Dit protocol beschrijft het genereren van door patiënten afgeleide spheroïden en downstreamanalyses, waaronder de kwantificering van proliferatie, cytotoxiciteits testen, Flowcytometrie, immunofluorescentie kleuring en confocale beeldvorming, om de geneesmiddelen te beoordelen potentiële kandidaten als anti-neoplastische Therapeutics. Dit protocol ondersteunt precisie geneeskunde met identificatie van specifieke geneesmiddelen voor elke patiënt en stadium van de ziekte.
In dit protocol schetsen we de procedure voor het genereren van tumor sferoïden binnen 384-goed hangende druppeltjes om een high-throughput screening van anti-kankertherapieën mogelijk te maken in een fysiologisch representatieve micro-omgeving. We schetsen de vorming van patiënten afgeleide Kanker stamcel sferoïden, evenals, de manipulatie van deze sferoïden voor grondige analyse na medicamenteuze behandeling. Concreet beschrijven we de verzameling van spheroid-morfologie, proliferatie, levensvatbaarheid, geneesmiddeltoxiciteit, celfenotype en lokalisatiegegevens van cellen. Dit protocol richt zich sterk op analysetechnieken die eenvoudig worden geïmplementeerd met het 384-well Hanging drop-platform, waardoor het ideaal is voor een hoge doorvoer van drugs screening. Terwijl we benadrukken het belang van dit model in ovariële kanker studies en kanker stamcelonderzoek, de 384-well platform is vatbaar voor onderzoek van andere soorten kanker en ziekte modellen, uitbreiding van het nut van het platform om vele gebieden. Door de snelheid van gepersonaliseerde geneesmiddelen screening en de kwaliteit van screening resultaten te verbeteren door eenvoudig te implementeren fysiologisch representatieve 3D-culturen, wordt dit platform voorspeld om te helpen bij de ontwikkeling van nieuwe therapieën en patiëntspecifieke behandelstrategieën en hebben zo een brede klinische impact.
Wereldwijde kankergerelateerde sterfte bereikte een tol van 9.800.000 sterfgevallen in 20181, met de nadruk op de noodzaak voor de ontwikkeling van verbeterde Therapeutics. Helaas, de kosten van het ontwikkelen van kanker drugs neemt toe, met de ontwikkeling van een enkele drug kost ongeveer 650.000.000 USD2 wijst op de noodzaak van verbeterde strategieën voor de ontwikkeling van nieuwe anti-kanker drugs. Kanker stamcellen (CSCs), die worden gekenmerkt door verhoogde chemoresistance3, de capaciteit om zichzelf te verlengen, en het vermogen om nieuwe tumoren zaad4 worden verondersteld te zijn verantwoordelijk voor tumor recidief4, metastase5, en chemoresistance4,6, die allemaal bijdragen aan de kwaadaardige capaciteit van de tumor en dus de hoge dood tol. Bij eierstokkanker worden deze cellen verrijkt in de maligne ascites vloeistof in de peritoneale Holte, een aandoening die gepaard gaat met slechte klinische uitkomsten1. Als gevolg van de kwaadaardige capaciteiten van CSCs, is er een duw geweest om nieuwe CSC-targeting te ontwikkelen die in combinatie met traditionele chemotherapieën wordt gebruikt. Er zijn verschillende uitdagingen die gepaard gaan met de ontwikkeling van CSC-targeting op drugs, waaronder: 1) moeilijkheden bij het uitbreiden en onderhouden van CSCs in vitro; 2) schaarste van de patiënt monsters; 3) fysiologische relevantie van het cultuurplatform; en 4) heterogeniteit in geneesmiddel gevoeligheid tussen patiënten. Dit protocol schetst de implementatie van een 3D-cultuurplatform met hoge doorvoer dat elk van deze uitdagingen kan overwinnen. Met name dit systeem zorgt voor een snelle geneesmiddelen screening met behulp van kleine aantallen patiënt-afgeleide ovariële CSCs, en is zeer vatbaar voor downstream analysetechnieken. Hoewel ideaal voor het bestuderen van ovariële kanker en CSCs, is ons platform ook waardevol bij het bestuderen van andere kankers en gedifferentieerde celtypen in complexe 3D-omgevingen.
