Kvantitativ fluorescens in situ-hybridisering (fisk) og immunofluorescens (IF) af specifikke genprodukter i KSHV-inficerede celler
Summary
Vi beskriver en protokol, der udnytter fluorescens in situ-hybridisering (FISH) til at visualisere flere herpes viral RNAs i lytisk inficerede humane celler, enten i suspension eller overholder. Denne protokol omfatter kvantificering af fluorescens, der producerer et nukleocytoplasmic-forhold, og kan udvides til samtidig visualisering af værts-og virale proteiner med immunofluorescens (IF).
Abstract
Mekanistisk indsigt kommer fra omhyggelig undersøgelse og kvantificering af specifikke RNAs og proteiner. De relative placeringer af disse biomolekyler i hele cellen på bestemte tidspunkter kan fanges med fluorescens in situ-hybridisering (fisk) og immunofluorescens (IF). Under lytisk herpes virus infektion, virussen kaprer værtscellen til fortrinsvis udtrykke virale gener, forårsager ændringer i cellernes morfologi og opførsel af biomolekyler. Lytiske aktiviteter er centreret i nukleare fabrikker, betegnet viral replikation rum, som kun kan skelne med fisk og hvis. Her beskriver vi en tilpasningsdygtig protokol af RNA fisk og hvis teknikker til Kaposis sarkom-associerede herpes virus (KSHV)-inficerede celler, både overholder og i suspension. Metoden omfatter trin til udvikling af specifikke anti-sense-oligonukleotider, dobbelt RNA-fisk, RNA-fisk med IF og kvantitative beregninger af fluorescens intensiteter. Denne protokol er blevet anvendt med succes på flere celletyper, ikke-inficerede celler, latente celler, lytiske celler, tids kurser og celler behandlet med hæmmere til at analysere de spatiotemporale aktiviteter af specifikke RNAs og proteiner fra både den menneskelige vært og KSHV.
Introduction
I deres lytisk (aktiv) fase, herpesvira kapre værtscellen, forårsager ændringer i celle morfologi og lokalisering af biologiske molekyler, at producere virions. Basen af operationer er kernen, hvor det dobbeltstrengede DNA-virale genom replikeres og pakkes ind i en proteinshell, kaldet et kapsid1. Til at begynde, virussen udtrykker sine egne proteiner, kapring værts maskiner og forhindre udtryk for ikke-væsentlige vært gener, en proces kaldet Host afspærring effekt. Størstedelen af denne aktivitet er lokaliseret til specifikke 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)-fri nukleare regioner kaldet viral replikation rum, bestående af både vært og virale proteiner, RNAs, og viral DNA2. Cellen er overhalet for at give plads og ressourcer til replikeringsrum og dermed samling af virale capsid’er. Når kapsid forlader kernen, hvordan kapsid er indhyllet i cytoplasmaet at producere en membran-bundet viral partikel, også kendt som en virion, er uklar. Forståelse af lokalisering og rumlige forskydninger af både Host og viral biomolekyler i den lytiske fase giver dybere mekanistisk indsigt i arrangementet af replikeringsrum, Host afspærring effekt, virion-egress pathway og andre processer relateret til herpesviral infektion og replikation.
I øjeblikket den bedste metode til at opdage og studere disse ændringer er visualisering af proteiner og RNAs i inficerede celler med immunofluorescens (IF) og fluorescerende in situ hybridisering (fisk), hhv. Brug af et tidsforløb med disse teknikker afslører lokalisering af biomolekyler på centrale punkter i den lytiske fase eller blot, spatiotemporale data. FISK, og hvis supplere andre biokemiske teknikker, såsom hæmning af en cellulær proces (f. eks hæmning af viral DNA-replikation), RT-qPCR (real-time polymerase kædereaktion), RNA sekventering, nordlige blots, massespektrometri, vestlige blotting, og analyse af viral DNA-produktion, der kan give et mere globalt billede af cellulære aktiviteter.
