Kwantitatieve fluorescentie in situ-hybridisatie (vis) en immunofluorescentie (indien) van specifieke genproducten in KSHV-geïnfecteerde cellen
Summary
We beschrijven een protocol met behulp van fluorescentie in situ hybridisatie (vissen) om meerdere herpes virale Rna’s binnen lytisch geïnfecteerde menselijke cellen te visualiseren, hetzij in suspensie of aanhanger. Dit protocol omvat de kwantificering van fluorescentie die een nucleocytoplasmische verhouding produceert en kan worden uitgebreid voor gelijktijdige visualisatie van gastheer en virale eiwitten met immunofluorescentie (IF).
Abstract
Mechanistisch inzicht komt van zorgvuldige studie en kwantificering van specifieke Rna’s en eiwitten. De relatieve locaties van deze biomoleculen in de cel op specifieke tijdstippen kunnen worden opgevangen met fluorescentie in situ hybridisatie (vissen) en immunofluorescentie (if). Tijdens lytische herpesvirus infectie, het virus kaapt de host cel bij voorkeur Express virale genen, waardoor veranderingen in celmorfologie en gedrag van biomoleules. Lytische activiteiten zijn gecentreerd in nucleaire fabrieken, genaamd virale replicatie compartimenten, die alleen met vis kunnen worden onderscheiden en als. Hier beschrijven we een aanpasbaar Protocol van RNA vis en als technieken voor Kaposi van sarcoom-geassocieerde herpesvirus (KSHV)-geïnfecteerde cellen, zowel aanhandig en in suspensie. De methode omvat stappen voor de ontwikkeling van specifieke anti-Sense oligonucleotiden, dubbel RNA vis, RNA vis met IF, en kwantitatieve berekeningen van fluorescentie intensiteiten. Dit protocol is met succes toegepast op meerdere celtypen, niet-geïnfecteerde cellen, latente cellen, lytische cellen, tijd-cursussen, en cellen behandeld met remmers voor het analyseren van de spatiotemporele activiteiten van specifieke Rna’s en eiwitten van zowel de menselijke gastheer en KSHV.
Introduction
In hun lytische (actieve) fase, herpesvirussen kapen de gastheer cel, waardoor veranderingen in celmorfologie en lokalisatie van biologische moleculen, voor de productie van virionen. De basis van operaties is de Nucleus, waar het dubbel gestrande DNA-virale genoom wordt gerepliceerd en verpakt in een eiwit schil, genaamd een capside1. Om te beginnen, het virus drukt zijn eigen eiwitten, kaping host machines en het voorkomen van expressie van niet-essentiële gastheer genen, een proces genaamd de host uitschakeling effect. De meerderheid van deze activiteit is gelokaliseerd in specifieke 4 ′, 6-diamidino-2-fenylindole (DAPI)-vrije nucleaire gebieden genaamd virale replicatie compartimenten, bestaande uit zowel gastheer en virale eiwitten, Rna’s, en virale DNA2. De cel wordt gereviseerd om ruimte en middelen te bieden voor de replicatie compartimenten en daarmee het samenstellen van virale capsid’s. Zodra de capside de Nucleus verlaat, is het onduidelijk hoe de capside in het cytoplasma is omhuld om een virale deeltje met membraan gebonden te produceren, ook bekend als een virion. Inzicht in de lokalisatie en ruimtelijke verschuivingen van zowel gastheer en virale biomoleules tijdens de lytische fase biedt dieper mechanistisch inzicht in de opstelling van het replicatie compartiment, host-afsluit effect, de virion-egress-route en andere processen in verband met herpes virale infectie en replicatie.
Momenteel is de beste methode om deze veranderingen te detecteren en te bestuderen de visualisatie van eiwitten en Rna’s in geïnfecteerde cellen met immunofluorescentie (IF) en fluorescerende in-situ hybridisatie (FISH), respectievelijk. Gebruik van een tijd-cursus met deze technieken onthult de lokalisatie van biomoleules op belangrijke punten van de lytische fase of eenvoudigweg, spatiotemporele gegevens. VIS en als aanvulling op andere biochemische technieken, zoals remming van een cellulair proces (bv. remming van virale DNA-replicatie), RT-qPCR (real-time polymerase kettingreactie), RNA-sequencing, noordelijke blots, massaspectrometrie, Western blotting, en analyse van virale DNA-productie, dat kan een meer globaal beeld van cellulaire activiteiten te bieden.