Complexe 3-dimensionale (3D) modellen zijn essentieel in het bestuderen van de tumor micro Environment (TME), dat is een 3D-niche opgebouwd uit kankercellen, niet-kanker ondersteunende cellen, en extracellulaire matrix (ECM) eiwitten4. Deze 3D-omgeving resulteert in unieke celmorfologie, celceldeling en celmatrix interacties, celdifferentiatie, Celmigratie, celdichtheid en diffusie gradiënten in vergelijking met traditionele 2D-celkweek in vitro4. Al deze factoren culmineren in differentiële drug Response binnen 3D-culturen, exposeren verhoogde drug resistentie en fysiologische relevantie7,8. Vanwege de rol van de 3D-TME in CSC-differentiatie en chemoresistance, is het essentieel om te schermen voor CSC-targeting op drugs in fysiologische micro-omgevingen. Verbetering van de fysiologische relevantie van CSC drug screening platforms heeft het potentieel om patiënt specifieke drug screening te verbeteren, ontwikkeling van geneesmiddelen, formulering van behandelingsstrategieën, en uiteindelijk klinische uitkomsten. Het is net zo belangrijk dat het platform dat wordt gebruikt voor het screenen van geneesmiddelen een hoge doorvoer is en compatibel is met downstream-analysemethoden om kosten, tijd en klinische Vertaal tijd van veelbelovende medicijnen te minimaliseren9.
Op dit moment, het complex TME is het best onderhouden voor drug screening toepassingen door middel van in vivo modellen zoals Murine syngenic tumor modellen, cellijn-afgeleide xenografts, en patiënt-afgeleide xenotransplantaatmodellen is (PDX) modellen12, als ze bieden fysiologisch Voorwaarden. Echter, de lage doorvoer aard van deze modellen, evenals de kosten, tijd en technische vaardigheden sets die ze nodig hebben beperkt hun nut in snelle, hoge doorvoer drug screening toepassingen13. Als alternatieven voor deze in vivo modellen, veel in vitro 3D-modellen met behulp van hydrogels8, cultuur binnen microfluïdische apparaten of ‘ Organ-on-a-chip ‘ apparaten10,14, en niet-aanhandige culturen3,8 zijn ook ontwikkeld, vanwege hun lage barrière voor toegang in termen van kosten, tijd en vereiste vaardigheden.
Hydrogel cultuur platforms zijn voordelig in de fijne controle die wordt geboden over de matrix samenstelling, mechanische eigenschappen en matrixstructuur15; echter, ze kunnen remmen hoge dichtheid celcultuur14. Bovendien kan het oogsten van cellen uit hydrogels de downstreamanalyse compliceren, als gevolg van mogelijk schadelijke effecten van oogstmethoden15. Microfluïdische apparaten, aan de andere kant, zijn Microscale apparaten die het mogelijk maken voor output detectie binnen hetzelfde apparaat en voor celkweek op fysiologisch relevante weegschalen met minimale consumptie van reagentia, verminderde reactietijd, geminimaliseerd afval, en Rapid Diffusion14. Deze kenmerken maken ze veelbelovende platforms voor het onderzoeken van drug toxiciteit, werkzaamheid, en farmacokinetiek. Echter, de uitdagingen van efficiënte, kwantificeerbare, reproduceerbare en gebruiksvriendelijke 3D-celcultuur, evenals, omvangrijke en dure pompsystemen hebben beperkt microfluïdische toepassingen in high-throughput Research10. Efficiënte detectie opstellingen en mogelijk moeilijke implementatie op verschillende terreinen hebben ook de wijdverbreide acceptatie van microfluïdische systemen10belemmerd.