Vi udviklede RNA-fiske strategier for at undersøge RNA-produkterne fra specifikke gener og en beregningsmæssige analyse, der kvantitativt beregner nukleocytoplasmic-forholdet for et bestemt genprodukt. Prøveforberedelsen, modificeret fra tidligere udgivelser af Steitz og kolleger3,4, er relativt let og kan bruges til både overtrædende og suspenderede celler. Protokollen kan også tilpasses til samtidig brug af flere RNA-fiske strategier (dobbelt RNA-fisk) eller RNA-fisk med IF-strategier. Udvikling af en specifik fiske strategi er udfordrende, men der skitseres forslag til forbedring af succes. Den dataanalyse, der er beskrevet her, er kvantitativ, hvis fluorescerende perler og stærke markører for rum grænser anvendes og giver yderligere indsigt i mikrografer, indsigt, som fjerner observation bias. Den detaljerede protokol er designet til både latente og lytiske celler inficeret med Kaposis sarkom-associeret herpes virus (KSHV) og kan bruges med ikke-inficerede celler eller celler inficeret med andre herpesvira5. Metoderne til kvantitation gælder for undersøgelser af nukleocytoplasmiske forskydninger eller udflytning mellem subcellulære rum i de fleste celler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den protokol, der er beskrevet i denne rapport, kan tilpasses til forskellige celletyper og omfatter trin for dobbelt RNA-fisk og RNA-fisk med ved brug af både monoklonale og polyklonale primære antistoffer. Selvom forberedte slides typisk er afbildet med et konfokalt mikroskop, kan billeddannelse udføres med et STED (stimuleret udlednings udtynding) mikroskop efter ændringer af øget antistofkoncentration og et andet monterings medium. For øget analyse af individuelle celler, kan prøver udarbejdet med denne protok…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Jonathan Rodenfels, Kazimierz Tycowski og Johanna B. Withers for rådgivning om dataanalyse. Vi takker også G. Hayward for anti-SSB antistof. Dette arbejde blev støttet af tilskud T32GM007223 og T32AI055403 fra National Institutes of Health (to TKV) og NIH Grant (CA16038) (til JAS). JAS er undersøger af Howard Hughes Medical Institute. Figur 1-3 og tabel 1 blev gengivet med tilladelse fra American Society for Microbiology under en Creative Commons Attribution-licens fra følgende publikation: Vallery, T. K., Withers, J. B., Andoh, J. A., Steitz, J. A. Kaposis sarkom-associeret Herpes virus mRNA ophobning i nukleare Foci er påvirket af viral DNA-replikation og viral Noncoding Polyadenyleret nukleare RNA. Tidsskrift for virologi. 92 (13), Doi: 10.1128/jvi. 00220-18, (2018).
Materials
| AlexaFluor594-5-dUTP | Life Technologies | C1100 | |
| anti-DIG FITC | Jackson Lab Immunologicals | 200-092-156 | |
| Anti-Rabbit Secondary AlexaFluor594 Monoclonal Antibody | Invitrogen | A-11037 | Goat |
| Anti-SSB Antibody | N/A | N/A | Ref. Chiou et al. 2002 |
| BLASTn | NIH NCBI | N/A | Free Sequence Alignment Software |
| Dextran Sulfate | Sigma Aldrich | D8906 | Molecular Biology Grade |
| DIG-Oligonucleotide Tailing Kit | Sigma Roche | #03353583910 | 2nd Gen |
| Eight-Chamber Slides | Nunc Lab Tek II | #154453 | Blue seal promotes surface tension but separation by clear gel is also available. |
| Formamide | Sigma Aldrich | F9037 | Molecular Biology Grade |
| GAPDH Probes | Stellaris | SMF-2019-1 | Compatible with protocol, Quasar 670 |
| ImageJ | NIH, Bethesda, MD | N/A | Free Image Analysis Software, [http:rsb.info.nih.gov/ij/] |
| OligoAnalyzer | IDT | N/A | Free Oligonucleotide Analyzer |
| pcDNA3 | Invitrogen | A-150228 | |
| pmaxGFP | Amaxa | VDF-1012 | |
| Poly L-Lysine | Sigma Aldrich | P8920 | |
| Terminal Transferase | Sigma Roche | #003333574001 | |
| Vanadyl Ribonucleoside Complexes | NEB | S1402S | |
| Vectashield | Vector Laboratories, Inc. | H-1000 | DAPI within the mounting media scatters the light and reduces contrast. |
References
- Amen, M. A., Griffiths, A. Packaging of Non-Coding RNAs into Herpesvirus Virions: Comparisons to Coding RNAs. Frontiers in Genetics. 2, 81 (2011).
