer stem cell marker. |
| cellSens Dimension Software | Olympus | ||
| Cisplatin | Sigma-Aldrich | P4394 | Platinum based chemotherapy agent that functions as an alkylating agent that disrupts DNA. |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | |
| Epidermal Growth Factor | Gibco | PHG0311 | |
| EVOS XL Core Cell Imaging System | Life Technologies | AME3300 | |
| Fetal Bovine Serum – premium (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Ficoll 400 | Sigma-Aldrich | F4375 | |
| Hemacytometer | Hausser Scientific | 1490 | |
| Histogel | Thermo Scientific | HG-4000-012 | Tissue processing gel that can penetrate and hold the specimen within the gel while preventing discoloration around the specimen upon staining. |
| Human Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells | Lonza | PT-5006 | |
| Human Microvascular Endothelial Cells | Lonza | CC2543 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium Supplement | Gibco | 51500-056 | |
| Live/Dead viability kit | Invitrogen | L3224 | Kit for the fluorescence based detection of live (calcein-AM) and dead cells (Ethidium Homodimer-1). |
| MEM Non-essential Amino Acids | Gibco | 11140-050 | |
| MetaMorph 7.8 Software | Molecular Devices | – | |
| Olympus IX81 Inverted Confocal Microscope | Olympus | – | |
| Olympus IX83 Research Inverted Microscope | Olympus | ||
| Parafilm M | Thomas Scientific | 7315D35 | Thermoplastic polymer strips that serve to limit droplet evaporation in hanging drop plates while still allowing for gas exchange. |
| Perfecta 3D 384 Well Hanging Drop Plates | 3D Biomatrix | HDP1384-8 | Available through Sigma-Aldrich |
| phalloidin AlexaFluor488 | Invitrogen | A12379 | Phalloidin is a peptide to fluorescently label F-actin in fixed cells. |
| ProJet 3500 HD Max | 3D Systems | – | 3D printer |
| Sterile DI water | Fisher Scientific | 353046 | |
| Trypan Blue | Gibco | 15250061 | Azo dye used to differentiate between live and dead cells based on its ability to pass through the damaged membrane of dead cells, but not the intact membrane of live cells. |
| VisiJet M3 Crystal | 3D Systems | – | A biocompatible polymer material for 3D printing. |
| Yokogawa CSU-X1 Confocal Scanner Unit | Yokogawa | – |
References
- . . All cancers Source: Globocan. , (2018).
- Prasad, V., Mailankody, S. Research and Development Spending to Bring a Single Cancer Drug to Market and Revenues After Approval. JAMA Internal Medicine. 177, 1569-1575 (2017).
- Raghavan, S., et al. Personalized Medicine Based Approach to Model Patterns of Chemoresistance and Tumor Recurrence Using Ovarian Cancer Stem Cell Spheroids. Clinical Cancer Research. 23 (22), 6934-6945 (2017).
- Jordan, C. T., Guzman, M. L., Noble, M. Cancer Stem Cells. New England Journal of Medicine. 355, 1253-1261 (2006).
- Ishiguro, T., et al. Establishment and Characterization of an In Vitro Model of Ovarian Cancer Stem-like Cells with an Enhanced Proliferative Capacity. Cancer Research. 76, 150-160 (2016).
- Páez, D., et al. Cancer Dormancy: A Model of Early Dissemination and Late Cancer Recurrence. Clinical Cancer Research. 18, 645-653 (2012).
- Ahmed, N., Stenvers, K. L. Getting to Know Ovarian Cancer Ascites: Opportunities for Targeted Therapy-Based Translational Research. Frontiers in Oncology. 3, (2013).
- Pradhan, S., Clary, J. M., Seliktar, D., Lipke, E. A. A three-dimensional spheroidal cancer model based on PEG-fibrinogen hydrogel microspheres. Biomaterials. 115, 141-154 (2017).
- Varna, M., Bertheau, P., Legrès, L. Tumor Microenvironment in Human Tumor Xenografted Mouse Models. Journal of Analytical Oncology. 3, 159-166 (2014).
- Huang, S. B., et al. An integrated microfluidic cell culture system for high-throughput perfusion three-dimensional cell culture-based assays: Effect of cell culture model on the results of chemosensitivity assays. Lab on a Chip. 13, 1133-1143 (2013).
- Zang, R., Li, D., Tang, I. C., Wang, J., Yang, S. T. Cell-Based Assays in High-Throughput Screening for Drug Discovery. International Journal of Biotechnology for Wellness Industries. , (2012).
- Murphy, B., et al. Evaluation of alternative in vivo drug screening methodology: a single mouse analysis. Cancer Research. 76, 5798-5809 (2016).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived Xenograft models: An emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4, 998-1013 (2014).
- Damiati, S., Kompella, U. B., Damiati, S. A., Kodzius, R. Microfluidic devices for drug delivery systems and drug screening. Genes. 9, (2018).
- Caliari, S. R., Burdick, J. A. A Practical Guide to Hydrogels for Cell Culture. Nature Methods. 14, 69-81 (2016).
- Mehta, G., Hsiao, A. Y., Ingram, M., Luker, G. D., Takayama, S. Opportunities and challenges for use of tumor spheroids as models to test drug delivery and efficacy. Journal of Control Release. , (2012).
- Mehta, P., Novak, C., Raghavan, S., Ward, M., Mehta, G., Papaccio, G., Desiderio, V. Self-Renewal and CSCs In Vitro Enrichment: Growth as Floating Spheres. Cancer Stem Cells: Methods and Protocols. , 61-75 (2018).
- Raghavan, S., et al. Formation of stable small cell number three-dimensional ovarian cancer spheroids using hanging drop arrays for preclinical drug sensitivity assays. Gynecologic Oncology. 138, 181-189 (2015).
- Raghavan, S., et al. Comparative analysis of tumor spheroid generation techniques for differential in vitro drug toxicity. Oncotarget. 7, 16948-16961 (2016).
- Kim, S., et al. Evaluating Tumor Evolution via Genomic Profiling of Individual Tumor Spheroids in a Malignant Ascites. Scientific Reports. 8, 1-11 (2018).
- Silva, I. A., et al. Aldehyde dehydrogenase in combination with CD133 defines angiogenic ovarian cancer stem cells that portend poor patient survival. Cancer Research. 71, 3991-4001 (2011).
- Pulaski, H. L., et al. Identifying alemtuzumab as an anti-myeloid cell antiangiogenic therapy for the treatment of ovarian cancer. Journal of Translational Medicine. 7, 49 (2009).
- Jager, L. D., et al. Effect of enzymatic and mechanical methods of dissociation on neural progenitor cells derived from induced pluripotent stem cells. Advances in Medical Sciences. 61, 78-84 (2016).
- Ivanov, D. P., Grabowska, A. M. Spheroid arrays for high-throughput single-cell analysis of spatial patterns and biomarker expression in 3D. Scientific Reports. 7, 41160 (2017).