In tegenstelling tot het ontstaan van sferoïden in niet-aanhangende omstandigheden in roterende mixers (nutators), Ultra-Low-bevestigings platen en hangende druppels worden geen door de gebruiker gedefinieerde matrix componenten opgenomen. Deze methodologieën zijn vooral relevant voor het bestuderen van ovariële kanker, aangezien de niet-aanhandende omstandigheden representatief zijn voor de omstandigheden waarin sferoïden binnen de peritoneale holte5groeien. Binnen deze niet-aanhangende kweekmethoden is aangetoond dat nutator en hangende valsspheroids een hogere verdichting, herinrichting en chemoresistance vertonen in vergelijking met sferoïden die in uiterst lage bevestigings platen worden gegenereerd, wat suggereert dat er meer fysiologische relevantie16,17,18,19. Door de toegenomen capaciteit voor screening met hoge doorvoer van kleinere goed groottes en minimale vereiste celaantallen is spheroid-generatie in hangende drop platen een ideaal platform voor geneesmiddelen screening. Hier presenteren we een instelbaar 3D-fysiologisch platform in 384-goed hangende druppel platen, die gemakkelijk te implementeren en zeer vatbaar zijn voor downstream-analyse, waardoor het ideaal is voor een hoge doorvoer van drug screening van eierstokkanker en ovariële CSCs.
Ons 3D-fysiologisch platform biedt alle voordelen van 3D-cultuur, waaronder fysiologische celcelcontacten, diffusie gradiënten, celdichtheden en natuurlijk geproduceerde ECM-eiwitten, die kunnen bijdragen aan realistische geneesmiddel responsen16, 17,18,19. Bovendien kunnen we, door deze sferoïden te genereren met door de patiënt afgeleide CSCS, patiënt specifieke reacties op drugs1 vaststellen met veel technische replicaten tegelijkertijd, om heterogeniteit te overwinnen die kan worden gevonden binnen de tumor van de patiënt voorbeelden20. Bovendien is aangetoond dat 3D-cultuur het onderhoud van de CSC-populaties3,16 verbetert en dus representatief is voor de verrijkte CSC-populaties in de ascites7. Dit gecombineerd met eenvoudige downstream analyse, met inbegrip van flow cytometrie analyse van de levensvatbaarheid en CSC-verhoudingen zorgt voor een optimale evaluatie van CSC targeting drug werkzaamheid. Ten slotte is dit fysiologisch platform compatibel met Imaging op meerdere tijdstippen tijdens het experiment, evaluatie van celdood en proliferatie, celorganisatie en morfologie met immunohistochemie, oplosbare signalering met ELISA op geconditioneerde medium, celfenotypes met Flowcytometrie en genexpressie na PCR.
Het 384-well Hanging drop Plate-platform voor 3D-spheroid-formatie is een eenvoudig te implementeren tool voor elke celbiologie of Kankerbiologie Labs. Dit fysiologisch platform maakt de studie van cellijnen, evenals, primaire patiënt monsters binnen fysiologisch relevante 3D-culturen mogelijk, terwijl het een hoge doorvoer van drugs screening toestaat. Het platform zorgt er ook voor dat de cultuuromstandigheden sterk instelbaar zijn, waardoor een strakke controle over de dichtheden, celcocultuurverhoudingen, extracellu…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk wordt voornamelijk ondersteund door de DOD OCRP Early loopbaan onderzoeker Award W81XWH-13-1-0134 (GM), DOD pilot Award W81XWH-16-1-0426 (GM), DOD onderzoeker geïnitieerd Award W81XWH-17-OCRP-IIRA (GM), Rivkin Center voor ovariële kanker en Michigan ovariële kanker Alliantie. Het onderzoek dat in deze uitgave werd gerapporteerd, werd gesteund door het National Cancer Institute van de National Institutes of Health onder het awardnummer P30CA046592. CMN wordt ondersteund door de National Science Foundation Graduate Research Fellowship onder Grant No. 1256260. MEB wordt ondersteund door het departement onderwijs Graduate Assistance in gebieden van National Need (GAANN) Fellowship.