- Schmid, M., Speiseder, T., Dobner, T., Gonzalez, R. A. DNA virus replication compartments. Journal of Virology. 88 (3), 1404-1420 (2014).
- Pawlicki, J. M., Steitz, J. A. Primary microRNA transcript retention at sites of transcription leads to enhanced microRNA production. Journal of Cell Biology. 182 (1), 61-76 (2008).
- Borah, S., Darricarrere, N., Darnell, A., Myoung, J., Steitz, J. A. A viral nuclear noncoding RNA binds re-localized poly(A) binding protein and is required for late KSHV gene expression. Public Library of Science Pathogens. 7 (10), e1002300 (2011).
- Tycowski, K. T., Shu, M. D., Borah, S., Shi, M., Steitz, J. A. Conservation of a triple-helix-forming RNA stability element in noncoding and genomic RNAs of diverse viruses. Cell Reports. 2 (1), 26-32 (2012).
- Weinberg, R. A., Penman, S. Small molecular weight monodisperse nuclear RNA. Journal of Molecular Biology. 38 (3), 289-304 (1968).
- Myoung, J., Ganem, D. Generation of a doxycycline-inducible KSHV producer cell line of endothelial origin: maintenance of tight latency with efficient reactivation upon induction. Journal of Virology Methods. 174 (1-2), 12-21 (2011).
- Brulois, K. F., et al. Construction and manipulation of a new Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus bacterial artificial chromosome clone. Journal of Virology. 86 (18), 9708-9720 (2012).
- Sturzl, M., Gaus, D., Dirks, W. G., Ganem, D., Jochmann, R. Kaposi’s sarcoma-derived cell line SLK is not of endothelial origin, but is a contaminant from a known renal carcinoma cell line. International Journal of Cancer. 132 (8), 1954-1958 (2013).
- Chiou, C. J., et al. Patterns of gene expression and a transactivation function exhibited by the vGCR (ORF74) chemokine receptor protein of Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus. Journal of Virology. 76 (7), 3421-3439 (2002).
- Cole, R. W., Jinadasa, T., Brown, C. M. Measuring and interpreting point spread functions to determine confocal microscope resolution and ensure quality control. Nature Protocols. 6 (12), 1929-1941 (2011).
- Nakamura, H., et al. Global changes in Kaposi’s sarcoma-associated virus gene expression patterns following expression of a tetracycline-inducible Rta transactivator. Journal of Virology. 77 (7), 4205-4220 (2003).
- Majerciak, V., Yamanegi, K., Zheng, Z. M. Gene structure and expression of Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus ORF56, ORF57, ORF58, and ORF59. Journal of Virology. 80 (24), 11968-11981 (2006).
- Sun, R., Lin, S. F., Gradoville, L., Miller, G. Polyadenylylated nuclear RNA encoded by Kaposi sarcoma-associated herpesvirus. Proceedings of the National Academy Sciences U S A. 93 (21), 11883-11888 (1996).
- Vallery, T. K., Withers, J. B., Andoh, J. A., Steitz, J. A. Kaposi’s Sarcoma-Associated Herpesvirus mRNA Accumulation in Nuclear Foci Is Influenced by Viral DNA Replication and Viral Noncoding Polyadenylated Nuclear RNA. Journal of Virology. 92 (13), (2018).
- Borah, S., Nichols, L. A., Hassman, L. M., Kedes, D. H., Steitz, J. A. Tracking expression and subcellular localization of RNA and protein species using high-throughput single cell imaging flow cytometry. RNA. 18 (8), 1573-1579 (2012).
- Bruce, A. G., et al. Quantitative Analysis of the KSHV Transcriptome Following Primary Infection of Blood and Lymphatic Endothelial Cells. Pathogens. 6 (1), (2017).
- Chen, C. P., et al. Kaposi’s Sarcoma-Associated Herpesvirus Hijacks RNA Polymerase II To Create a Viral Transcriptional Factory. Journal of Virology. 91 (11), (2017).