We ontwikkelden RNA-VISSTRATEGIEËN om de RNA-producten van specifieke genen te onderzoeken en een computationele analyse die de nucleocytoplasmische ratio van een specifiek genproduct kwantitatief berekent. De monstervoorbereiding, aangepast uit eerdere publicaties van Steitz en collega’s3,4, is relatief eenvoudig en kan worden gebruikt voor zowel aanhandige als hangende cellen. Het protocol is ook aanpasbaar voor gelijktijdig gebruik van meerdere RNA visstrategieën (dubbel RNA vis) of RNA vis met IF-strategieën. Ontwikkeling van een specifieke VISSTRATEGIE is uitdagend, maar suggesties om succes te verbeteren worden geschetst. De hier beschreven gegevensanalyse is kwantitatief als fluorescerende kralen en sterke markeringen van compartiment grenzen worden gebruikt en biedt aanvullend inzicht in de micro grafieken, inzicht dat observatie bias verwijdert. Het gedetailleerde protocol is ontworpen voor zowel latent en lytische cellen geïnfecteerd door Kaposi Sarcoma-geassocieerde herpesvirus (KSHV) en kan worden gebruikt met niet-geïnfecteerde cellen of cellen geïnfecteerd door andere herpesvirussen5. De methoden van kwantatie zijn van toepassing op studies over nucleocytoplasmische verschuivingen of verplaatsing tussen subcellulaire compartimenten in de meeste cellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het protocol dat in dit rapport wordt beschreven, kan worden aangepast aan verschillende celtypen en bevat stappen voor dubbele RNA-vissen en RNA-vissen met als gebruik wordt gemaakt van zowel monoklonaal als polyklonale primaire antilichamen. Hoewel geprepareerde dia’s meestal worden afgebeeld met een confocale Microscoop, kan Imaging worden uitgevoerd met een gested (gestimuleerde emissie depletie) Microscoop na wijzigingen van verhoogde antilichaam concentratie en een ander afdekmedium. Voor een betere analyse van afz…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We bedanken Jonathan Roden Fels, Kazimierz Tycowski en Johanna B. Withers voor advies over data-analyse. We danken ook G. Hayward voor het anti-SSB-antilichaam. Dit werk werd gesteund door Grants T32GM007223 en T32AI055403 van de National Institutes of Health (to TKV) en NIH Grant (CA16038) (to JAS). JAS is onderzoeker van het Howard Hughes Medical Institute. Figuren 1-3 en tabel 1 werden gereproduceerd met toestemming van de American Society for Microbiology onder een Creative Commons Attribution License uit de volgende publicatie: Vallery, T. K., Withers, J. B., Andoh, J. A., Steitz, J. A. Kaposi Sarcoma-geassocieerde Herpesvirus mRNA accumulatie in nucleaire Foci wordt beïnvloed door virale DNA-replicatie en virale Noncoding Polyadenyleerd nucleair RNA. Journal of virologie. 92 (13), DOI: 10.1128/jvi. 00220-18, (2018).
Materials
| AlexaFluor594-5-dUTP | Life Technologies | C1100 | |
| anti-DIG FITC | Jackson Lab Immunologicals | 200-092-156 | |
| Anti-Rabbit Secondary AlexaFluor594 Monoclonal Antibody | Invitrogen | A-11037 | Goat |
| Anti-SSB Antibody | N/A | N/A | Ref. Chiou et al. 2002 |
| BLASTn | NIH NCBI | N/A | Free Sequence Alignment Software |
| Dextran Sulfate | Sigma Aldrich | D8906 | Molecular Biology Grade |
| DIG-Oligonucleotide Tailing Kit | Sigma Roche | #03353583910 | 2nd Gen |
| Eight-Chamber Slides | Nunc Lab Tek II | #154453 | Blue seal promotes surface tension but separation by clear gel is also available. |
| Formamide | Sigma Aldrich | F9037 | Molecular Biology Grade |
| GAPDH Probes | Stellaris | SMF-2019-1 | Compatible with protocol, Quasar 670 |
| ImageJ | NIH, Bethesda, MD | N/A | Free Image Analysis Software, [http:rsb.info.nih.gov/ij/] |
| OligoAnalyzer | IDT | N/A | Free Oligonucleotide Analyzer |
| pcDNA3 | Invitrogen | A-150228 | |
| pmaxGFP | Amaxa | VDF-1012 | |
| Poly L-Lysine | Sigma Aldrich | P8920 | |
| Terminal Transferase | Sigma Roche | #003333574001 | |
| Vanadyl Ribonucleoside Complexes | NEB | S1402S | |
| Vectashield | Vector Laboratories, Inc. | H-1000 | DAPI within the mounting media scatters the light and reduces contrast. |
References
- Amen, M. A., Griffiths, A. Packaging of Non-Coding RNAs into Herpesvirus Virions: Comparisons to Coding RNAs. Frontiers in Genetics. 2, 81 (2011).