0.25% trypsin-EDTA | Gibco | ILT25200056 | |
10 mL serological pipet | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
10,000 cSt Si oil | Millipore Sigma | 63148-62-9 | Used to coat spheroid array mold to facilitate removal of tissue processing gels, like Histogel, from the mold. |
100 mm tissue culture dish | Thermo Scientific | 130182 | |
15 ml conical tube | Celltreat | FL4021 | |
1X DMEM for Serum Free Medium | Gibco | 11965-092 | |
1X F12 for Serum Free Medium | Gibco | 11765-054 | |
1X phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | ILT10010023 | |
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher | D1306 | |
40 µm filter | Fisher Scientific | 22363547 | |
6-well plate | Fisher Scientific | 353046 | |
Accutase | Innovative Cell Technologies Inc. | 1449 | A gentle cell detachment enzyme composed of proteolytic and collagenolytic enzymes. |
ACK Lysing Buffer | Thermo Scientific | A1049201 | |
alamarBlue | Invitrogen | DAL1025 | Resazurin dye used to measure viability and proliferation of cells based on their ability to reduce resazurin to resorufin, which is highly fluorescent. |
ALDEFLUOR assay kit | Stem Cell Tech | 1700 | Kit to identify stem and progenitor cells that express high levels of aldehyde dehydrogenase , an indicator of cancer stem cells. The kit is composed of ALDEFLUOR Reagent, DEAB, Hydrochloric Acid, Dimethylsulphoxide, and ALDEFLUOR Assay Buffer. |
ALDEFLUOR Diethylaminobenzaldehyde (DEAB) | Stem Cell Tech | 1705 | Diethylaminobenzaldehyde (DEAB) is an inhibitor of ALDH isozymes, used to determine non-specific ALDH staining. |
Andor iXon x3 CCD Camera | Oxford Instruments | – | |
Antibiotics and Antimycotics | Gibco | 15240-062 | |
APC-isotype IgG2b | Miltenyi biotec | 130-092-217 | Isotype control to quantify non-specific staining of IgG2b antibodies. |
B27 Supplement | Gibco | 17504044 | |
basic Fibroblast Growth Factor | Stem Cell Technologies | 78003.1 | |
BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes | Fisher Scientific | 14-826-79 | |
BioTek Synergy HT Microplate Reader | BioTek | 7091000 | |
CD133-APC | Miltenyi biotec | 130-113-184 | Fluorescent antibody targeting CD133, a cancer stem cell marker. |
cellSens Dimension Software | Olympus | ||
Cisplatin | Sigma-Aldrich | P4394 | Platinum based chemotherapy agent that functions as an alkylating agent that disrupts DNA. |
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | |
Epidermal Growth Factor | Gibco | PHG0311 | |
EVOS XL Core Cell Imaging System | Life Technologies | AME3300 | |
Fetal Bovine Serum – premium (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | |
Ficoll 400 | Sigma-Aldrich | F4375 | |
Hemacytometer | Hausser Scientific | 1490 | |
Histogel | Thermo Scientific | HG-4000-012 | Tissue processing gel that can penetrate and hold the specimen within the gel while preventing discoloration around the specimen upon staining. |
Human Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells | Lonza | PT-5006 | |
Human Microvascular Endothelial Cells | Lonza | CC2543 | |
Insulin-Transferrin-Selenium Supplement | Gibco | 51500-056 | |
Live/Dead viability kit | Invitrogen | L3224 | Kit for the fluorescence based detection of live (calcein-AM) and dead cells (Ethidium Homodimer-1). |
MEM Non-essential Amino Acids | Gibco | 11140-050 | |
MetaMorph 7.8 Software | Molecular Devices | – | |
Olympus IX81 Inverted Confocal Microscope | Olympus | – | |
Olympus IX83 Research Inverted Microscope | Olympus | ||
Parafilm M | Thomas Scientific | 7315D35 | Thermoplastic polymer strips that serve to limit droplet evaporation in hanging drop plates while still allowing for gas exchange. |
Perfecta 3D 384 Well Hanging Drop Plates | 3D Biomatrix | HDP1384-8 | Available through Sigma-Aldrich |
phalloidin AlexaFluor488 | Invitrogen | A12379 | Phalloidin is a peptide to fluorescently label F-actin in fixed cells. |
ProJet 3500 HD Max | 3D Systems | – | 3D printer |
Sterile DI water | Fisher Scientific | 353046 | |
Trypan Blue | Gibco | 15250061 | Azo dye used to differentiate between live and dead cells based on its ability to pass through the damaged membrane of dead cells, but not the intact membrane of live cells. |
VisiJet M3 Crystal | 3D Systems | – | A biocompatible polymer material for 3D printing. |
Yokogawa CSU-X1 Confocal Scanner Unit | Yokogawa | – |