- Schmid, M., Speiseder, T., Dobner, T., Gonzalez, R. A. DNA virus replication compartments. Journal of Virology. 88 (3), 1404-1420 (2014).
- Pawlicki, J. M., Steitz, J. A. Primary microRNA transcript retention at sites of transcription leads to enhanced microRNA production. Journal of Cell Biology. 182 (1), 61-76 (2008).
- Borah, S., Darricarrere, N., Darnell, A., Myoung, J., Steitz, J. A. A viral nuclear noncoding RNA binds re-localized poly(A) binding protein and is required for late KSHV gene expression. Public Library of Science Pathogens. 7 (10), e1002300 (2011).
- Tycowski, K. T., Shu, M. D., Borah, S., Shi, M., Steitz, J. A. Conservation of a triple-helix-forming RNA stability element in noncoding and genomic RNAs of diverse viruses. Cell Reports. 2 (1), 26-32 (2012).
- Weinberg, R. A., Penman, S. Small molecular weight monodisperse nuclear RNA. Journal of Molecular Biology. 38 (3), 289-304 (1968).
- Myoung, J., Ganem, D. Generation of a doxycycline-inducible KSHV producer cell line of endothelial origin: maintenance of tight latency with efficient reactivation upon induction. Journal of Virology Methods. 174 (1-2), 12-21 (2011).
- Brulois, K. F., et al. Construction and manipulation of a new Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus bacterial artificial chromosome clone. Journal of Virology. 86 (18), 9708-9720 (2012).
- Sturzl, M., Gaus, D., Dirks, W. G., Ganem, D., Jochmann, R. Kaposi’s sarcoma-derived cell line SLK is not of endothelial origin, but is a contaminant from a known renal carcinoma cell line. International Journal of Cancer. 132 (8), 1954-1958 (2013).
- Chiou, C. J., et al. Patterns of gene expression and a transactivation function exhibited by the vGCR (ORF74) chemokine receptor protein of Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus. Journal of Virology. 76 (7), 3421-3439 (2002).
- Cole, R. W., Jinadasa, T., Brown, C. M. Measuring and interpreting point spread functions to determine confocal microscope resolution and ensure quality control. Nature Protocols. 6 (12), 1929-1941 (2011).
- Nakamura, H., et al. Global changes in Kaposi’s sarcoma-associated virus gene expression patterns following expression of a tetracycline-inducible Rta transactivator. Journal of Virology. 77 (7), 4205-4220 (2003).
- Majerciak, V., Yamanegi, K., Zheng, Z. M. Gene structure and expression of Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus ORF56, ORF57, ORF58, and ORF59. Journal of Virology. 80 (24), 11968-11981 (2006).
- Sun, R., Lin, S. F., Gradoville, L., Miller, G. Polyadenylylated nuclear RNA encoded by Kaposi sarcoma-associated herpesvirus. Proceedings of the National Academy Sciences U S A. 93 (21), 11883-11888 (1996).
- Vallery, T. K., Withers, J. B., Andoh, J. A., Steitz, J. A. Kaposi’s Sarcoma-Associated Herpesvirus mRNA Accumulation in Nuclear Foci Is Influenced by Viral DNA Replication and Viral Noncoding Polyadenylated Nuclear RNA. Journal of Virology. 92 (13), (2018).
- Borah, S., Nichols, L. A., Hassman, L. M., Kedes, D. H., Steitz, J. A. Tracking expression and subcellular localization of RNA and protein species using high-throughput single cell imaging flow cytometry. RNA. 18 (8), 1573-1579 (2012).
- Bruce, A. G., et al. Quantitative Analysis of the KSHV Transcriptome Following Primary Infection of Blood and Lymphatic Endothelial Cells. Pathogens. 6 (1), (2017).
- Chen, C. P., et al. Kaposi’s Sarcoma-Associated Herpesvirus Hijacks RNA Polymerase II To Create a Viral Transcriptional Factory. Journal of Virology. 91 (11), (2017).
